专利名称：肝功能改善剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有乳铁蛋白作为有效成分的肝功能改善剂。更具体地说，本发明涉及含有金属非饱和乳铁蛋白、金属饱和乳铁蛋白或阿朴乳铁蛋白(下文将这些化合物统称为乳铁蛋白类)和/或乳铁蛋白类的水解产物作为有效成分的肝功能改善剂。
背景技术：
有各种不同的原因会导致肝功能降低，在某些情况下还可能导致死亡。肝功能的检查通常是通过测定血浆中下述各种项目来实施，这些项目包括谷草转氨酶(glutamate oxaloacetate transaminase，下文简称为GOT)、谷丙转氨酶(glutamate pyruvate transaminase，下文简称为GPT)、碱性磷酸酶(下文简称为ALP)、总胆红素、白蛋白、总胆固醇。过去，作为针对肝功能低下的治疗药剂，只不过是使用小柴胡汤、Stronger Neo-Minophagen C(下文简称SNMC)、熊去氧胆酸等。在这些治疗药剂中，每一种药剂的有效性都较低，并有腹泻、恶心、呕吐等副作用，难以维持长期用药。
直至最近，作为肝病治疗剂，已知的有高支链氨基酸制剂(渡边明治、冲田美佐子著《肝病与治疗营养》，第一版，1992年)、低聚半乳糖与食物纤维(特开平3-151854号公报)、乳果糖及乳糖醇(日本临床，第52卷，第1期，第100～118页，1994年；临床医药，第11卷，第7期，第1439～1473页，1995年)、棉子糖(特开平10-179087号公报)、应力蛋白质(Stress protein)的抗体(特许第2775576号)等。
另一方面，乳铁蛋白是一种在泪液、唾液、末梢血、乳汁等中含有的无害而且是天然的铁结合蛋白质(每一分子可以结合两个铁离子)，其中，牛乳铁蛋白的分子量为86,000，人乳铁蛋白的分子量为88,000(今堀和友、山川民夫监编，《生化学辞典》，第2版，第1390页，东京化学同人，1990年)。
已知乳铁蛋白对大肠菌、念珠菌属、梭菌属等的有害微生物具有抗菌作用[儿科学杂志(Journal of Pediatrics)，第94卷，第1页，1997年]。另外还已知，乳铁蛋白能有效地使干燥双叉乳杆菌、乳酸菌等有用细菌定居于人和动物的肠内(特许第2532911号)，并且它是干燥双叉乳杆菌的增殖因子(特开平2-225419号公报)。另外，文献还公开了乳铁蛋白具有如下所述各种各样的用途。
(1)抗菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂特开昭61-83131号公报、特开昭62-249931号公报、特开昭63-56273号公报、特开昭63-284133号公报、特开平1-44273号公报、特开平1-221319号公报、特开平1-233226号公报、特开平2-48534号公报、特开平2-191205号公报、特开平2-233619号公报、特开平3-181421号公报、特开平3-193708号公报、特开平3-220130号公报、特开平6-48956号公报、特开平6-199698号公报、特开平6-256211号公报、特开平6-316529号公报、特开平7-206701号公报、特开平7-316069号公报、特开平9-2970号公报、特开平9-40578号公报、特开平9-165342号公报和特开平10-59865号公报。
(2)造血剂特开昭62-125398号公报、特开昭63-22525号公报、特开平2-6408号公报、特开平3-130060号公报、特开平4-8269号公报、特开平4-141067号公报和特开平4-95100号公报。
(3)皮肤、外用剂特开平1-135726号公报、特开平7-196529号公报、特开平8-59450号公报、特开平8-231462号公报和特开平8-333260号公报。
(4)口腔、牙科剂特开平5-279266号公报、特表平8-506098号公报和特开平8-217693号公报。
(5)眼科用剂WO 92/08477号公报、特开平8-301785号公报和特开平9-30966号公报。
(6)免疫赋活剂、免疫促进剂特开平5-178759号公报、特开平6-32743号公报、特开平6-145068号公报和特表平7-507763号公报。
除此之外，已知的还有抗肿瘤剂(特开昭63-51337号公报)、胃肠管生长促进剂(特开平1-93534号公报)、细菌毒素中和剂(特开平2-207089号公报和特表平5-501416号公报)、抗衰老剂(特开平4-58871号公报和特开平5-124980号公报)、降压剂(特开平4-316598号公报)、抗风湿病药(特开平5-186368号公报)、神经生长因子产生促进剂(特开平5-32557号公报)、消化管细胞赋活化剂(特开平6-48955号公报)、脑保健药(特开平6-172200号公报)、动脉硬化预防剂(特开平6-234655号公报)、粘蛋白产生促进剂(特开平9-12473号公报)、血管新生病治疗药(特开平9-194388号公报)、抗异常腺窝剂(特开平10-25249号公报)、经口癌转移抑制剂(特开平10-59864号公报)、内毒素诱发性疾病治疗药(特开平10-114675号公报)、胃肠障碍预防和/或治疗药(特开平10-130164号公报)等。
然而，乳铁蛋白对肝功能的改善有效这一事过去并未被人们所知，在文献上也没有记载。
发明内容
本发明的目的是提供一种几乎没有副作用的肝功能改善剂。
本发明是一种含有乳铁蛋白和/或乳铁蛋白的水解产物作为有效成分的肝功能改善剂。
本发明的肝功能改善剂的优选方案是其中的乳铁蛋白是选自金属非饱和乳铁蛋白、金属饱和乳铁蛋白和阿朴乳铁蛋白中的1种或2种以上的混合物。
本发明者们对迄今为止尚未被人们所知的乳铁蛋白的新用途进行了深入的研究，在研究的过程中发现，通过投与乳铁蛋白，可以使已降低了的肝功能获得改善。本发明者们对这一结果进行了动物实验，以科学的方法证明了乳铁蛋白能有效地改善肝功能，至此便完成了本发明。
本发明的肝功能改善剂是一种能够显著改善肝功能的药物，作为其有效成分的乳铁蛋白存在于牛奶等食物中，是一种被人们日常摄取的蛋白质或其水解产物，因此即使长期连续摄取也几乎没有副作用。另外，本发明的肝功能改善剂通过与其他肝病治疗药(例如干扰素、SNMC等)合并使用，还可以减少这些治疗药的投药量。
用于实施发明的最佳方案作为本发明的有效成分使用的乳铁蛋白可以是市售品，也可以是按下述方法获得的制品，例如，用离子交换色谱法等常规方法从哺乳类(例如人、牛、水牛、马、山羊、绵羊等)的初乳、过渡期乳、常乳、末期乳等、这些处理物的脱脂乳、乳清等乳品中分离获得的乳铁蛋白、按常规方法从乳铁蛋白中除去铁后的阿朴乳铁蛋白、将阿朴乳铁蛋白中的铁、铜、锌、锰等金属元素螯合一部分或全部后获得的金属非饱和乳铁蛋白或金属饱和乳铁蛋白。
虽然不能大量地制造天然的人乳铁蛋白，但是利用按DNA重组技术获得的重组真菌、重组乳牛(转基因牛)等来生产的人乳铁蛋白也适用于本发明。
作为本发明有效成分使用的乳铁蛋白类的水解产物可以通过将上述乳铁蛋白类用酸或酶促使其进行水解反应来制造。具体的方法如下。
利用酸的水解方法是，首先将乳铁蛋白类按0.1～20％(如无特别注明，皆是指重量％)，优选5～15％的浓度溶解于水、蒸馏水等中，向所获的溶液中添加酸(例如盐酸、磷酸等无机酸，柠檬酸等有机酸)，将溶液的pH值调节至1～4，然后在预定温度下保持预定的时间以使其进行水解反应。更具体地说，在pH调节至1～2的情况下，在80～130℃，优选在90～120℃的温度下保持1～120分钟，另外，在pH调节至2～4的情况下，在80～130℃，优选在100～120℃的温度下保持1～120分钟，以使其进行水解反应。然后将反应液冷却，也可以根据需要，对其进行中和、脱盐和脱色处理。
利用酶的水解方法是，将乳铁蛋白类按0.5～20％，优选5～15％的浓度溶解于无菌水、蒸馏水等中，将该水溶液的酸度调节至适合于水解用的酶起作用的pH值，然后向其中添加酶，将温度保持在适合于酶起作用的温度以进行水解反应。对所用的酶没有特别限制，可以直接使用市售品，例如耐酸性蛋白酶(商标，盛进制药社制，适宜pH2.5～3.0)、猪胃蛋白酶(和光纯药工业社制，适宜pH2～3)、SMITIMAP(商标，新日本化学社制，适宜pH3.0)、AMANOM(商标，天野制药社制，适宜pH7.0)、胰蛋白酶(NOBO社制，适宜pH8.0)等内肽酶，可以将它们单独使用或按任意组合使用。
另外，也可以将这些酶与从例如按特公昭48-43878号公报记载的方法制得的乳酸菌中提取的外肽酶或含有肽酶的市售松木油酶(田边制药社制)组合使用。这些酶相对于基质的使用量在0.1～5.0％的范围内，特别优选在0.5～30％的范围内。
利用酶的水解反应在15～55℃，优选在30～50℃的温度下进行，保持时间为30～600分钟，优选60～300分钟。然后将该反应液直接地或者在将其中和后，按常规方法将酶加热失活，根据需要进行脱色处理，从而获得水解产物。
以上述乳铁蛋白和/或其水解产物作为有效成分的本发明的肝功能改善剂可以用公知的方法制成各种形式的制剂，作为经口的药物。作为具体的剂型，可以举出片剂(包括糖衣片、包衣片、含片)、散剂、胶囊剂(包括软胶囊)、颗粒剂(包括带包衣的颗粒)、丸剂、锭剂、液剂或者它们在制剂学上允许的缓释制剂等。
上述的制剂可以按公知的制剂学的制法与药理学上允许用于制剂的载体、赋形剂、崩解剂、润滑剂、着色剂等一起作为医药组合物制成制剂。作为适用于这些制剂中的载体及赋形剂，可以作为例子举出乳糖、葡萄糖、白糖、甘露糖醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、结晶纤维素、甘草粉、龙胆粉等。作为粘合剂，可以作为例子举出淀粉、明胶、糖浆、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素等。
作为崩解剂，可以作为例子举出淀粉、琼脂、明胶粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、藻酸钠等。
作为润滑剂，可以作为例子举出硬脂酸镁、加氢植物油、聚乙二醇等。作为着色剂，例如有允许向医药品中添加的红色2号、黄色2号、蓝色1号等。
片剂和颗粒剂可以根据需要使用下述物质进行包衣白糖、羟丙基纤维素、精制虫胶、明胶、山梨糖醇、甘油、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、苯二甲酸纤维素乙酸酯、羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸聚合物等。
本发明的肝功能改善剂在每1g药剂中至少含有1mg作为有效成分的乳铁蛋白或其分解物，投药量应根据年龄、症状等的不同而异，但是对于人，应按每1Kg体重至少1mg的比例经口投药，优选按每天20mg～15g的用量投药。
另外，本发明的肝功能改善剂由于其有效成分来自乳类，因此其安全性好，并且通过与其他肝病治疗药例如干扰素，SNMC等合用而能减少这些药物的服用量，并能期望获得改善肝功能的协同效果。
下面举出试验体来详细地说明本发明。
试验例1该试验例的目的是调查乳铁蛋白及其水解产物的肝功能改善效果。
1．试验动物和试验样品1.1 动物将30只体重约200g的Wistar系雄性大鼠(从日本チャ-ルスリバ-购得)随机地分成5组，每组6只，让其自由采食固体饲料(船桥农场制)和水，如此饲养一周时间。
1.2 试验样品的制备作为乳铁蛋白，直接使用市售品(森永乳业社制)；作为乳铁蛋白的水解产物，使用按照与参考例1同样的方法制得的产物。
2．试验方法2.1 对照组从上述5组大鼠中随机地选择一组，根据玉田等人的方法(《肝脏》，第28卷，第7期，第39页，1987年)按如下步骤制备出慢性肝障碍模型大鼠。将四氯化碳(和光纯药工业社制)按50％的浓度溶解于橄榄油(日本药典)中，将此溶液按每1Kg动物体重1.0ml溶液(四氯化碳占0.5ml)的比例每周进行2次皮下注射，连续进行9周的试验。
2.2 试验组以其余4组大鼠作为对照组，对其进行同样的处理，但是从开始投与四氯化碳溶液后的第6周开始，按表1所示的投药量(500mg/Kg/天或250mg/Kg/天)向大鼠经口投与乳铁蛋白或其水解产物溶解于蒸馏水中制得的溶液，在3周内连续每天投药。
2.3 肝功能试验在结束投与试验样品4天之后，在乙醚麻醉下从腹部大静脉采血，用自动化学分析装置(东芝MEDICAL社制，TBA-380)测定血清中的GOT、GPT和ALP，求出各组的平均值。
3．试验结果表1中示出了乳铁蛋白对四氯化碳诱发慢性肝障碍模型的效果。与对照组相比，乳铁蛋白投与组的GOT、GPT和ALP显示出低的数值，因此可以认为它具有高的肝功能改善效果。另外，乳铁蛋白水解产物的效果虽然比乳铁蛋白略差，但仍可以看出明显的肝功能改善效果。
另外，还通过改变乳铁蛋白及其水解产物的种类进行了试验，结果获得了几乎相同的结果。
表1
(注)LF表示乳铁蛋白。
试验例2
该试验的目的是调查乳铁蛋白及其水解产物对急性肝障碍的治疗效果。
1．试验动物及试验样品使用与试验例1同样的各组试验动物和试验样品。
2．试验方法将四氯化碳(和光纯药工业社制)按20％(体积)的比例溶解于橄榄油(日本药典)中，将此溶液按每1Kg动物体重1.5ml溶液(四氯化碳占0.3ml)的比例一次注射入大鼠的腹腔内，然后，在投与四氯化碳之后第2天起连续5天每天按照表2所示用量(600mg/Kg/天或350mg/Kg/天)的乳铁蛋白或其水解产物向大鼠经口投药，除此之外，其余按照与试验例1同样的方法进行试验。
3．试验结果表2示出了乳铁蛋白及其水解产物对四氯化碳诱发的急性肝障碍模型所起的效果。与对照组相比，乳铁蛋白投与组的GOT、GPT和ALP显示出低的数值，因此可以认为它具有高的肝功能改善效果。另外还可看出，乳铁蛋白水解产物的效果也几乎与乳铁蛋白相同。
另外，还通过改变乳铁蛋白及其水解产物的种类进行了试验，获得了几乎相同的结果。
表2
(注)LF表示乳铁蛋白。
参考例1按照特许第2130919号的公告公报(特公平6-13560号)记载的如下方法由人乳制造人乳铁蛋白。
将CM-交联葡聚糖凝胶-50(Pharmacia社制)10g用水浸泡以使其溶胀，如此配制成Na型离子交换体200ml，将其与脱脂人乳(pH6.7)10升混合，在4℃下搅拌16小时，然后将其过滤以分离出离子交换体。用1.6％的氯化钠溶液2升洗涤分离出的离子交换体以除去其中的杂质，然后添加5.0％的氯化钠溶液1升洗脱被离子交换体吸附的成分，获得回收液1.1升。
将所获的回收液进行透析以除去其中的氯化钠，冻结干燥，获得了人乳铁蛋白粉末约12g。所获的人乳铁蛋白的组成为水分2.8％、乳铁蛋白96.3％、灰分0.5％。
参考例2将市售的牛乳铁蛋白(森永乳业社制)500g溶解于蒸馏水9升中，用0.1当量的盐酸将其pH值调节至2.5，向其中添加市售的猪胃蛋白酶(Sigma社制)10g，在37℃下进行水解反应6小时。然后用0.1当量的氢氧化钠水溶液将其pH调节至7.0，在75℃下加热处理10分钟以使酶失活，然后将其冷却至室温，按15,000rpm的转速离心分离30分钟，将所获的上清液按常规方法进行冻结干燥，获得了牛乳铁蛋白水解产物420g。
下面示出实施例以更详细地说明本发明，但本发明不受以下实施例的限定。
实施例1配合有牛乳铁蛋白的片剂的制备按照下述方法制造具有下述组成的片剂形式的肝功能改善剂。
成分 含量(％)牛乳铁蛋白(森永乳业社制) 18.0乳糖(森永乳业社制) 18.5玉米淀粉(日清制粉社制) 52.7硬脂酸镁(太平化学产业社制) 1.4羧甲基纤维素钙(五德药品社制) 9.4向牛乳铁蛋白、乳糖、玉米淀粉和羧甲基纤维素钙的混合物中一边添加适量水，一边混炼均匀，在50℃下干燥3小时，然后向所获的干燥物中添加硬脂酸镁，混合均匀，按常规方法压片，获得所需的片剂。
实施例2配合有牛乳铁蛋白的糖浆剂的制备成分 含量(％)牛乳铁蛋白(MIRAI社制) 8.0果糖葡萄糖糖浆(参松工业社制)12.4柠檬酸(上野制药社制)0.2柠檬酸钠(丸善制药社制) 0.2羧甲基纤维素钙(五德药品社制)0.2蒸馏水(大塚制药社制)79.0将各成分混合，按常规方法制造糖浆剂。
实施例3牛乳铁蛋白胶囊剂的制备将乳糖(和光纯药工业社制)600g、玉米淀粉(日清制粉社制)400g、结晶纤维素(和光纯药工业社制)400g和牛乳铁蛋白(MIRAI社制)600g用50目的筛子(大和科学社制)过筛，将筛下物装入一个厚度0.5mm的聚乙烯袋中，将袋子来回翻转以使物料混合均匀，用一台全自动胶囊填充机(Cesere Pedini公司制，加压式)将上述粉末按每个胶囊275mg内容物的比例填充入胶囊(日本ELANCO社制，1号胶囊，壳体颜色OP.黄6号，空壳重75mg)中，获得了每个胶囊含乳铁蛋白82mg的胶囊剂7,000个。
实施例4人乳铁蛋白散剂的制备把预先通过了6号筛(井内盛荣堂社制)的人乳铁蛋白粉末(按照与参考例1相同的方法制造)10g和乳糖(森永乳业社制)50g在乳罐中混匀，然后向其中加入预先通过了5号筛(井内盛荣堂社制)的乳糖(森永乳业社制)40g，混合均匀，将其全量再次通过5号筛，用分包机(东京商会，OMP-90A)按照每包5g的比例分装，获得了10％人乳铁蛋白散剂20包。
实施例5配合有牛乳铁蛋白水解产物的片剂的制备成分 含量(％)牛乳铁蛋白水解产物 16.5(按照与参考例2相同的方法制造)
乳糖(森永乳业社制) 18.5马铃薯淀粉(关东化学社制)54.2硬脂酸镁(日本油脂社制) 1.4羧甲基纤维素钙(五德药品社制)9.4向牛乳铁蛋白、乳糖、马铃薯淀粉和羧甲基纤维素钙的混合物中一边添加适量灭菌蒸馏水，一边混炼均匀，在55℃下干燥2小时，向所获的干燥物中添加硬脂酸镁，混合均匀，按常规方法压片，获得了片剂。
实施例6配合有牛乳铁蛋白水解产物的糖浆剂的制备成分 含量(％)牛乳铁蛋白水解产物6.5(按照与参考例2相同的方法制造)果糖葡萄糖糖浆(参松工业社制) 14.0柠檬酸(田边制药社制) 0.2柠檬酸钠(岩城制药社制)0.2羧甲基纤维素钙(五德药品社制) 0.2蒸馏水(扶桑药品工业社制) 78.9将各成分混合均匀，按常规方法制成糖浆剂。
工业实用性本发明的肝功能改善剂可作为用于改善肝功能障碍患者的肝功能的药剂使用。另外，通过将本发明的肝功能改善剂与干扰素、SNMC等肝病治疗剂并用，可以减少这些治疗剂的投药量。
权利要求
1．一种肝功能改善剂，它含有乳铁蛋白和/或乳铁蛋白的水解产物作为有效成分。
2．如权利要求1所述的肝功能改善剂，其中所说的乳铁蛋白是选自金属非饱和乳铁蛋白、金属饱和乳铁蛋白和阿朴乳铁蛋白中的1种或2种以上的混合物。
全文摘要
含有乳铁蛋白和/或其水解产物作为有效成分的没有副作用的肝功能改善剂。
文档编号A61K38/40GK1316909SQ99810639
公开日2001年10月10日 申请日期1999年7月27日 优先权日1998年7月30日
发明者富田守, 岛村诚一, 樋田知宏 申请人:森永乳业株式会社