酸第685位的野生型残基 精氨酸（R) (R685C);苯丙氨酸（F)取代SEQIDN0:1的氨基酸第641位的野生型残基酪 氨酸（Y)(Y641F);组氨酸⑶取代SEQIDN0:1的氨基酸第641位的野生型残基酪氨 酸（Y) (Y641H);天冬酰胺（N)取代SEQIDN0:1的氨基酸第641位的野生型残基酪氨酸 (Y) (Y641N);丝氨酸⑶取代SEQIDN0:1的氨基酸第641位的野生型残基酪氨酸（Y) (Y641S);和半胱氨酸（C)取代SEQIDN0:1的氨基酸第641位的野生型残基酪氨酸（Y) (Y641C)〇
[0020] 本发明的对象包括已被诊断患有癌症或癌前病症、具有癌症或癌前病症的症状或 具有发展癌症或癌前病症的风险的任何人类对象。例如，所述癌症是淋巴瘤、白血病或黑素 瘤。优选地，所述淋巴瘤是非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或弥散性大B细胞淋巴瘤。或 者，所述白血病是慢性骨髓性白血病（CML)。所述癌前病症是骨髓增生异常综合征（MDS，先 前被称作白血病前期）。
[0021] 本发明方法优选的EZH2抑制剂选自表1中所列的化合物。
[0022] 除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普 通技术人员通常所理解的同样含义。在说明书中，单数形式也包含多数形式，除非上下文另 有明确说明。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法 和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利或其它 参考文献均通过引用纳入。本文引用的文献并非承认是所要求权利的发明的在先技术。在 抵触的情况下，以本说明书（包括定义在内）为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明 性，并不意在构成限制。
[0023] 从以下发明详述和所附权利要求书很容易了解本发明的其他特征和优点。
【附图说明】
[0024] 图1的两幅图确定B细胞淋巴瘤相关的EZH2突变型是活性组蛋白甲基转移酶。 (A)使用肽（H321-44)为底物的甲基转移反应，和（B)使用禽类核小体为底物的甲基转移反 应，来检测包含野生型和EZH2的多种Y641突变型的PRC2复合物的体外甲基转移酶活性。 标志：野生型（#)、Y641F(q)、Y641H(q)、Y641N(_)和Y641SUUPM是每分钟的 计数，指3H辐射导致的闪烁计数。
[0025] 图2的四幅图确定包含突变EZH2的PRC2复合物优先催化组蛋白H3-K27的二甲 基化和三甲基化。（A)突变和野生型（WT)复合物对未甲基化肽（空心柱）、单甲基化肽 (散点柱）和二甲基化肽（实心柱）的甲基转移酶活性。（B)包含野生(〇)、Y641F(#)、 Y641H( □ )、Y641N?和Y641S( ▲)型EZH2的PRC2复合物对于所有肽甲基化状态，由 K1/2判断的肽底物亲和度都相似。应注意所有底物和所有酶形式间的K1/2值变化少于3. 5 倍。对于底物的任何特定甲基化状态，1/2值的变化少于2倍。（C)就EZH2的野生型和 Y641突变型而言，酶转换数（keat)以相反的方式随底物甲基化状态而变化。EZH2的野生型 (〇 )的1^_随K27甲基化状态增加而降低，但EZH2的Y641F( ?)、Y641H( □ )、Y641N( ) 和Y641S( ▲)突变型的keat则增加。⑶EZH2的野生型（〇)的催化效率（keat/K1/2)随K27 甲基化状态的增加而减少，但EZH2的Y641F( ? )、Y641H( □ )、Y641N( )和Y641S( ▲) 突变型则增加。在图B-D中，连接数据点的线不旨在提示任何数学关系，而是仅起到视觉辅 助的作用。
[0026] 图3A的三张图显示就包含不同EZH2突变型的细胞而言H3-K27me3(上图）、 H3-K27me2(中图）和H3-K27mel(下图）的预测相对水平。用表2所示的偶联酶稳态速率 方程和所述稳态动力学参数来实施模拟。所有值是相对于包含纯合WTEZH2的细胞，假定 饱和浓度的胞内SAM，相对于Km，且胞内核小体浓度类似Km。
[0027] 图3B是对WTEZH2纯合或对所示EZH2Y641突变杂合的淋巴瘤细胞系的H3-K27 甲基化状态相对模式的一系列Western印迹分析。从顶至底的图描述用对以下物质特异的 抗体探测的结果：总EZH2、H3-K27me3、H3-K27me2、H3-K27mel;总组蛋白H3为加样对照。
[0028] 图4显示选出的对导致癌症中组蛋白H3-K27上异常高水平三甲基化所提出的机 制。这些机制包括：a)EZH2中Y641突变导致底物优先性从无甲基化组蛋白H3-K27转变 至单甲基化和二甲基化组蛋白H3-K27 ;b)EZH2过表达；c)UTX内的突变灭活酶功能，导致 H3-K27me3的去甲基化降低；以及d)PRC2复合物亚基PHF19/PCL3过表达，引起对特定基因 的PRC2复合物的募集增加以及组蛋白H3-K27三甲基化增加。在所有四个模型中，变化导致 基因近端启动子区域中异常的组蛋白H3-K27三甲基化，造成癌症中关键基因的转录抑制。
[0029] 图5的SDS-PAGE胶显示带突变和野生型EZH2的各5组分PRC2复合物的表达水 平相似。
[0030] 图6的一对表格显示突变和野生型（WT)PRC2复合物表现出对含H3-K27的肽的 强底物优先性。针对覆盖全H3和H4的重叠15聚体肽组测试各个酶。以速率（CPM/分 钟）测量活性，而报告值代表各反应的两个独立测定的均值。所有复合物中，最有利的肽是 H3:16-30。对于该肽，WT复合物的活性是其它任何突变复合物的大于6倍。
[0031] 图7显示S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH)对EZH2WT和EZH2的Y641突变型的抑制 效力。X轴显示SAH的log浓度；Y轴显示抑制百分比。
[0032] 图8显示化合物75对EZH2WT和EZH2的Y641突变型的抑制效力。X轴显示化合 物75的log浓度；Y轴显示抑制百分比。
[0033] 图9显示细胞系组中H3-K27mel、me2和me3的相对水平的Western印迹分析，所述 细胞系包括表达WT或Y641突变EZH2的多种DLBCL细胞系。a)从所示细胞系提取组蛋白， 通过SDS-PAGE用4-20%的胶分级分离，转至硝化纤维素膜，并用抗组蛋白H3、H3-K27mel、 me2或me3的抗体探测。
[0034] 图10显示在WT和Y641突变淋巴瘤细胞系组中H3和H3-K27me3水平的免疫细 胞化学分析。固定来自所示细胞系的细胞团并石蜡包埋。制作切片并使用抗组蛋白H3或 H3-K27me3的抗体通过免疫细胞化学评估H3和H3-K27me3的水平。
[0035] 图11显示在WT和Y641突变淋巴瘤细胞系组中H3和H3-K27me2水平的免疫细 胞化学分析。固定来自所示细胞系的细胞团并石蜡包埋。制作切片并使用抗组蛋白H3或 H3-K27me2的抗体通过免疫细胞化学评估H3和H3-K27me2的水平。
[0036] 图12显示在Y641突变WSU-DLCL2细胞中通过EZH2抑制剂处理对总H3-K27me3 水平的抑制作用。用所示浓度的EZH2抑制剂A或B处理WSU-DLCL2细胞4天。在化合物 处理后，提取组蛋白，通过SDS-PAGE在4-20 %胶上分级分离，转至硝化纤维素膜上，并用抗 组蛋白H3或H3-K27me3的抗体探测。
[0037] 图13显示EZH2抑制剂能够阻断Y641突变WSU-DLCL2细胞增殖，但对非Y641突 变0CI-LY19细胞几乎没有影响。在存在递增浓度的EZH2抑制剂A或B情况下孵育细胞 11天。纳入载剂处理（DMS0)的细胞作为对照。在GuavaEasyCytePlus仪器中用Guava Viacount分析测定细胞数和活力。细胞每3-4天分养，并补充培养基和化合物。
[0038] 图14的图显示EZH2 (Y641)突变的存在和/或高H3-K27me3和低H3-K27me2水平 预示对EZH2抑制剂的敏感性。细胞系维持在递增浓度的一种EZH2抑制剂（至多25yM) 存在下。处理11天后，用活细胞计数来获得IC9(I值。结果对采用根据EZH2突变状态分组 细胞系（A)或根据H3-K27me2和H3-K27me3水平分组细胞系（B)来作图。在两张图中，直 线显示所示细胞系组的IC9(I均值。
[0039] 图15是显示对野生型、A677G或A687VEZH2测量的速率对比酶浓度的关系图。 代表组蛋白H3残基21-44的包含无甲基、单甲基、二甲基或三甲基赖氨酸27 (H3K27meO? H3K27me3)的生物素化肽以固定浓度采用系列稀释度的所示EZH2酶进行分析。在90分钟 的进程中对时间点取样，并通过在闪盘（Flashplate)中捕获所述肽并读取每分钟的记数 (CPM)来检测H3肽的赖氨酸27处的3H-SAM纳入。时程的线性回归产生以CPM/分钟（CPM/ min)计的酶速率，就其与酶浓度的关系作图。
[0040] 详细描述
[0041] 染色质结构在基因调节和表观遗传中是重要的。组蛋白的翻译后修饰，例如甲基 化，参与较高