程骨的弹性模量大幅提高。
[0020]将MC3T3-E1 Subclone 14细胞分别植于原始SIS材料和本发明复合工程骨三天后，考察成骨分化标志基因ALP、BSP、OCN的mRNA相对表达量的对比结果见图8，可见，本发明复合工程骨上的成骨分化标志基因较原SIS材料明显上调，说明本复合工程骨的成骨诱导性明显提尚。
[0021]制备得到的复合工程骨的扫描电镜照片见图9，X射线衍射结果见图11 ;小鼠头盖骨的扫描电镜照片见图10，x射线衍射结果见图12。对比图9和图10可见，复合工程骨和小鼠头盖骨的微观结构均为网状纤维结构，两者均含有大量的钙沉积，表面形态非常类似。对比图11和图12可见，复合工程骨和小鼠头盖骨具有非常类似的谱峰(羟基磷灰石)，进一步说明两者在微观结构上的类似性。
[0022]应用实例:将制备得到的复合工程骨具体应用于小鼠头盖骨缺失模型骨修复，具体实验过程为:
1、选择实验对象:选取5只8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象；
2、建立头盖骨缺失模型:在小鼠头盖骨两侧部位用Miltex公司生产的B1psyPunch设备移去直径为4mm的骨组织，然后在一侧缺失处植入本发明复合工程骨，另一处无植入物作为对照；手术缝合后小鼠正常饲养8周后处死，取得头盖骨组织进行体内成骨状况分析；
3、组织学结果:HE染色和MTS染色结果如图13、14和图15、16所示，图13为无植入物的空白对照骨的HE染色结果，图14为本发明复合工程骨的HE染色结果，图15为无植入物的空白对照骨的MTS染色结果，图16为本发明复合工程骨的MTS染色结果。对比图13和图14及图15和图16可见，在空白对照骨缺失处，8周后几乎没有新生骨，而在植入本发明复合工程骨的位置，出现了大量的包含血管、髓腔的成熟新生骨组织，且骨桥几乎覆盖了整个缺失区域。
[0023]4、统计学计算结果:采用NIH软件Imagej对小鼠骨缺失处的新生骨面积比例进行计算，每个样品取5张不同截面的切片，通过统计学分析发现空白组中新生骨面积比例为5.7%±4.6% (Mean土S.D.)，而实验组中新生骨面积比例为 77.9%土 18.8% (Mean土S.D.)，两者具有显著差异(/7〈0.001)，证明本发明复合工程骨在体内骨修复过程中效果显著。
【主权项】
1.细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，其特征在于该仿生复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架、矿物化结晶和细胞外基质成分，所述的SIS胶原纤维骨架呈网状纤维结构，所述的矿物化结晶和所述的细胞外基质成分沉积于所述的SIS胶原纤维骨架上，所述的矿物化结晶和所述的细胞外基质成分由MC3T3-E1 Subclone 14细胞指导和分泌得到，所述的矿物化结晶主要由羟基磷灰石结晶构成。
2.根据权利要求1所述的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，其特征在于所述的矿物化结晶的沉积量为68.50±6.75 mg/cm3。
3.权利要求1或2所述的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨的制备方法，其特征在于包括以下步骤: O细胞培养及传代:准备含有5-10%胎牛血清的a -MEM培养基作为培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1 Subclone 14细胞置于5% 二氧化碳浓度、370C的细胞培养箱中培养，所述的培养液的用量为200 μ L/cm2，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，确保培养液的用量为200 μ L/cm2,当培养至MC3T3-E1 Subclone 14细胞汇合度大于90%时进行细胞传代，所述的细胞传代的过程为:弃去旧的培养液，加入用量为200 μ L/cm2的PBS缓冲液，清洗2_3次；然后加入用量为40-50 μ L/cm 2的0.25%的胰酶，在37°C下孵育I min ;收集细胞并加入至离心管，在1000 rpm转速下离心2 min ;弃去上清，然后加入I mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将所述的细胞悬液以(1-2) X 14细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5 mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1 Subclone 14细胞； 2)SIS仿生工程骨的制备:取出干燥无菌的SIS材料，用剪刀或合适器械裁剪成所需的大小及形状，再将裁剪好的SIS材料浸泡于所述的培养液，置于37°C的细胞培养箱中预处理24-48h ;取汇合度为70-80%的MC3T3-E1 Subclone 14细胞，加入至离心管，在1000 rpm转速下离心2 min,弃去上清，再加入I mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，然后根据计算得到的细胞密度将该细胞悬液稀释至I X 16细胞/mL的终浓度，即配制得到细胞悬液；取出浸泡24-48h的SIS材料，平铺于新的细胞培养皿上，再按5 X 13细胞/mm2的细胞密度将配制得到的稀释的细胞悬液均匀滴加于SIS材料上，完成对SIS材料的细胞种植，然后立即放入细胞培养箱中孵育；孵育4-6h后，取出植有细胞的SIS材料，用l-2mL/cm2用量的培养液清洗2_3次，除去表面未黏附的细胞，之后以2.5 mL/cm2的用量加入新的培养液，最后将该植有细胞的SIS材料置于细胞培养箱孵育； 3)复合工程骨的制备:植有细胞的SIS材料于细胞培养箱孵育16h后，得到细胞-SIS复合材料，从细胞培养箱中取出该细胞-SIS复合材料，弃去旧的培养液，加入等量诱导矿物化及成骨分化的组合培养液，所述的组合培养液为含有8-15mM的CaCl2、(1-10) X 10_6 M的淫羊藿苷和5-10%胎牛血清的a -MEM培养基，然后置于37°C的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次组合培养液，处理4-8周时间后，得到SIS复合工程骨； 4)复合工程骨的去细胞化:取出上述处理得到的SIS复合工程骨，以用量为(1-2)mL/cm2的PBS缓冲液清洗2-3次；此后将该SIS复合工程骨置于_80°C /37°C反复冻融3_5次，每次I h ;之后再次以用量为(l_2)mL/cm2的PBS缓冲液清洗2_3次，进行去细胞化；将去细 胞化后的复合工程骨置于_80°C保存备用，此即为细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨。
【专利摘要】本发明公开的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，具有较高的机械强度，在干、湿状态下的弹性模量分别可达350MPa、100MPa，在植入体内初期能够提供较好的组织支撑，该组织工程骨与天然骨内部的矿物化结构和分布极为接近，具有高度类似于天然骨的微观结构，利于植入后更好地被识别和加速骨再生；本发明公开的仿生复合工程骨的制备方法，是一种新型的组合诱导成骨细胞分化及矿物化方法，通过钙离子和淫羊藿苷组合培养液刺激SIS上的成骨细胞，在SIS材料上进行大量的原位矿物化和成骨分化，同时可以避免钙离子对于分化后期重要基质蛋白OCN的抑制，增强工程骨的成骨诱导性，最终实现SIS材料上大量羟基磷灰石结晶和类骨细胞外基质沉积，且机械强度较SIS本身有大幅提高。
【IPC分类】A61L27-50, A61L27-46, A61L27-38
【公开号】CN104874024
【申请号】CN201510259835
【发明人】赵基源, 李梅, 谷俏俏, 陈梦洁, 罗钫妙, 陈松娣
【申请人】宁波大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月20日