对用于不可按压出血的组织封闭剂的改进的制作方法
【技术领域】
[0001] 已经以ClotFoam?作为商标的本发明总地来说涉及胶粘封闭剂组分和止血剂； 其可以用于在不按压、没有缝针或纤维的情况下使体内的组织结合或封闭。它的粘合和封 闭能力是由结合纤维蛋白组分的粘弹性（诸如凝胶强度）和凝血性产生的。本发明具体地 涉及四种组分溶液；当将四种组分溶液施加至组织时，四种组分溶液混合在一起，并且然后 在体内固化以使组织结合，以封闭组织，从而防止或控制腔内或内部出血。这是对美国专利 第8, 313, 211号中公开的组分的修改。
【背景技术】
[0002] 创伤在世界上是发病和死亡的常见原因。美国的医院公认的创伤案例中，超过 40%是由交通事故引起的。在传统战争的战场上，出血是死亡的主要原因（1)。这些死亡中 的大多数在伤者能够运输至医疗设施之前在战场发生（2)。伊拉克和阿富汗的差不多50% 的战斗死亡人数以及美国的多达80%的平民伤亡人数归因于不受控制的出血（3)。
[0003] 在这个群体中，死亡的主要原因是出血（50% )和神经创伤（36% );然而，剩余 的死亡原因是由于毁灭性的多重伤害。甚至当伤者存活足够长的时间而运输至医疗设施 时，出血仍保持是后期死亡和并发症的主要原因（2)。腹部损伤造成难题，尤其是青壮年 (4-8)。作为腹内最大的实体器官，肝脏和脾脏是最常受到损伤的（9-10)。
[0004] 肝脏的大量出血目前由普林格尔急救法或伤口的包扎控制，两个过程都需要手 术干预，而不能应用于战场或事故现场（11、12)。脾脏创伤可以在最小损伤下血流如注 (10-12)。早期和有效的出血控制可以比任何其他措施挽救更多的生命。但是由于用于腔 内出血的所有当前的止血剂都设计成用于开腔情况下的手术室（13)，而不是用于事故现场 或战场的紧急情况，出血常常是致命的。而且，诸如腔腹镜或脑部手术的特定类型的手术以 及当前需要按压的内出血可以以微创方式治疗。
[0005] 当前的解决方案和限制。可以粘附至组织的生物胶是已知的。通常，合成胶粘剂 用于血管或肺的紧密密封以及用于"粘合"皮肤切口的边缘。通常在伤口痊愈之后消除这 些胶一通过生物降解、吸收或通过以痂的形式简单脱附。为了配置组织粘合剂，已经发展了 多种技术。一些组织粘合剂是人工合成的，诸如基于氰基丙烯酸酯（2-丁基氰基丙烯酸酯、 2-辛基氰基丙烯酸酯）的胶或基于合成聚合物的胶；并且其他组织粘合剂包含诸如胶原蛋 白或纤维蛋白的生物材料，此外，胶原蛋白或纤维蛋白具有止血性能，并且也通过控制出血 而发挥作用。
[0006] 由于它们的止血和粘合性能，当它聚合时粘附人体组织的能力，封闭剂一尤其是 纤维蛋白封闭剂一已经广泛地用于大多数外科手术超过20多年，以减少失血和术后出血 (14、15、16)。这些化合物用于封闭或加固已经缝合或固定的伤口；可以在施加压力的情况 下将它们用于损伤区域上方。纤维蛋白封闭剂是模拟凝血级联的最后步骤的生物粘合剂。 (13)
[0007] 存在几种可用的商业产品（Floseal、Gelfoam、Evicel、Floseal) (16-18)。然而， 这些产品具有显著的限制，这已阻碍了它们在急诊医学（创伤）和腹腔镜手术中的广泛使 用。用于腔内出血的所有现有的止血剂均设计成用于手术室而不是在例如事故现场或战场 的紧急情况；并且所有均需要按压。在非可按压出血的组织粘合剂和封闭剂组合物的开发 和/或使用中遇到的主要限制之一是它们不能与组织形成足够强的结合并且不能开发应 用的方法。因此，组织粘合剂和封闭剂必须与按压方法、缝合和固定结合使用，以减小可接 受的性能所需要的组织结合强度。然而，存在许多使用缝合和固定是不期望、不适当或不可 能的情况。粘合剂基质与组织形成强界面或结合中的困难主要可能由于几个因素：腔内自 由血液或流动血液不允许促进凝血的化合物到达出血源；以及在施加时和/或在固化期间 和固化之后，组织中的各种蛋白不容易适合于与所述组织粘合剂或封闭剂组份的非共价和 /或共价相互作用。结果，对于大多数组织和粘合剂和封闭剂系统；一般认为故障发生在交 联粘合剂基质和一种或多种组织相关蛋白（诸如胶原蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白）之间的 界面（19、20)。另一重要限制是这样的事实：由支撑件携带的胶留在体内直到生物降解，并 且不能在手术之后冲洗或立即消除。第三个重要限制是由包括在制剂中的一些化合物产生 的炎症反应导致的不良反应。
[0008] 现在的可选方法：Clotfoam是可以达到止血的试剂，其无需按压和/或缝合而在 手术室外阻止严重腔内创伤出血，不会触发显著的炎症反应。非可按压技术也用于手术室， 其中，不施加按压（例如，腹腔镜手术、神经外科等）。为了抵抗血液流动，粘合剂基质必须 在几秒钟内形成强界面，并且在流动的血液中与组织结合；保留在撕裂部位以形成凝块。
【发明内容】
[0009] 本试剂的粘附至人体组织的能力涉及支架的内部结构，支架承载纤维蛋白封闭 剂，纤维蛋白封闭剂转化为所需的粘弹性和当其聚合时由胶凝化组分产生的粘合特性。快 速形成水凝胶和最小的聚合时间，以产生包含必要组分的粘合凝胶以在撕裂出血组织上方 发展功能性纤维蛋白凝块，在临床上是重要的。即时组织封闭剂的粘附是期望的，以确保封 闭剂接触并保留在施加部位的功能，而不会被血液冲走或由目标组织的移动而移位。（21)
[0010] 在我们的方法中，这些功能通过以下来满足：a)通过非共价键结合到组织的三维 聚合物交联化学网络的原位生成，和b)由胶凝组分增强的泡沫的粘弹特性一产生非常粘 的基质，其附着至撕裂组织和潮湿表面而不会触发在15天内不能解决的严重的炎症反应； 以及c)由非钙依赖转谷氨酰胺酶ACTIVA?稳定的强纤维蛋白凝块的即时形成。粘性和 其他粘弹特性基本上有助于血纤维蛋白聚合物的在严重出血时形成血液凝块并且实现止 血的能力。
[0011] 组合物。如时间为2009年6月18日的标题为〃A Method to Produce Fibrin Monomer in Acid Media for Use as Tissue Sealant. 〃的专利号 8, 367, 802 (Falus，et al)中所述的，ClotFoam包含溶液中的血纤维蛋白单体，准备在通过透析方法产生的pH值 变化时聚合，其嵌入在水凝胶支架中。支架在非钙依赖转谷氨酰胺酶（ACTIVA)的存在下交 联，而纤维蛋白聚合物通过活化和存在于血液中的活化因子XIII交联，从而形成α-α和 γ-γ二聚物。当通过施加设备（图1)混合时，聚合物、纤维蛋白和支架均原位交联，实现 三个目标或功能：a)允许试剂在腹腔或其他体腔中非侵入性的施加和传播；b)粘合和按压 撕裂或伤口组织，以防止血液流动；和c)在伤口上方维持必要的组份，以产生纤维蛋白凝 块并且刺激凝血级联。
[0012] 该支架使用明胶作为与聚丙烯酸交联、与包含不低于56. 0%并且不超过68. 0% 的羧酸的蔗糖（卡波姆均聚物）的烯丙基醚交联的"结构"蛋白；中和的0.5%的水分散 体的粘度在30500和39400厘泊之间，并且在选自由α -半乳糖苷降解的角叉菜胶、藻 酸盐硫酸、透明质酸盐或透明质酸组成的组中的非炎性凝胶加强剂或增强剂的存在下， ACTIVA?、非钙依赖转谷氨酰胺酶的酶；实现特定的粘弹性轮廓，它特别适用于携带血 纤维蛋白单体和用于中和其PH值以聚合它。（21，22)当通过部件（图2和图4)的混合而 聚合时，纤维蛋白在损伤位点提供重要的临时基质（23)。
[0013] 虽然可以通过许多"树胶"获得期望的粘度或凝胶强度，诸如黄原胶或类似物； 分子结构中的电荷和这些树胶的促炎症效应将非炎性凝胶增强剂的选择限制于通过用 半乳糖苷酶、藻酸盐酸盐或透明质酸盐处理来耗尽它的炎症性质的角叉菜胶。所有其他 粘性剂都已被证明在帮助实现产生止血的粘弹特性方面是无效的。
[0014] 非侵入性的施加和传播基于在混合各组分之后的泡沫的产生；一旦注入，其散布 整个腔体，到达撕裂组织以形成纤维蛋白凝块。与现有凝胶的其他重要差别是，所提出的 粘合剂用作交联的结构蛋白、硬骨鱼类鱼凝胶、明胶A型、人血清白蛋白（HSA，蛋白）、卡 波姆934(与丙烯基鹿糖（preallyl sucrose)交联的聚丙稀酸）、非妈依赖交联催化剂 (ACTIVA);和可选材料一诸如多糖和聚乙烯吡咯烷酮，以及除了"改性"角叉菜胶（磺化多 糖）蔗糖或藻酸盐；或透明质酸盐或透明质酸之外的MgCl2，从而提供根据需要修改液体凝 胶状态和粘度的更好并且"智能"的交联化学物质。
[0015] 基质实现止血的能力不仅取决于纤维蛋白自身的形成，而且还取决于在纤维蛋白 上的特异结合位点、促酶、凝血因子、酶抑制剂、细胞受体之间的相互作用，并且同样重要的 是，分配的动力学和泡沫的粘弹性粘附性质（24/25)。这些因素的活性可以增强或改进，以 产生能够阻止腹腔、颅腔和软组织中的脾脏、肝脏和其他实体器官实质出血的强凝块。每个 部分均配制为最大化通过其流变性能（g'和g"）测量的纤维蛋白凝块组分的支撑件的强 度。胶凝时间或支架的几乎即时凝胶化、由支撑聚合物（g'）的储存能量测量的凝胶强度、 保持在湿表面接触粘合以及纤维蛋白单体的快速聚合和稳定（在ACTIVA存在下的共价键 的形成）的能力；对试剂的在伤口上沉积凝块、同时确保封闭剂保留在施加部位而不会被 血液冲走或由目标组织的移动而移位的能力而言是重要的（19)。高的拉伸强度和粘合强 度（图4)是机械性能，其表征由试剂产生的明胶纤维蛋白聚合物网络，这对于成功的封闭 是必要的（29)。在凝结剂的条件下，ACTIVA以及Ca(2+)、Mg++和Zn++由通过共价键稳定 纤维蛋白凝块而有助于这一过程。
[0016] 关键属性。聚合/粘合。在蔗糖、金属离子和非钙依赖转谷氨酰胺酶的存在下， 由于明胶链、血清白蛋白和卡波姆934的共价交联而形成凝胶泡沫[24]。凝胶运载血纤维 蛋白单体并且支撑溶液中的血纤维蛋白单体的聚合，其通过在施加 Ca++和ACTIVA的1分 钟内变为纤维蛋白凝块而稳定。胶凝性质优选地通过非炎性粘性剂加强，非炎性粘性剂选 自包括α-半乳糖苷处理的角叉菜胶、或藻酸盐或透明质酸盐或透明质酸的组。凝块是机 械稳定的，良好地集成到支架内，[25]并且与未交联的凝块[26]或其他纤维蛋白封闭剂相 比，更耐纤溶酶的溶解。支架的组分与ACTIVA -起促进纤维蛋白促进整合素集群的aC域 的反谷氨酰胺酶介导的寡聚，并且从而增加细胞粘附和扩散，这刺激纤维蛋白结合EC上的 avb3-、avb5-和a5bl整合素（27)。寡聚还促进了经由黏着斑激酶（FAK)和细胞外信号调 节激酶（ERK)的整合素依赖的细胞信号传导，这最后导致随着时间增加的细胞粘附和细胞 迀移一由鱼明胶对成纤维细胞的分化的影响驱动[28]。附加的Ca+和锌的存在增强了炎症 应答和凝血级联（第一级）之间的进展。
[0017] 对至关重要人体组织的粘附特性和建议的试剂的聚合的动力学已经在体外和体 内（图4)进行了测试。所获得的数据提供了凝块泡沫的止血和在猪模型中在诱导腹腔非 可按压严重创伤腔内损害中没有按压而实现止血的能力的充分证据，包括诸如伊拉克自由 行动和最近在阿富汗的美国军队观察到的那些由爆炸装置引起的模拟损害。凝胶过程在混 合液体溶液的6秒内开始，在10秒内达到7000dyn/cm2±1000dyn/cm2的胶凝强度（图5)，