微观病理评估。
[0178] 结果：
[0179] 1组：(η = 5)5级粘合、传播肉芽肿和炎症反应
[0180] 该组中的所有猪在腹部中的多个器官上具有小的凸起结节，尤其是在与测试物质 相关的损伤部位周围。在该组的50%的猪中，结节正好位于损伤部位周围。而且，沿着浆膜 表面以及在肝实质中存在具有可变纤维化的肉芽肿性炎症的多病灶区。在五只动物的两只 中，炎症传播至脾脏、网膜和腹膜。对粘合的相关微观发现是由纤维结缔组织组成的粘合； 以及对于结节，肉芽肿性炎症和纤维化的多病灶区。轻嗜酸性至双嗜性材料的累积包含在 炎症内，该材料偶尔通过使中性粒细胞退化和矿化而作为边缘。
[0181] 2组：(η = 5)。该组中仅两头猪在损伤部位周围没有结节和与测试物质相关的轻 度粘合。在损伤区域的外部不存在肉芽肿性炎症的区域。对粘合的相关微观发现是由纤维 结缔组织组成的粘合；以及对于结节，炎症是轻嗜酸性至双嗜性材料的累积。未观察到矿 化。
[0182] 3组：(η = 5)。该组中的三头猪在损伤部位周围没有结节和与测试物质相关的轻 度粘合。微观发现类似于2组中观察到的。
[0183] 4组：(η = 5)。结果类似于3组中观察到的。微观发现类似于2组中观察到的那 止匕 -、〇
[0184] 结论：在手术之后35±2天施加于猪的损伤肝脏的ClotFoam和多种凝胶增强剂的 炎症反应的评估产生粘合和结节，粘合和结节严重影响腹部器官。肝脏损伤部位的微观发 现包括肉芽肿性炎症、粘合和纤维化。肉芽肿性炎症的扩展的多病灶区扩展至其他器官，具 有坏死；以及仅在用包含非处理的iota角叉菜胶的ClotFoam处理的动物中观察到矿化。 用包含半乳糖苷酶处理的角叉菜胶、藻酸硫酸盐或透明质酸盐的ClotFoam处理的动物产 生与对照动物中观察到的类似的炎症反应。1组中的粘合得分显著高于其他组。
[0185] 6.生物相容性
[0186] 测试了在无菌条件下制备的具有和不具有苯甲酸钠的两种ClotFoam制剂。测试 了这些制剂与人成纤维细胞（HF)和人上皮细胞（A549细胞系，ATCC)的生物相容性。
[0187] 正常人成纤维细胞（HFS)是从商业来源获得的；并且在60mm组织培养皿中在添加 有10%胎牛血清的良伊格尔培养基并且在潮湿的5% CO2环境（CO2培养箱中）保持在37°C 培养。人上皮细胞系A549保持在添加有10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的最小必需培养基 中。当成纤维细胞和上皮细胞培养达到子覆盖（subconfluence)时；混合对照和苯甲酸钠 ClotFoam制剂，并且立即输送到单独的器皿。将培养物返回到0)2培养箱并且在第0天（图 9a)中、在第3天（图9b中）和在第7天（图9c)进行检查。从所有培养物去除ClotFoam 材料和培养基，并且贴壁细胞用结晶紫（〇. 1%，2%乙醇中）染色。
[0188] 主要观察对细胞完全没有损害或毒性，并且没有任何细菌或真菌污染。在暴露于 ClotFoam制剂的人成纤维细胞培养物中，细胞比对照-未处理的培养物呈现出稍微更大或 更加伸展。结论：ClotFoam和ClotFoam+防腐剂苯甲酸钠是生物相容的；并且不影响，反而 刺激细胞的生长和分化一这是伤口愈合剂的重要属性。
[0189] 7.动物模型中的药效实验
[0190] 我们在大鼠和猪（猪）模型上对若干腔内创伤模型进行了研宄。
[0191] 7. 1在IV级肝损伤之后ClotFoam对失血的影响（大鼠模型）
[0192] 方法：使用十只雄性Sprague-Dawley大鼠（225-250克）（经UMB的机构动物护理 和使用委员会批准）。
[0193] 实验步骤：进行剖腹手术；在较大的左叶和右叶中引起III级肝损伤。通过用止血 钳夹紧这两叶，并且通过两个内侧叶引起肝脏的实质损伤来引起该损伤。
[0194] 在第一次穿透肝脏之后，夹钳被打开并重新定位至动物的左侧；引起第二损害，包 括从边界到肝上腔静脉的距离的40%以上。在这种重新定位之后，第二次穿透肝脏。在实 验结束时通过肝脏切除和检查实现了肝损伤的进一步证明。损伤是彻底的。没有注意到对 胆总管、腔静脉或肝动脉的伴随损伤。十只动物受到损伤以用于这项研宄，并且它们被随机 分配为接收4毫升生理盐水（对照）或4毫升ClotFoam试剂。在引起损伤之后立即通过 针将ClotFoam或盐水给药至腹膜腔内。观察并且记录出血时间。然后用4-0尼龙使腹腔 闭合，观察动物90分钟。在这段时间之后，将动物重新麻醉并且将腹腔中的所有流体收集 在预称重的纱布中，然后重新称重以测得腹腔内体积并且计算血液损失。
[0195] 结果：对照组中的出血时间示出为平均37秒（土SD7. 5)。在CL0TF0AM处理组中， 损伤区域的出血在4秒（+1.0)内停止。这种差别表明具有p〈0. 008有统计显著性。
[0196] 在对照未处理组中的失血测量结果为2. 45毫升（从1. 86至3. 61)，对照组中的 SD为0. 67。与此相反，处理组具有平均值0. 95毫升（0. 72-1. 78)，SD为0. 55, T测试表明 这种差异是统计学显著的，P值为〇. 028。
[0197] 7. 2. ClotFoam在肝损伤中的封闭功效的验证（大鼠模型）
[0198] 取出肝脏，以用于观察损害和凝块形成行为。结果发现，在对照（图13)中，损害 区域上发展了一些凝块；但是，无一例外，他们仍然分开。与此相反，当给药ClotFoam时，肝 脏显示在损伤区域中形成非常强的凝块（图14)，凝块未粘附至未损伤组织。
[0199] 7. 3.在剖腹手术实验中的主动脉模型
[0200] 方法：在该模型中，作出中线剖腹。正好在肾动脉之下并且在髂动脉分叉处以上夹 紧主动脉，从而有效地获得肾近端和远端主动脉对照。然后用25号针头在血管的左和右两 侧上刺穿腹主动脉一次。在不受控制的出血的6秒之后，施加500微升ClotFoam，ClotFoam 扩散到整个腹膜腔。在完成泡沫施加之后，测量止血时间。然后闭合腹部。
[0201] 在损伤之后立即给予大鼠林格溶液以将平均动脉压维持在初始MAP的约70-80% (如果可能的话），这是用于创伤患者的当前标准复苏术。观察大鼠20分钟。在20分钟后， 通过相同的中线切口重新探索该动物。用预先称重的纱布垫收集所有的血液，并且计算总 失血量。
[0202] 结果：17只动物经受主动脉损伤。将动物随机分成2个不同的组：ClotFoam处理 和非处理。对于ClotFoam处理的所有动物，60分钟时的存活率为100%。在未处理组中没 有动物在损伤中存活下来。损伤前的所有MP相似。下面的表3总结了每组中测得的结果。
[0203] 表3. ClotFoam处理与未处理的主动脉损伤动物的结果的比较。复苏指数定义为 损伤前的MAP的复苏MAP百分比。与没有试剂相比，所有结果和所有制剂的P值均〈〇. 001。
[0204]
[0205]
[0206] 7. 4.腔静脉模型
[0207] 第二模型是肝/腔静脉损伤模型。在该模型中，作出小的上中线剖腹。肝脏的左 叶和腔静脉暴露并且隔离。在右下腹产生小切口，并且通过该切口放置ClotFoam施加器尖 端；使得开口位于腹膜内但远离将发生损伤的地方。接下来，通过大幅横切左肝叶，然后在 腔静脉内产生锐器伤来产生该损伤。用纤维迅速闭合腹壁小切口。然后将ClotFoam注入 闭合的腹腔内。如上所述，复苏、观察和收集失血测量。
[0208] 十二只动物经受肝/腔静脉损伤。将动物随机分成不同的两组：ClotFoam处理组 和未处理组。对于ClotFoam处理的所有动物，60分钟时的存活率为100%。施加器置于腹 膜腔中内。在肝/静脉损伤之后20分钟的大关，完全打开动物，以露出损伤区域。未处理 组中的动物在>18分钟时由于损伤而死亡。损伤前的所有MP相似。表4总结了每组中测 得的结果。
[0209]
[0210] 7. 5在三个不同出血模型中的ClotFoam效果的总结：表5中的数据比较了不同模 型的结果。对照代表仅以NS处理的穿刺模型。数字代表在损害的基线、10秒、10分钟和 两小时后的血压和平均动脉压（MAP-括号中）。NS-以ml计的生理盐水给药。NA-不适用 (在前2终点之前的死亡对照动物）。TTH-总止血时间，作为持续时间的函数测量并且保持 血压上升和70的MAP。
[0211] 表5.方案之间的结果的比较
[0212]
[0213] 7. 6.猪中的非GLP研宄
[0214] 在猪模型中评估ClotFoam。
[0215] 方法：使用18只雌性约克夏杂交猪，年龄2. 5个月，体重37±2kg。该方案由机构 动物护理和使用委员会批准。然后通过开腹或通过腹腔镜使动物经受4级肝损伤。为了该 模型的目的，4级肝损伤是用特别设计的高速钻头产生的深10厘米的实质损伤，其中高速 钻头具有产生类似于穿透枪伤（GSW)的损伤的切削钻头（图Ila)。这些损伤与美国创伤器 官损伤缩放系统的外科协会（American Association for the Surgery of Trauma Organ Injury Scaling system) -致。在暴露肝脏之后，肝脏中的中间的点被选择为产生肝损伤。 位置计算为接近肝上血管和门静脉的一些分支。用标记对该点作标记。在引起损伤之后， 外科医生闭合腔，并且在通过小穿孔施加 ClotFoam之前允许大量出血30秒。
[0216] 但目前为止，将动物随机分成4组。1组（η = 5)由通过开放的中线剖腹手术经 受IV级肝损伤并且具有开腔ClotFoam施加的动物组成。在该组中，试剂可见地定向至 肝损伤。2组（η = 6)由通过腹腔镜手术经受由钻孔机产生的IV级肝损伤并且具有闭合 腔ClotFoam施加的动物组成。在该组中，试剂在没有定向损伤可视化或方向的情况下无 目的地给药至腹腔内。3组（η = 4)由通过开放的中线剖腹手术经受4级肝损伤而不用 ClotFoam处理的动物（开放对照）组成。4组（η = 3)通过腹腔镜技术经受4级肝损伤而 不用ClotFoam处理（腹腔镜对照）。
[0217] 在所有组中，150cc ClotFoam用于处理。ClotFoam经由混合设备而输送入腹腔内。 在损伤之后立即开始用乳酸林格氏（LR)进行液体复苏。如果可能的话，根据需要注入LR 以将MAP重新建立在损伤前MAP的至少80%内。复苏持续整个观察期。在60分钟研宄结 束时，记录每只动物的MP和注入的总复苏体积。
[0218] 在研宄期结束后，检查腹部，抽吸液体血液。取出并且称重血块。在纱布包扎组中， 通过将干纱布重量减去湿纱布的重量计算额外的液体血液损耗。通过液体加上凝结的血液 损失来确定总失血量。
[0219] 动物存活定义为在研宄期结束时的心率的存在。在60分钟时，用IOml Euthasol 使存活的动物安乐死。
[0220] 结果：在表6中示出了 1组和2组中的动物（IV级损伤）的终点。在图12中看到 平均动脉压（MAP)的趋势。
[0221] 表6.以ClotFoam处理的IV级肝损伤的结果测量。