放射性缀合法
【专利说明】放射性缀合法
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2011年12月1日，申请号为 201180057989. 4 (PCT/EP2011/071506)，发明名称为"放射性缀合法"。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于体内成像的放射性药物领域，具体而言涉及用放射性同位素标记 生物靶向分子的方法。本发明的方法特别适于与自动合成仪一起使用。亦提供可用于所述 方法的呈无菌形式的前体，以及包含这类前体的盒（cassette)。
[0003] 发明背景 WO 2004/080492 Al公开了用于生物靶向载体的放射性氟化的方法，所述方法包括使 式（I)化合物与式（Π )化合物反应：
或者， 使式（ΠΙ)化合物与式（IV)化合物反应： 其中：
Rl为醛部分、酮部分、受保护的醛（例如缩醛）、受保护的酮（例如缩酮），或者诸如二 醇或N端丝氨酸残基等官能团（functionality)，可使用氧化剂将所述官能团迅速而有效 地氧化成醛或酮； R2为选自伯胺、仲胺、轻胺、肼、酰肼、氨基氧基（aminoxy)、苯肼、氨基脲和氨基硫脲的 基团，以及优选为肼、酰肼或氨基氧基； R3为选自伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、氨基氧基、苯肼、氨基脲或氨基硫脲的基团，以及 优选为肼、酰肼或氨基氧基； R4为醛部分、酮部分、受保护的醛（例如缩醛）、受保护的酮（例如缩酮），或者诸如二 醇或N端丝氨酸残基等官能团，可使用氧化剂将所述官能团迅速而有效地氧化成醛或酮； 以分别得到式（V)或（VI)缀合物：
其中 X 为-CO-NH-、-NH-、- 0-、-NHCONH-或-NHCSNH-，以及优选为、-NH-或-ο- ;Y 为Η、烷基或芳基取代基；以及 式（II)、（IV)、（V)和（VI)化合物中的接头基团选自
其中： η为0-20的整数； m为1-10的整数； P为〇或1的整数 Z为0或S。
[0004] Poethko 等[J. Nucl. Med.，45(5)，892-902 (2004)]公开了使用放射性同位素 18F放射性标记肽的方法，其中将氨基氧官能化的肽与[18F]-氟苯甲醛缩合以得到具有如下 肟醚键合的标记肽：
Schottelius 等[Bioconj. Chem.，19 (6)，1256-1268 (2008)]进一步发展了 Poethko 等的方法。Schottelius等使用氨基氧官能化肽，其中用y^Boc (Boc =叔丁氧羰基）保护 基保护氨基氧基的胺。在[18F]-氟苯甲醛存在下，在酸性pH (pH = 2)于75 °C经由，Boc 基团的脱保护来原位生成所需的氨基氧官能化肽。Schottelius等使用5倍摩尔过量的Boc 保护的前体，因为在所述反应条件下脱保护不是定量的。
[0005] Mezo等[J. P印t. Sci.，17，39-46 (2010)]描述了与Boc保护的氨基氧官能化肽 的上述肟连接化学相关的一些问题。因此，已知的是，最初形成的自由氨基氧肽可酰化未反 应的Boc保护的氨基氧肽，导致不合乎需要的副产物。亦已知的是，官能化肽的自由氨基氧 基对羰基化合物的反应性很高。所以，可与存在于反应混合物中或任何后续纯化步骤中的 任何外来醛或酮发生不必要的缩合。这类醛或酮可以是痕量的存在于所用溶剂中的丙酮， 或者甲醛（例如来自增塑剂）。对于抗癌药与肽的缀合和[ 18F]-氟苯甲醛与肽的缀合二者， Mezo等关注于解决此问题。Mezo等通过在作为'羰基捕获剂'的十倍摩尔过量的自由（氨 基氧）乙酸（Aoa)存在下，进行Boc-氨基氧肽的脱保护来解决所述问题。然后将脱保护的 氨基氧基-肽和过量的Aoa冻干并在4 °C储存。临近肟连接反应之前，将冻干混合物复溶， 并通过HPLC或S印-Pak +C18柱分离过量的Aoa。Mezo等提供了其中利用此技术将非放射 性（即19F) 4-氟苯甲醛与氨基氧官能化的促生长素抑制素肽缀合的实例。Mezo等未提供 关于18F-放射性标记的任何数据。
[0006] 因此对于放射性标记肽及其它生物靶向分子的改进方法仍有需要。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了经由氨基氧官能团放射性标记生物靶向分子（BTM)的改进方法。本 发明提供了保护基途径，所述途径克服了先有技术中公认的杂质问题，而无需： (i) '羰基捕获剂'以及在4 °C长期储存； (ii) 强酸性条件以去除展Boc氨基氧保护的保护基； (iii)使用过量展Boc氨基氧保护的起始材料。
[0008] 选项⑴对于放射性标记目的而言并非合意的，因为必须事先完全去除过量的羰 基捕获试剂以防止涉及所述羰基捕获剂的副反应。所述去除步骤需要制备性色谱法或类似 方法。另外，对于在4 °C储存前体的需要较不理想。
[0009] 先有技术亦教导，可使用Boc保护的氨基氧前体--选项（ii)。所述方法的问题 在于Boc脱保护需要强酸性条件，例如95%含水三氟乙酸（TFA)或25-50% TFA/有机溶剂 (例如DCM)，二者均在室温下。一些出版物亦建议在60-75 °C加热。所述强酸和/或加热 可能破坏生物靶向分子。亦需要用附加步骤去除过量的强酸一一通常通过蒸发TFA，其可 为费时的。然而，三氟乙酸亦可生成不会经由蒸发去除的盐一一以及通常需要研磨来去除。 本发明的方法在室温下仅使用含水稀酸（例如2. 5%含水TFA或0.0 lM含水盐酸）或者在 60°C仅使用0. 1%含水TFA便实现完全脱保护。所述条件与BTM更相容，并且避免了对于附 加纯化步骤的需要。
[0010] 第三，先有技术教导，应使用5倍摩尔过量的Boc保护的氨基氧BTM前体--选项 (iii)。这是因为Boc脱保护不完全并且其对于消耗全部[18F]-氟苯甲醛反应物而言很重 要。所述方法对于放射性药物目的而言为不合乎需要的，因为存在于产物中的任何过量的 未标记BTM前体很可能会与放射性标记的BTM竞争体内生物目的位点，并因此具有抑制所 需成像剂摄取的风险。因此，在使用前有必要从放射性标记的产物中去除过量的非放射性 前体。相比之下，本发明的方法允许在温和条件下有效完全的脱保护，由此不需要使用过量 的受保护的起始材料。
[0011] 本发明的受保护BTM具有阻抑在脱保护和放射性标记期间的过度酰化的优势。
[0012] 鉴于本发明的方法需要更少步骤，以及避免了对先有技术的一些色谱纯化步骤的 需要，其亦更有效且更遵从自动化一一例如使用自动合成仪。
[0013] 本发明的保护基的又一个优势在于其在中性和碱性pH下稳定并且在高达50%含 水乙酸溶液中稳定，由此可用0. 1 %含水乙酸作为流动相采用HPLC色谱法来纯化受保护的 前体。因此，使用本发明的方法保护的BTM可在多种条件下纯化，所述条件可针对BTM的稳 定性定制。
[0014] 发明详沐 在第一方面，本发明提供用于放射性标记生物靶向分子的方法，所述方法包括： (i) 提供式（IA)或（IB)的受保护化合物
[BTM] -X1 (IA) Q-[接头]-X1 (IB) (ii) 将步骤（i)的式（IA)或（IB)的受保护化合物脱保护，分别得到式（IIA)或（IIB) 氨基氧化合物；
[BTM]-O-NH2 (IIA) Q-[接头]-O-NH2 (IIB) (iii) 缩合： (a) 式（IIA)氨基氧化合物与式（IIIA)羰基化合物 Q-[接头]-(C=O)Y1 (ΠΙΑ);或 (b) 式（IIB)氨基氧化合物与式（IIIB)羰基化合物，
[BTM] - (C=O)Y1 (IIIB) 分别得到式（IVA)或（IVB)的放射性标记缀合物：
[BTM] -O-N= (CY1)-[接头]-Q (IVA)
[BTM] - (CY1) =N-O-[接头]-Q (IVB) 其中：
[BTM]为生物靶向分子； X1为下式受保护的氨基氧基：
其中R1和R2独立选自C i_3烷基、C i_3氟烷基或C 4_6芳基； Q为包含适于体内PET或SPECT成像的放射性同位素的基团； Y1为Η、(ν6烷基或C4_1Q芳基，
[接头]为接头基团。
[0015] 术语"放射性标记"具有其常规意义，即其中将放射性同位素与BTM (在本文情况 下）共价连接的过程。
[0016] 术语"生物靶向部分"（BTM)意指这样的化合物，其在给予之后被选择性吸收或在 体内定位于哺乳动物身体的特定部位。这类部位例如可能牵涉于特定的疾病状态或者表明 器官或代谢过程如何运作。
[0017] 术语"脱保护"具有其在化学和/或放射化学领域中的常规意义，即保护基的去 除。术语"保护基"或P ep意指抑制或阻抑不合乎需要的化学反应的基团，但是将其设计成 具有足够的反应性使得其可在不修饰分子的剩余部分的足够温和的条件下从讨论中的官 能团上切除。脱保护之后获得所需产物。保护基的使用在ieciire Croop1S i/? 有机合成中的保护基），第 4 版，Theorodora W. Greene 和 Peter G. Μ· Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]中阐述。
[0018] 术语"氨基氧基"具有其常规意义，是指式-0-順 2、优选式-〇12-0_順2的取代基。
[0019] 术语"包含放射性同位素的基团"意指官能团包含放射性同位素，或者将放射性 同位素作为附加物质连接。当官能团包含放射性同位素时，这意味着化学结构已含有讨论 中的化学元素，并且该元素的放射性同位素以显著超过所述同位素的天然丰度水平的水平 存在。同位素的这类升高水平或富集水平适当为讨论中的同位素的天然丰度水平的至少5 倍、优选至少10倍、最优选至少20倍；以及理想上为讨论中的同位素的天然丰度水平的至 少50倍，或者以其中讨论中的同位素的富集水平为90-100%的水平存在。这类官能团的实 例包括具有升高水平的 18F使得18F原子在化学结构之内的氟烷基。当放射性同位素为射电 金属，例如99mTc、 68Ga或64Cu时，"附加物质"通常会是螯合剂。当所述放射性同位素为放射 性碘时，那么如本领域已知，所述附加物质会是苯基或乙烯基，以使碳-碘键对体内代谢脱 碘稳定。
[0020] 术语"PET"和"SPECT"具有其在放射性药物领域中的常规意义，分别是指正电子 发射断层扫描和单光子发射断层扫描。
[0021] 术语"接头基团"意指式-㈧m-的二价基团，其中每个A独立地为-CR2-、-CR=CR-、 -C Ξ C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、