专利名称：反射型基片的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域的一种生物芯片用镀膜镜面反射型基片。
背景技术：
1990年启动的人类基因组计划(HGP)，启动了人类为了认识自身而进行的最伟大的科学 研究计划，HGP于2001年6月发表了准确的高质量的人类基因组测序结果，2002年初发表了 高精确度和经过详细注解的人类基因组研究结果，它标志着人类基因组计划的提前完成。同 时，对于地球上各类物种的基因组测序也都取得了重大的进展。随着生物全基因组序列的公布，研究的重点已转移到以搞清各类物种中所有基因的结构 和功能为目标，并加以利用造福生物本身的后基因组计划时代，它包括了后基因组计划、蛋 白质组计划、疾病基因组计划等分类和方向。而怎样从海量的生物信息中发掘其本质功能；如何研究成千上万生物信息在生命过程中 担负的角色；如何丌发利用这些研究成果，将其与生命的各项机能联系起来，揭示生长、进 化、哀老等方方面面的奧秘；深入了解疾病的物质基础及发生、发展过程；开发相应的诊断 方法和治疗药物根治各类疾病、顽症和肿瘤。这一系列挑战都依赖于高通量、高精度、快速 的"生物芯片"。生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以 实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子进行准确、快速、高通量检测。生物芯片技术的木质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机信息处理技术， 将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、规模化和微型化。它能针对 集成的成千上万密集阵列排布的分子微阵列或分析元件，在短时间内分析大量的生物分子， 快速准确地获取样品中的生物信息，百万倍提高检测效率和准确性，是公认的继大规模集成 电路后又一次具有深远意义的科学技术革命。生物芯片的分类基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室(电子芯片、三维芯片、流式芯 片等)、细胞芯片、组织芯片、糖芯片及其他。目前生物芯片的应用主要在基因突变检测、疾病诊断、药物筛选、毒理学研究与药物基 因组学研究这五个方面。正如在生物芯片定义中指出的，所有生物芯片都离不开固相基质的表面，实际就是生物 芯片的片基(也称基片)，也就是载体材料，作为芯片片基必须符合以下要求1、表面有活 性基团，可与生物分子偶联；2、惰性(不影响生物分子的功能)和稳定性(包括机械、化学、 物理等方面)；3、良好的生物兼容性。本专利技术就是针对这一技术领域和方向的发明。生物芯片研究和临床应ffl过程中，由于生物芯片上的分子探针对不同的样品(如DNA、 RNA 或蛋白质)具有选择性，当靶探针与目标探针杂交以后，与生物芯片分子探针发生特异性反 应的生物分子就结合在芯片上，而没有发生特异反应的生物芯片分子探针则无荧光标记物。 当斗:物芯片和样品探针杂交完毕后，就需要对生物芯片杂交结果进行图像采集和分析。采用 的设备为各类荧光扫描仪。所有生物芯片上的荧光都需要经过扫描装置来分析其上的荧光强 度和分布。从检测角度而言，生物芯片就是许多微小的DNA或其他生物分子整齐排列的固相表面， 这些DNA或生物分子与荧光标记分子结合，测定荧光强度后可通过生物信息学软件和平台推 知结合分子的浓度等等信息。而固相介质主要是经过物理及化学处理过的玻璃或硅片，它对 生物芯片的性能有非常大的影响。这涉及到结合的能力，以及在芯片扫描中对信号的反馈能 力。低劣的表面处理会导致生物分子(如D隨、蛋白等)不能很好地固定到基片上，而不均匀 的表面会导致固定的生物分子量的差别，从而导致所产生的生物信息的失真。同时固相介质 材料本身是否带有高自发荧光的物质，也在很大程度影响着生物芯片扫描检测质量的优劣。现有的生物芯片基片，在研发制造生物芯片的过程中，或者不能保证生物分子与基片的 良好结合，或者很难在检测中直观获取完整的生物分子标记荧光信号，即生物芯片扫描检测 质量都相对较差，需大量依赖后期以复杂数学模型为基础的计算机软件再加工，存在各种类 型的信号失真、畸变问题，影响对生物信息的判断与识读。因此有良好的生物分子结合能力 和扫描检测质量较好的生物芯片基片的发明势在必行。发明内容为了克服背景技术屮的现有的生物芯片基片在信号反馈能力上的不足，本发明一种反射型基片，其是应用于生物领域的一种生物芯片用镜面反射型基片，其包括基底和位于基底 上方的承载结合生物分子的化学修饰层，所述基底和位于基底上方的承载结合生物分了的化 学修饰层之间设有降低荧光信号漫散射的膜系层。反射型基片的承载结合牛物分子的化学修 饰层在保证基片与生物分T间结合能力(在一定程度上增强)满足生物芯片各类制造工艺和4设备的需求的情况下，其降低荧光信号漫散射的膜系层的设置进一歩提高了生物芯片检测中 的信号强度和灵敏度，降低了荧光在固相介质上信号全向漫散射的状况，使标记生物分子的 荧光信号呈方向性反射并在扫描设备信号收集端(PMT光电倍增管、CCD电耦合矩阵等其它光 电检测设备)获得稳定的高对比度、高信号强度、高灵敏度状态的生物信号，给生物芯片的 使用，尤其是后期的扫描检测以及针对微量材料或微弱荧光信号的检测带来了极大的便捷性 和直观性。本发明的有益效果是，该反射型基片尺寸精确，可以保证对所有生物芯片实验、制造及 应用设备的兼容和支持，光洁、平整、均一的表面，经过高精度研磨抛光达到的10埃德平整 度和超过40/20表面光洁度的标准，2um的平行度，经化学表面修饰后的优秀的可结合性， 及生物反应效率材料荧光惰性和镀膜层形成的强信号反射特性，可将固定杂交后生物分子的 荧光信号实现6 20倍的提升，可用于微量生物分子物质的检测，可减少生物分子物质的使 用，并有效的提升了易用性和采集后信号的直观程度，使信号反馈能力大大加强。
下面结合附图和实施例对本发明进行进一 步的说明。图i是本发明反射型基片的立体示意图。图2是业界已有的基片对荧光信号的反映示意图。图3是与图2相比较的本发明反射型基片对荧光信号的反映示意图。图4是本发明反射型基片以氧化硅和氧化锆为镀膜材料的膜系层设计曲线图。图5是本发明反射型基片以氧化硅和氧化铪为镀膜材料的膜系层设计曲线图。图6是本发明反射型基片以氧化硅和五氧化二钽为镀膜材料的膜系层设计曲线图。图7是本发明反射型基片为氧化硅和金为镀膜材料的膜系层设计曲线图。图8是本发明反射型基片以氧化硅和铝为镀膜材料的膜系层设计曲线图。图中1、反射型基片，101、化学修饰层，102、基底，103、膜系层，104、承载结合生物 分子的化学修饰层。
具体实施方式
本发明是应用于生物领域的一种生物芯片用镜面反射型基片，其将光学中的真空镀膜的 原理与技术融入于生物芯片基片的设计、研发、制造之中，尤其是针对的生物芯片所使用的 花菁类受体荧光标记物Cy3 (激发波长554nm土5nm发射波长568nm土5nm)和Cy5 (激发波长 649nm士5nm发射波长666nra土5nm)为设计立意点，涉及对这两个发射波长区间具有高反射特性的多层膜系层。如图1所示本发明反射型基片1呈长方体状，且实物成透明状，从下 向上依次包括化学修饰层101、基底102、膜系层103和承载结合生物分子的化学修饰层104。所述基底102选用经过大量平行测试而选定的具有低自发荧光、优异光学、物理、化学 及电学性能的高硼硅浮法玻璃，其经过高精度的玻璃冷加工，达到表面抛光后i20④的平整度、 低于10%的表面差异系数的基础上或者更高精度的加工后，再进行真空光学蒸镀向镀制荧光 镜面反射薄膜层即膜系层103，此膜系层103可以降低荧光信号在固相介质上信号全向漫散 射的状况，使标记生物分子的荧光信号呈方向性反射(在各荧光反射区段峰值反射率为66.68% 一99.96%),而同时对荧光发射波长以外的波长区间透过，尤其是检测设备的激发荧光辐射光 源的波长区段形成更为狭窄的反射峰，使生物分子的荧光信号被有效的、具有方向性的反射 向信号收集端，并在扫描设备信号收集端(PMT光电倍增管、CCD电耦合矩阵)获得稳定的高 对比度、高信号强度、高灵敏度状态的生物信号，如图2、图3所示。在对基底102进行真空镀膜的过程中，首先将基底102作清洗处理，之后再干燥，再经 过真空镀膜机(图中未示)，用真空蒸镀工艺可以将含有氧化物类包括氧化硅、氧化钛、氧化 锆、氧化铪、五氧化二钽等的无机材料和铝、银、金等金属材料的介质材料按照需求的信号 反射结果以一定比例单独、混合或组合的多层叠加镀于基底102的表面，而本实施例中所述 膜系层103具体列举了包括厚度精确可调整的低折射率的氧化硅材料镀膜层和高折射率的氧 化锆材料叠加组合、低折射率的氧化硅材料镀膜层和高折射率的氧化铪材料镀膜层的叠加组 合、低折射率的氧化硅材料镀膜层和高折射率的五氧化二钽材料镀膜层的叠加组合、氧化硅 材料镀膜层和金属反射型材料金镀膜层的叠加组合、氧化硅材料镀膜层和金属反射型材料铝 镀膜层的叠加组合。具体例述如下实施方案中SiO,为低折射率材料L (折射率为1.46)， Zr02为高折射 率材料H (折射率为2.008)，将高、低折射率材料分别经真空蒸镀形成镀膜层并以多层互相 叠加组合，形成在设计目标区域内各反射波长区间内具有反射峰的膜系设计结果。经光学方程推导计算得膜系Stack Formula: (HL厂4 L4(HL厂4。H'(ZrO》厚度75.64咖 H2(ZrO》厚度105. 90nmL!(SiO》厚度90. 39nm U(SiO》厚度126. 55nm形成如膜系层设计曲线图4中己给出表示①②两个反射峰的波长图(当然上述膜层厚度 允许一定的浮动，且根据设计标的的不同，各镀膜厚度可以作相应的调整，其他镀膜组合也 具有相似的厚度浮动，下文不再赘述)，从而通过以上高、低折射率材料在不同区间形成透过、 反射峰的叠加，并通过膜层数量组合及各层厚度的控制，确保反射峰值处于Cy3、 Cy5荧光发射波长区间内。保证标记荧光的生物分子在受激光激发的情况下，有效稳定地将发射波长光 反射向接收端。为保证表面的可结合性，在不影响光学性能的前提下膜系层103与承载结合 生物分子的化学修饰层104相结合的最上层是厚度范围为35-115nm的便于进行化学表面修饰 的低折射率的氧化硅层，以为化学修饰中的碱处理及硅烷化、羟基化等提供良好的基底，并 自第二层膜层向下设置H:,(眺)厚度10 20nrn、和L:,(SiO》厚度10 20nm极薄叠加层， 以增加膜系层103的致密程度以实现类固相介质表面性能，通过以上方法促使膜系层103的 可修饰性表面亲疏水性能等影响化学及实际应用效果的特性与无镀膜玻璃固相介质相 一致。实施方案二中，SiO,为低折射率材料L (折射率1.46)， Hf02为高折射率材料H (折射率 2.06)，将高、低折射率材料多层互相叠加组合，形成在设计目标区域内各反射波长区间内具 有反射峰的膜系设计结果。经光学方程推导计算得膜系Stack Formula: (HL厂6 L4(HL)'6。H,(HfO》厚度65. 64nm 仏(肚02)厚度:91. 76nmW(SiO》厚度86. 38咖 U(SiO》厚度120. 93nm形成如膜系层设计曲线图5中已给出表示③④两个反射峰的波长图(同理，上述膜层厚 度允许一定的浮动，且根据设计标的的不同，各镀膜厚度可以作相应的调整)，从而通过以上 高、低折射率材料在不同区间形成透过反射峰的叠加，并通过膜层数量组合及各层厚度的控 制，确保反射峰值处于Cy3、 Cy5荧光发射波长区间内。保证标记荧光的生物分子在受激光激 发的情况下，有效稳定地将发射波长光反射向接收端。同理，为保证表面的可结合性，在不影响光学性能的前提下此方案中膜系层103最上层 仍然设计为35 115nm厚度的Si02层，以为化学修饰中提供良好的基底，并自第二层膜层向 下设置H.,, (Hf02)厚度10 20nm、和L:i(Si02)厚度10 20nm极薄叠加层，以增加膜系层 103的致密程度以实现类固相介质表面性能，通过以上方法促使膜系层103的可修饰性表面 亲疏水性能等影响化学及实际应用效果的特性与无镀膜玻璃固相介质相一致。实施方案二中，采用TaA与SiOr方案，即其中Si02为低折射率材料L (折射率1. 46)， TaA为高折射率材料H (折射率2.22)，将高低折射率材料互相叠加组合，形成在设计目标区 域内各反射波长区间内具有反射峰的膜系设计结果。 经光学方程推导计算得膜系Stack Formula: (HL)飞 1. 3(HL) '4。 H"TaA)厚度65. 24nra H"TaA)厚度:84. 81nm L(SiO》厚度7S.36醒 L2(Si0j厚度:101. 87nm形成如膜系层设计曲线图6 (己给出表示⑤⑥两个反射峰的波长图)，从而通过以上高低折射率材料在不同区间形成透过、反射峰的叠加，并通过膜层数量组合及各层厚度的控制， 确保反射峰值处于Cy3、 Cy5荧光发射波长区间内。保证标记荧光的生物分子在受激光激发的 情况下，有效稳定地将发射波长光反射向接收端。同理为保证表面的可结合性，在不影响光学性能的前提下此方案中膜系层103最上层仍 然设计为35 115nm厚度的Si02层，以为化学修饰中提供良好的基底，并自第二层膜层向下 设置H, (T咸)厚度10 20iim、和L(SiO》厚度10 20nm极薄叠加层，以增加膜系层103 的致密程度以实现类固相介质表面性能，通过以上方法促使膜系层103的可修饰性表面亲疏 水性能等影响化学及实际应用效果的特性与无镀膜玻璃固相介质相一致。实施方案四中，采用Au与Si02方案，即其中Si02为低折射率材料L (折射率1. 46)， Au 为金属反射型材料H，其叠加组合，形成在设计目标区域内各反射波长区间内具有反射峰的 膜系设计结果。经光学方程推导计算得双层膜系-H,(Au)厚度110.00nm L,(SiO》厚度55. OOnm形成如膜系层设计曲线图7中(己给出表示⑦⑧两个反射区间点的波长图)，从而通过以 上金属材料在不同区间形成阶梯反射区间，并通过膜层数量组合及各层厚度的控制，确保反 射峰值处于Cy3、Cy5荧光发射波长区间内。保证标记荧光的生物分子在受激光激发的情况下， 有效稳定地将发射波长光反射向接收端。同理，为保证表面的可结合性，在不影响光学性能的前提下此方案中膜系层103最上层 仍然设计为35 115nni厚度的Si(^层，以为化学修饰中提供良好的基底，即为化学修饰中的 碱处理及羟基化提供良好的基底，通过以上方法促使其膜系层103的可修饰性等特性与无镀 膜玻璃固相介质相一致。头'施方案五中，采用Al与Si02方案，S卩，其中Si(X为低折射率材料L (折射率1.46)， A].为金属材料H (折射率0.82)，其叠加组合，形成在设计目标区域内各反射波长区间内具 有反射峰的膜系设计结果。 经光学方程推导计算得双层膜系 H,(A1)厚度:700.00nra L,(Si02)厚度55. OOnm形成如膜系层设计曲线图8中(己给出表示⑨⑩两个反射区间点的波长图)'从而通过以 上金属材料在不同区间形成阶梯反射区间，并通过膜层数量组合及各层厚度的控制，确保反 射峰值处于Cy3、Cy5荧光发射波长区间内。保证标记荧光的生物分子在受激光激发的情况下'有效稳定地将发射波长光反射向接收端。8同理，为保证表面的可结合性，在不影响光学性能的前提下此方案中膜系层103最上层 仍然设计为35 115nm厚度的Si(^层，(应用离子源设备)，以为化学修饰中的碱处理及羟基 化提供良好的基底，通过以上方法促使其膜系层103的可修饰性等特性与无镀膜玻璃同相介 质相一致。上述方案其性能分析如下当选用材料为氧化物类介质材料(包括氧化硅、氧化钛、氧 化铪、氧化锆、五氧化二钽等)，其具有性能稳定、颗粒较细、成膜牢固度高、耐损伤、耐腐 蚀等特点，且平行比对测试结果表明，高低折射率材料氧化锆、氧化硅组合；氧化铪、氧 化硅组合；氧化铪、氧化钛、氧化硅组合；氧化锆、氧化钛、氧化硅组合等，根据膜系方程 与条件设计，均可得到如图4-图8的实测效果，实现反射率指标，并能在膜层厚度上得到有 效保证，且可有效控制本发明反射型基片的表面的亲疏水程度，保证后续化学表面修饰工艺 稳定、高密度地进行，实现生物芯片表面优越的结合能力。上述如图4、图5所示标注①、 ②的膜系层设计透过率曲线所示的即为以氧化硅与氧化锆为镀膜材料，结合其各自高低折射 率特性而设计、镀制的针对荧光应用区间的反射膜系层实测数据。而标注(D、④的膜系层设 计透过率曲线所示的即为以氧化硅与氧化铪为镀膜材料，结合其各自卨低折射率特性而设计、 镀制的针对荧光应用区间的反射膜实测数据。其它所述氧化物类介质材料的镀膜材料组合， 亦均可以实现了以上设计要求，其透过率及其它性能与图4-图6—致，以应用于对表面如亲 疏水性能、结合能力等要求变化的需求情况中，因此上述氧化物类介质材料镀膜组合都在本 专利的保护范围之内(在此不再赘述)。当然选用材料也可以为纯贵金属类材料(如金、铝、铂、钯、银等)，其具有性能稳定、颗粒较细、成膜牢固度高、耐损伤、耐腐蚀等特点，在膜系层设计中，均只用其中一类材料构建反射薄膜，实现反射率性能在80%左右的金属反射膜层。可实现大区段情况F的反 射(如介于波长520nm 680nm区间)，实测性能符合技术设计要求。应用机理与前一方案相 同。因此上述金属类介质材料镀膜组合或者氧化物类介质材料和金属类介质材料的混合镀膜 组合都在本专利的保护范围之内(在此不再赘述)。本发明中膜系层103的厚度范围为100-2000nm，其可根据镀膜材料、荧光发射波段类型 的不同来做相应的调整。真空镀膜流程完成后，半成品的反射型基片1即可进入化学修饰阶 段，对上述半成品的反射型基片1进行包括硅烷化、凝胶溶胶涂布、高分子聚合物修饰、生 物素等的化学修饰处理。所述硅垸化处理包括氨基、醛基、环氧基、巯基处理，所述凝胶溶 胶涂布包括硝化纤维膜、聚丙烯酰胺、环氧基-PEG处理等。 现以氨基硅垸化处理为例91) 将上述经过镀膜的半成品的反射型基片1放入充满氢氧化钾/氢氧化锂的反应槽中浸泡；2) 取出后使用去离子水冲洗干净；3) 再放入充满甲醇、浓盐酸混合液的温控反应槽中浸泡；4) 去离子水冲洗干净，真空干燥箱(图中未示)将其干燥；5) 继续将半成品的反射型基片l放入温控反应槽(图中未示)中浸泡，温控反应槽内含 有纯丙酮稀释的硅垸化试剂3-氨基丙基二甲氧基硅烷(APS)等化学试剂以形成与基底102 紧密结合的化学修饰层101和与膜系层103紧密结合的承载结合生物分子的化学修饰层104， 其能承载结合生物分子如DNA、 RNA、蛋白等，可以满足生物芯片的各类制造工艺和设备的需 求。6) 真空干燥箱将其干燥，至此本发明反射型基片1的生产流程宣告结束。总之，本发明反射型基片1由于膜系层103及与膜系层103紧密结合的承载结合生物分 子的化学修饰层104的存在，使的该反射型基片1在一定程度上增强了与生物分子间的结合 能力，满足生物芯片各类制造工艺和设备的需求且可以有效的解决荧光信号的漫反射的问题， 使之形成方向性镜面反射，从而提高了信号的强度和灵敏度，给生物芯片的使用，尤其是后 期的扫描检测以及针对微量材料或微弱荧光信号的检测带来了极大的便捷性和直观性。10
权利要求
1.一种反射型基片，其是应用于生物领域的一种生物芯片用镜面反射型基片，其包括基底和位于基底上方的承载结合生物分子的化学修饰层，其特征是所述基底和位于基底上方的承载结合生物分子的化学修饰层之间设有降低荧光信号漫散射的膜系层。
2. 根据权利要求l所述的反射型基片，其特征是所述膜系层的厚度范围为100-2000ran。
3. 根据权利要求l所述的反射型基片，其特征是所述膜系层中包括厚度精确可调整的低折射率材料镀膜层和高折射率材料镀膜层的叠加组合。
4. 根据权利要求1所述的反射型基片，其特征是所述膜系层为氧化硅镀膜层和五氧化二钽或氧化锆镀膜层的叠加组合或氧化硅镀膜层和金属材料的金或铝镀膜层的叠加组合。
5. 根据权利要求1所述的反射型基片，其特征是所述膜系层中可以包括氧化硅、氧化 钛、氧化锆、氧化铪、五氧化二钽、铝、银、金等无机材料、金属材料。
6. 根据权利要求1所述的反射型基片，其特征是所述膜系层是在对基底材料进行高精 度冷加工的基础上进行真空光学蒸镀而镀制的荧光镜面反射膜系层。
7. 根据权利要求1所述的反射型基片，其特征是所述膜系层还设有若干增加膜系层致密程度以实现类固相介质表面性能的10 20mn低折射率材料镀膜层和高折射率材料镀膜 层的极薄叠加层。
8. 根据权利要求1所述的反射型基片，其特征是所述膜系层与承载结合生物分子的化 学修饰层相结合的最上层是厚度范围为35-115nm的便于进行化学表面修饰的低折射率的 氧化硅层。
9. 根据权利要求1所述的反射型基片，其特征是所述位于基底上方的承载结合生物分 子的化学修饰层是与膜系层紧密结合的、并以化学表面修饰工艺对膜系层的上表面进行碱 处理、硅垸化处理、凝胶溶胶涂布、高分子聚合物修饰、生物素处理等工艺而形成的。
10. 根据权利要求9所述的反射型基片，其特征是所述硅垸化处理包括氨基、醛基、环氧基、巯基处理，所述凝胶溶胶涂布包括硝化纤维膜、聚丙烯酰胺、环氧基-PEG处理等。
全文摘要
本发明公开了一种反射型基片，其是应用于生物领域的一种生物芯片用镜面反射型基片，其包括基底和位于基底上方的承载结合生物分子的化学修饰层，所述基底和位于基底上方的承载结合生物分子的化学修饰层之间设有降低荧光信号漫散射的膜系层。反射型基片的承载结合生物分子的化学修饰层在保证基片与生物分子间结合能力(在一定程度上增强)的情况下，其降低荧光信号漫散射的膜系层的设置进一步提高生物芯片检测中的信号的强度和灵敏度，解决荧光在固相介质上信号全向漫散射的状况，使标记生物分子的荧光信号呈方向性反射并在扫描设备信号收集端(PMT光电倍增管、CCD电耦合矩阵)获得稳定的高对比度、高信号强度、高灵敏度状态的生物信号。
文档编号C12Q1/68GK101323879SQ20081004050
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者波 张, 莹 童, 琦 陈 申请人:上海点亮基因科技有限公司