的 亲核官能团包括但不限于硫醇基团、氨基、羟基和CO-NH-NH2基团。合适的亲电子官能团包 括但不限于丙烯酸酯基团、乙烯砜基团和N-羟基琥珀酰亚胺基团。碱性激活缓冲液可通过 亲核官能团的去质子化来催化聚合物链交联以加快迈克尔类型的加成反应。
[0075] 根据所公开的主题的一些实施方式，聚合物链交联于离体条件下起始并于体内进 行至完成，即在制剂所递送的体内空间中。在聚合物间聚合（交联）开始后，施用混合物至 体内空间，在此空间内完成交联反应以形成交联的组合物。在另外的实施方式中，可以形成 仍可被注射器挤出的低度交联的PEG并随后与生物治疗剂混合。随后，可以通过与第二种 激活缓冲液混合来实现进一步的交联。以这种方式混合将使得生物治疗剂和PEG聚合物链 上的功能团之间的接触时间最小，并且碱性激活缓冲液使得生物治疗剂的负载更大，并且 进一步使生物治疗剂的活性的保留提高了。
[0076] 根据所公开的主题的一些方面，通过注射器混合将溶液中的制剂与激活缓冲液混 合。在此方面，已令人惊奇地证明了，在某些非限制性实施方式中，注射器混合的具体程度 与所期望的沉淀物尺寸和释放曲线相关。例如并且如图6所示，在一些实施方式中，通常使 用在约3秒至约10秒的恒定柱塞冲程（consistent plunger strokes)(例如约5至15的 柱塞冲程）的注射器混合将导致所期望的沉淀物尺寸和均匀性，而混合更长时间（例如30 或更多柱塞冲程）与大的粘性沉淀物以及损失生物治疗剂相关。各种合适的注射器都可用 于混合，这包括用母对母Luer配件相连接的Iml Becton Dickinson注射器。通过提供了大 致等量的总剪切力和大致等量的制剂暴露于剪切力的时间的混合方法获得了类似的结果。 在一些实施方式中，直径在50nm至10 μ m范围内的生物治疗剂沉淀物与上述所期望的再溶 解和释放曲线相关。在一些实施方式中，提供了尺寸高达250 μπι的生物治疗剂沉淀物。在 一些实施方式中，通过涡旋或重复翻转制剂和激活缓冲液的混合物进行混合。
[0077] 根据所公开的主题的另一方面，在存在生物治疗剂的情况下，通过多个亲水性聚 合物链的聚合物间聚合，将形成交联的组合物。根据所公开的主题，在交联后可以选择多个 亲水性聚合物链以优化交联的组合物的特性。例如，交联的组合物的交联密度将受聚合物 链的分子量、胶凝反应的持续时间（即"胶凝时间"）、PEG臂的数量、PEG聚合物链上存在的 官能团和在聚合物间交联前溶液中的PEG固体的浓度影响。悬浮缓冲液的pH、悬浮缓冲液 的添加剂和用于催化聚合物间交联的激活缓冲液也将影响胶凝时间、交联密度和所获得的 生物治疗剂的沉淀物尺寸。通常，交联密度将随着更低分子量的聚合物、每亲水性聚合物链 中更高比例的PEG臂、溶液中更高浓度的PEG固体和更高的激活缓冲液pH而增加。交联的 组合物的交联密度将是其与生物治疗剂相关的释放曲线的决定因素。
[0078] 通过举例的方式，并如图3A和图3B中所示，改变4-臂PEG与8-臂PEG的比例和 改变制剂的PEG固体的重量与体积比将改变交联的组合物的受控释放曲线。如所示，每个 交联的组合物提供了所期望的受控释放和持续时间，但可以根据生物治疗剂、适应症、递送 部位和其它考虑因素优化此类释放。此外，如实施例13所讨论并如图5所示，通过调整亲 水性聚合物的重量百分比和生物治疗剂与亲水性聚合物的重量比，生物治疗剂的沉淀物的 尺寸将得以调整，并具有对交联的制剂的释放曲线的伴随影响。
[0079] 已令人惊奇地发现，在存在PEG的情况下，通过在蛋白沉淀之时或之后交联PEG聚 合物链到交联的组合物网络中，蛋白质得以保护，未受其与PEG聚合物链的官能团的共价 相互作用的影响，并且在再溶解之后保持了其生物活性。此外，通过提供用于交联催化的激 活缓冲液，使得在PEG聚合物链之间实现相对快速的交联，从而使蛋白的反应性的暴露于 溶剂的残基（包括例如胺基）与PEG聚合物的交联官能度（包括例如丙烯酸酯基团）反应 的机会最小化。此外，可以选择PEG聚合物链的交联官能度以使蛋白的暴露于溶剂的残基 的共价修饰最小化。例如，当蛋白质的特征为高比例的不参与二硫键键合的半胱氨酸残基， 具有交联官能度如胺基的PEG聚合物链可优于具有交联官能度如硫醇基团的PEG聚合物 链，以最小化在生物治疗剂和PEG聚合物链之间二硫键的形成。
[0080] 亲水性聚合物链交联后，所得到的交联的组合物将吸收水。当交联的组合物吸收 水时，其会溶胀且其体积也会增大。当交联的组合物的体积增大时，沉淀的生物治疗剂会再 溶解并扩散出聚合物的基质。此外，水会水解交联的组合物的组分聚合物之间的硫醚酯键， 导致进一步释放生物治疗剂。进一步，生物治疗剂可以降低平衡水的吸收，从而进一步阻止 交联的组合物的显著溶胀。所形成的交联的组合物可以具有互相贯通的或半互相贯通的网 络结构。
[0081] 除了交联的组合物的释放曲线，也可以优化组合物的另外的参数以适合于递送至 体内空间如关节内空间。例如，可以考虑交联的组合物的粘弹性和弹性系数以最大化患者 的舒适性。交联的组合物的最终最大体积（这将取决于其在体内的溶胀比）将限制可被递 送到体内空间中的制剂的总量。此外，由于所形成的聚合物组合物由亲水性聚合物链组成， 其在体内是可再吸收的，这允许将交联的组合物重复施用至体内的同一空间中。
[0082] 图4A示出了交联的组合物的溶胀和生物治疗剂释放之间的关系。从并行曲线中 显而易见的是，溶胀和生物治疗剂的释放平行发生。此外，图4B提供了时间与在体外的各 种交联组合物的可见溶解。如所讨论，可以调整多个变量以实现所期望的交联的组合物的 所期望的溶解速率。
[0083] 2.生物治疗剂沉淀物的尺寸和同质性
[0084] 根据本文所公开的主题，具有亲水性聚合物的生物治疗剂的制剂在交联的亲水性 聚合物基质中产生了生物治疗剂的沉淀物。这些沉淀物在从聚合物基质扩散并再溶解后令 人惊奇地保留了它们的结构和功能。基于所使用的具体的制剂、混合力度和持续时间、所选 择的生物治疗剂、悬浮液和激活缓冲液的pH和其它变量，沉淀物的尺寸将会变化。例如，并 如图5所示，增加 PEG固体的比例和生物治疗剂的浓度与较大的沉淀物尺寸相关。在25% 的PEG固体和以上，也观察到生物治疗剂的沉降。
[0085] 此外，如图6A-D所示，混合的程度也将影响产生的生物治疗剂沉淀物的尺寸。如 所示，通过5至15柱塞冲程的混合与较小的沉淀物相关，而用30柱塞冲程的混合与较大 的、较粘的沉淀物相关。当在一些实施方式中优选的沉淀物尺寸在50nm至10 μπι之间时， 可以形成高达250 μπι的沉淀物尺寸。沉淀物尺寸的偏好将主要取决于生物治疗剂，这包括 其适应症、其效价和其药物代谢动力学。较大的沉淀物通常与局部的以及较少程度上的全 身浓度的波峰和波谷相关，相对于较小且较均匀的沉淀物。
[0086] 如由图6A-D进一步地所示，沉淀物的同质性还受混合程度以及亲水性聚合物链 的组成影响。如图6B(10% PEG固体）和图6D(20% PEG固体）所示，形成比4-臂PEG更 致密的交联的亲水性链网络8-臂PEG通常与比如图6A(10% PEG固体）和图6C(20% PEG 固体）所示的4-臂PEG更大程度的沉淀物尺寸和分布的均匀度相关。
[0087] 出于说明的目的，图7提供了通过制剂并根据如下述实施例4所述的方案可以 实现的沉淀物尺寸。使用来自 Nanosight 的 Nanoparticle Tracking Analysis Version 2. 2Build 0366测定沉淀物尺寸。提供了直径为约50nm至约400nm的生物治疗剂沉淀物。 如所示，沉淀物的尺寸具有一般的高斯分布。在进一步的实施方式中，提供了直径为约50nm 至约IOym的生物治疗剂沉淀物。在更进一步的实施方式中，提供了直径为约ΙΟμπι至约 250 μπι的生物治疗剂沉淀物。
[0088] III.交联的组合物的用途
[0089] 1.受控释放
[0090] 所公开的主题的交联的组合物适用于递送到体内的各种空间，这包括头和器官的 窦腔（sinus cavity)、长骨的髓质、胸内和腹膜内空间、血管内腔、外分泌导管、眼内（例如 玻璃体内）空间和关节内空间。出于说明而非限制的目的，在下文中对根据本文所公开的 主题的交联的组合物递送至体内关节内空间或眼内空间作出参考。从关节内空间到血浆的 滑液流通是相对迅速的。其结果是，可溶性生物治疗剂递送至关节内空间并不能有效地使 关节内浓度最大化且使全身浓度最小化，尤其是对具有相对长的半衰期的治疗剂。这种现 象示于图8A和图8B中。如所示，在t。时将未配制的（即封装的非聚合物基质）单克隆抗 体注入关节内空间并监测关节内浓度和全身浓度。在12小时内，抗体的局部（关节内）浓 度减少了两个数量级，降至与在血浆中发现的大致相同的浓度，此时全身性暴露未被控制。 玻璃体内的流体流通也是相当高的，而且更重要地，眼部被血眼屏障隔离出全身循环，这抑 制了药物全身递送至眼部。
[0091] 相比之下，并与所公开的主题的一个方面一致，本文所公开的制剂表现出了在生 物治疗剂的局部递送上十分有利的释放曲线。出于说明而非限制的目的，此类释放曲线可 以由"突释"（burst)表征或由24小时内通过施用交联的组合物至体内空间所递送的一定 比例的总生物治疗剂的相对快速的释放表征。这样的"突释效应"示于图9A，其示出了生物 治疗剂的短期释放是受控的。该减少了的突释效应降低了全身暴露。【具体实施方式】的释放 曲线可以进一步由给药头七天内所施用的总生物治疗剂的最大比例的初始释放所表征。在 进一步的实施方式中，释放曲线可以由生物治疗剂从交联的组合物基质释放到体内空间中 的延长的持续时间所表征。
[0092] 在所公开的主题的另外的实施方式中，释放曲线是三相的，其具有在约0至30天 之间的第一期间的第一释放速率，在约〇至30天的第二期间的第二释放速率，以及在约0 至30天的第三期间的第三释放速率。在一些优选的实施方式中，三相释放曲线中的至少一 个相将呈现近似线性或零级释放动力学，即生物治疗剂的释放速率在相的持续期间是大致 相同的。根据所公开的主题的一个方面的三相释放曲线示于图9B。如所示，三相释放曲线 提供了持续30至90天的稳定且延长的生物治疗剂的释放。如下所讨论地，此类释放曲线 导致了生物治疗剂的较高的局部浓度并降低了全身浓度（相对于施用未配制的生物治疗 剂）。表1提供了提供所述释放曲线的示例性制剂的非限制性列表，其提供了如本文所公开 的交联的组分的各种组分的详细说明。在一些非限制性实施方式中，获得了根据表2的药 物代谢动力学结果。
[0093] 如本文所公开的，"突释效应"是指在施用交联的组合物后第一个24小时内从交 联的组合物释放到体内空间的生物治疗剂的比例。出于说明而非限制的目的，突释效应可 以表示所递送的总生物治疗剂的约〇. 1%至所递送的总生物治疗剂的约30%的释放。在一 些实施方式中，突释效应是所递送的总生物治疗剂的约1%至约10%之间。在进一步的实 施方式中，突释效应是约10%至约20%之间。在进一步的实施方式中，突释效应是在20% 至30%之间。如本文所公开的，术语"初始累积释放"是指在施用后头七天内从交联的组 合物释放到体内空间中的生物治疗剂的比例，这包括在第一个24小时内释放的比例。在一 些实施方式中，初始释放可以表示少于10%的所递送的总生物治疗剂。在另外的实施方式 中，初始释放构成了 10%至20%的所递送的总生物治疗剂。在一些实施方式中，初始释放 是在20%至30%之间。在更进一步的实施方式中，初始释放是在约30%至40%之间。如 本文所公开的，"三相释放曲线"是指生物治疗剂的释放曲线，即生物治疗剂随时间从交联 的组合物中释放的比例的曲线图，其具有3个可辨别的明确持续时间的释放速率。图9B提 供了根据本文所公开的主题的示例性的非限制性的三相释放曲线。
[0094] 由所公开的主题的制剂提供的受控释放使得显著改善了生物治疗剂递送的药物 动力学端点。降低了总的和最大的全身暴露，而在整个释放持续时间内最大化局部浓度，从 而将治疗功效最大化并将不希望的副作用最小化。这些改善的药物动力学示于图10。如所 示，在递送根据所公开的主题的包括ABT-308的制剂后，生物治疗剂（单克隆抗体）的全身 浓度被最小化，而维持关节内浓度14天。此外，如表3所示，滑液中的生物治疗剂的浓度与 生物治疗剂的浓度的平均比率大于100。如图8A中所示，这些药物动力学端点表示了与未 配制的抗体相比非常显著的改善。
[0095] 2.生物治疗剂的全身浓度与局部浓度的比率
[0096]