个月。
[0138]应当注意，本发明的各方面之一的上下文中所述的实施方案和特征也适用于本发明的其它方面。
[0139]本申请中引述的所有专利和非专利文献整体引入本文作为参考。
[0140]现在在如下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
[0141]实施例1一一成骨细胞的胶原蛋白合成
[0142]通过如Declercq等人在2004年所述的酶消化从新生Wistar大鼠的烦盖中分离原代成骨细胞。在所有实验期间，将细胞在5% C02和37°C的条件下维持在含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的α -最小必需培养基中。将细胞以3500个细胞/孔的密度接种在Coll-1-包被的96-孔培养板上或以3X 14个细胞/孔的密度接种在24-孔培养板上，在a -MEM中培养2天以达到汇合。然后使细胞暴露于不同条件:最小培养基(C-)、包含50 μ g/ml抗坏血酸、5mM β -磷酸甘油的最小培养基(C+ ;优化培养基)和补充有I μ M齐墩果苷(OLP)或/和I μ M羟基酪醇(HTy)或/和10 9M I, 25 二羟基维生素D3 (I, 25 (OH) 2D3)的最小培养基。将OLP和HTy溶于二甲亚砜(DMSO)，将1，25 (OH) 2D3溶于乙醇。DMSO和乙醇在培养基中的终浓度各自为0.1 %。每2天改变培养基。
[0143]9天后，使用来自B1color的Sircol测定法测定细胞胶原蛋白含量。这种Sircol胶原蛋白测定法是定量结合染料方法，设计该方法是为了分析体外培养期间从哺乳动物组织和细胞提取的胶原蛋白。染料试剂特异性地结合哺乳动物胶原蛋白中发现的[Gly-X-Y]。螺旋结构(ι-ν型)。
[0144]图1显示了响应于1，25 (OH) 2D30LP和HTy组合的刺激的培养9天后的成骨细胞的胶原蛋白合成，通过相对于每毫克总蛋白质而言的所产生的胶原蛋白的微克数测定。
[0145]I, 25 (OH) 2D3 = 10 9M I, 25 二羟基维生素 D3 ；0LP = I μΜ 齐墩果苷；HTy = I μΜ羟基酪醇；C+ =优化培养基用作阳性对照。
[0146]数据表示为平均值土SEM(重复3次)。统计学:克-瓦二氏(Kruskal Wallis)检验，然后是曼-怀二氏(Mann Whitney) U 检验(双尾)，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001，对比于阴性对照(C-)。
[0147]如图1所示，I, 25 (OH) 2D3、OLP和HTy的组合的添加在培养9天后显著刺激了成骨细胞的细胞胶原蛋白合成。
[0148]实施例2—一成骨细胞的碱性磷酸酶活性
[0149]通过如Declercq等人在2004年所述的酶消化从新生Wistar大鼠的烦盖中分离原代成骨细胞。在所有实验期间，将细胞在5% C02和37°C的条件下维持在含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的α -最小必需培养基中。将细胞以3500个细胞/孔的密度接种在Coll-1-包被的96-孔培养板上或以3X 14个细胞/孔的密度接种在24-孔培养板上，在a -MEM中培养2天以达到汇合。然后使细胞暴露于不同条件:最小培养基(C-)、包含50 μ g/ml抗坏血酸、5mM β -磷酸甘油的最小培养基(C+ ;优化培养基)和补充有I μ M齐墩果苷(OLP)或/和I μ M羟基酪醇(HTy)或/和10 9M I, 25 二羟基维生素D3 (I, 25 (OH) 2D3)的最小培养基。将OLP和HTy溶于二甲亚砜(DMSO)，将1，25 (OH) 2D3溶于乙醇。DMSO和乙醇在培养基中的终浓度各自为0.1 %。每2天改变培养基。
[0150]在处置第0、5、9、12和15天时以动态方式测定碱性磷酸酶(ALP)的酶活性。用PBS将成骨细胞冲洗2次，然后在干冰上冷冻。然后通过冷冻-融化循环裂解细胞并且匀化入200 μ I IM 二乙醇胺和0.24mM氯化镁缓冲液pH 9.8 (ALP缓冲液)中。将细胞裂解物(10 μ I)加入到200 μ I 6mg/ml磷酸对硝基苯酯(p_NPP)在ALP缓冲液中的溶液中。使用Var1Sklan Flash微量培养板读板器在405nm和30°C测定吸光度，每2分30秒测定I次，持续30分钟。ALP活性表示为微摩尔p-NPP/小时/毫克蛋白质。根据Bradford的方法，使用Quick Start B1Rad蛋白质测定法进行了蛋白质测定。
[0151]图2显示了响应于I，25 (OH) 2D3、OLP和HTy组合的培养9天后的碱性磷酸酶(ALP)活性，由微摩尔ALP/毫克蛋白质/小时表示。
[0152]C-=最小培养基用作阴性对照；1，25 (OH) 2D3 = 10 9M I, 25 二羟基维生素D3 ；0LP=I μΜ齐墩果苷；HTy = I μΜ羟基酪醇；C+ =优化培养基用作阳性对照。
[0153]数据表示为平均值土SEM。统计学:克-瓦二氏(Kruskal Wallis)检验，然后是曼-怀二氏(Mann Whitney)U 检验(双尾)，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001，对比于阴性对照(C-) O
[0154]图2进一步证明:1，25 (OH) 2D3、OLP和HTy的组合的添加在培养9天后显著刺激了成骨细胞的细胞胶原蛋白合成。
[0155]图3-6显示了在时程模型中在单独或组合的1，25 (OH) 2D3、齐墩果苷(OLP)、羟基酪醇(Hyt)的存在下培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
[0156]C-=最小培养基用作阴性对照；1，25 (OH) 2D3 = 10 9M I, 25 二羟基维生素D3 ；0LP=I μΜ齐墩果苷；HTy = I μΜ羟基酪醇；C+ =优化培养基作为阳性对照。
[0157]数据表示为平均值土SEM。统计学:克-瓦二氏(Kruskal Wallis)检验，然后是曼-怀二氏(Mann Whitney)U 检验(双尾)，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001，对比于阴性对照(C-) O
[0158]结论
[0159]正如可以从图3所示的数据看出的那样，添加维生素D3自身确实在第15天诱导了小的、但是具有统计学显著性的AP活性增加，指示成骨细胞活性和骨形成和/或软骨合成代谢。按照相同方式，添加HT自身或OLP自身在第15天也引起了小的增加，与维生素D3的作用相当(参见各附图)。
[0160]组合HT和OLP 二者确实也增加了成骨细胞活性(同样在第15天观察)，但是不像将维生素D与HT或OLP组合所增加的那样多。与对照具有统计学显著性差异的唯一的点仍然是第12天和第15天。在第5天和第9天的较早的测量与阴性对照相比没有统计学差升。[0161 ] 因此，所提供的数据解释说明了添加维生素D的两种作用。首先，维生素D连同HT和OLP中的一种或两种的添加增加了成骨细胞响应。这在与例如第15天的水平的比较中观察到。
[0162]其次，维生素D连同HT和OLP中的一种或两种的添加早于后者引起了成骨细胞活性。结论如下:维生素D的添加导致了更早的响应和更强的响应。得出如下结论:维生素D的添加增强了 OLP和/或HT引起的骨形成和/或软骨合成代谢响应。
【主权项】
1.用于增强一种或多种多酚对骨形成和/或软骨合成代谢的作用的应用的包含维生素D的组合物。2.权利要求1的应用，其中所述多酚是齐墩果苷和羟基酪醇中的一种或多种。3.包含维生素D和一种或多种多酚的组合物，用于增强所述多酚对骨形成和/或软骨合成代谢的刺激的应用。4.权利要求3的用于应用的组合物，其中所述多酚包含齐墩果苷和羟基酪醇中的一种或多种。5.权利要求3-4任一项的用于应用的组合物，其中所述多酚包含齐墩果苷和羟基酪醇。6.权利要求5的用于应用的组合物，其中该组合物包含800-1200IU维生素D、0.0lmg-1g齐墩果苷和0.0lmg-1g轻基酪醇。7.权利要求1-2或3-6任一项的用于应用的组合物，其中该组合物包含一种或多种另外的生物活性分子，例如抗氧化剂、抗炎化合物、脂肪酸、益生元纤维、益生菌、葡糖胺、硫酸软骨素、矿物质、痕量元素和/或维生素。8.权利要求7的用于应用的组合物，其中该组合物包含矿物质钙和/或镁。9.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述应用靶向于老龄化群体、特别是老年患者。10.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述应用是通过增强骨形成和/或软骨合成代谢的刺激而用于治疗、缓解和/或预防与骨形成和/或软骨合成代谢与骨吸收之间的关系失衡相关的病症。11.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述应用用于维持和/或改善运动性。12.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述应用用于改善骨强度。13.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述病症选自骨质疏松症、佩吉特病、在接近假体处观察到的骨丢失或骨质溶解、转移性骨疾病、甲状腺功能亢进、归因于癌症的高血钙、多发性骨髓瘤、牙周疾病、骨关节炎、由骨折或骨折愈合造成的骨缺损。14.权利要求13的用于应用的组合物，其中所述病症是骨质疏松症。15.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述组合物是营养组合物。16.前述权利要求任一项的用于应用的组合物，其中所述组合物每日施用至少一次，持续至少2个月、优选至少3个月的时间期。17.药物组合物，包含维生素D和一种或多种多酚。18.治疗、缓解和/或预防与骨和/或软骨代谢失衡相关的病症的方法，所述方法包括给需要其的个体施用有效量的维生素D与一种或多种多酚的组合。
【专利摘要】本发明涉及组合物的用于维持骨和/或软骨健康或者预防、缓解和/或治疗骨和/或软骨病症的应用。
【IPC分类】A61K31/592, A61K31/05, A61K31/593, A61P19/08, A61P19/10, A61K31/351
【公开号】CN105050591
【申请号】CN201480018027
【发明人】M·N·奥卡亚达, F·门布雷兹, 卡万 E·奥佛德
【申请人】雀巢产品技术援助有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年4月2日
【公告号】CA2907869A1, WO2014161872A1