[0155] 2. 5 BART6-3p低表达的胃癌患者预后较差
[0156] 我们对胃癌组织中BART6-3p的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析， 发现胃癌中BART6-3p的表达与胃癌患者的预后密切相关，BART6-3p高表达（High)的患者 生存时间要明显长于BART6-3p低表达（Low)的患者（图7)。
[0157] 实施例3,过表达BART6-3p抑制肿瘤细胞的生长增殖及侵袭转移
[0158] 1.材料方法
[0159] 1.1细胞培养与转染
[0160] EBV阴性的鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心，细 胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司 产品。
[0161] BART6-3p由Invitrogen公司通过化学合成法合成，序列为：
[0162] CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA
[0163] 将生长状态良好的肿瘤细胞系按2X 105个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置 于37°(：，5%〇)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始84訂6-3?的转染；转 染过程如下：
[0164] 在无菌EP管中加入8 μ 1的Hiperfect转染试剂（Qiagen公司产品）于100 μ 1 无血清培养基中混匀静置5min ;
[0165] 将BART6-3p加入100 μ 1无血清培养基中；然后与上述包含Hiperfect转染试剂 100 μ 1无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使它们形成复合体；
[0166] 用D-Hank' s液洗涤细胞3次；
[0167] 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板 中的1个孔；
[0168] 将6孔板置于C02培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续 培养48小时。
[0169] 1. 2实时定量PCR检测BART6-3p表达的效果：
[0170] 细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时荧光定量PCR法检测BART6-3p的表达， 方法和步骤同实施例1。
[0171] 1.3细胞增殖实验
[0172] MTT实验[3_ (4, 5-dimethylthiazole_2-yl)-2. 5-dipheny-tetrazolium bromide assay]是检测肿瘤细胞增殖的常用手段，具体实验步骤如下：
[0173] 1)将细胞消化，计数，每孔接种500个细胞于96孔板中，每天需要设置5个复孔最 后求平均值，一共设置5天；
[0174] 2)放置培养箱培养至少5小时，待细胞贴壁后，加 MTT液（5mg/ml)20yl。继续培 养4小时，弃去培养液。每孔加入200 μ 1 DMS0,摇床上放置10分钟；
[0175] 3)选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上，测定各孔吸光度值并记录结果，此后每 隔24小时重复步骤2,记录一次数值，共计检测5天；
[0176] 4)实验重复三次。以各时间点为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制MTT曲线。
[0177] 1.4细胞划痕实验
[0178] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迀移能力的实验方法。转染了 BART6-3p或对照 (scramble)序列的鼻咽癌或胃癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90 %时，用200ul pipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各个时间 点（视不同细胞迀移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迀移 速度。
[0179] 1.5细胞穿膜实验
[0180] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国BD公司，4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液 (0· 1% g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水 化。
[0181] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1 X 105个转染了 BART6-3p或对 照（scramble)序列的鼻咽癌或胃癌细胞，在Transwell小室下层加入含20%胎牛血清的培 养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉 上层未迀移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的肿瘤细胞。
[0182] 2.结果
[0183] 2. 1转染BART6-3p后，肿瘤细胞中BART6-3p的表达水平显著升高
[0184] 在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS中转染BART6-3p后，BART6-3p 在鼻咽癌和胃癌细胞中的表达均显著升高（图8)，表明BART6-3p转染成功。
[0185] 2. 2转染BART6-3p后肿瘤细胞增殖速度减慢
[0186] MTT细胞增殖实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞系AGS中转入 BART6-3p后，3株肿瘤细胞的生长增殖速度均明显减慢（图9)。
[0187] 2. 3转染BART6-3p后细胞迀移能力减弱
[0188] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入BART6-3p 后3株肿瘤细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞 运动迀移能力降低（图10)。
[0189] 2. 4转染BART6-3p后细胞侵袭能力降低
[0190] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中 转入BART6-3p后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力减弱（图 11) 〇
[0191] 实施例4,过表达BART6-3p抑制肿瘤细胞中IncRNA基因 L0C553103的表达
[0192] 1.材料方法
[0193] 1.1细胞培养与转染
[0194] EBV阴性的鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心，细 胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司 产品。
[0195] BART6-3p由Invitrogen公司通过化学合成法合成，序列为：
[0196] CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA
[0197] 在肿瘤细胞中转染BART6-3p的方法和步骤同实施例3。
[0198] 1. 2实时定量PCR检测转染BART6-3p后IncRNA基因 L0C553103的表达：
[0199] 细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时荧光定量PCR法检测IncRNA基因 L0C553103的表达，方法和步骤同实施例1，所用引物序列如下：
[0200] 用于实时荧光定量检测L0C553103表达的引物序列：
[0201] L0C553103 正向引物：5' -acagtagtgcgatcaaggct-3'
[0202] L0C553103 反向引物：5' -tcaccacctccctgttcttc-3'
[0203] 内参基因 GAPDH特异性PCR引物：
[0204] 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0205] 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0206] 2.结果
[0207] 转染BART6-3p后，肿瘤细胞中L0C553013的表达水平显著降低
[0208] 在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS中转染BART6-3p后，IncRNA 基因 L0C553103的表达均显著降低（图12)，表明BART6-3p可抑制L0C553010的表达，或者 说IncRNA基因 L0C553103是BART6-3p的靶基因。
[0209] 实施例5，RNA干扰法抑制肿瘤细胞中L0C553103的表达可以抑制肿瘤细胞的生长 增殖及侵袭转移
[0210] 1.材料方法
[0211] 1.1细胞培养与转染
[0212] 鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心，细胞培养所用 RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0213] 特异性针对L0C553103的RNA干扰序列（siRNA)如下：
[0214] siRNA-Ι :5' -AUAACAUGACAGCUUGCU腳CUCC-3，
[0215] s i RNA-2 :5 ' -CUUCCAAGCUCACUCAAGGUU⑶UG-3 '
[0216] s i RNA-3 :5 ' -CUAAUAUUCCCUCAGAGCUGGGCUG-3 '
[0217] 上述特异性针对L0C553103的RNA干扰序列由Invitrogen公司合成，阴性对照 (NC，scramble)序列也由Invitrogen公司合成并提供。
[0218] 细胞转染的方法和步骤同实施例3.
[0219] 1. 2RNA干扰L0C553103的表达后，通过细胞增殖实验、细胞穿膜实验和细胞划痕 实验检测了人为下调L0C553103表达后细胞的生长、增殖、侵袭和转移能力的变化。具体方 法和步骤同实施例3.
[0220] 2.结果
[0221] 2. 1转染特异性针对L0C553103的RNA干扰序列后，肿瘤细胞中L0C553103的表达 水平显著降低
[0222] 在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2,胃癌细胞AGS中转染特异性针对L0C553103的RNA干扰 序列后，L0C553103在上述细胞中的表达均显著降低（图13)，表明针对L0C553103的RNA 干扰序列转染成功，抑制L0C553103表达的效果明显。
[0223] 2. 2干扰L0C553103表达后肿瘤细胞增殖速度减慢
[0224] MTT细胞增殖实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2,胃癌细胞系AGS中转入特异 性针对L0C553103的RNA干扰序列后，3株肿瘤细胞的生长增殖速度均明显减慢（图14)。
[0225] 2. 3干扰L0C553103表达后细胞迀移能力减弱
[0226] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入特异性针 对L0C553103的RNA干扰序列后鼻咽癌和胃癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减 慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低（图15)。
[0227] 2. 4干扰L0C553103表达后细胞侵袭能力降低
[0228] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中 转入特异性针对L0C553103的RNA干扰序列后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少， 表明细胞侵袭能力减弱（图16)。
[0229] 实施例6,在动物模型中进一步证实过表达BART6-3p或用RNA干扰法抑制肿瘤细 胞中L0C553103的表达可以抑制肿瘤细胞的生长增殖及侵袭转移
[0230] 1.材料方法
[0231] 1.1细胞培养与转染
[0232] 鼻咽癌细胞系5-8F购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛 血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0233] 在5-8F细胞中过表达BART6-3p的方法同实施例3 ;
[0234] 在5-8F细胞中转染特异性针对L0C553103的RNA干扰序列以抑制细胞内 L0C553103表