一种具有抗癌功效的生脉散醇提物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生脉散醇提物及其在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉 及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用，属于中药领域。
【背景技术】
[0002] 生脉散是中医千古名方，首载于金代医家张元素所著《医学启源·卷下》"麦门冬" 条内；内外伤辨惑论及医方考中也有记载。由人参、麦冬、五味子组成，意在取"人参之甘补 气，麦门（即麦冬）苦寒泻热补水之源，五味子之酸清肃燥金"。
[0003] 生脉散最早用于治疗暑热汗多，气阴两伤之证，表现为汗多、身疲、体倦、气短、咽 干、脉虚等症状。古代医家也用于金叶耗伤，脉微欲绝等症状，又用作气阴两虚病人的补益 剂。此方经过几百年的长期使用，安全有效，经久不衰。随着现代医学的发展，生脉散的临 床应用不断扩大，其剂型除散剂外，还有生脉饮、生脉注射液；该方剂经加减变化后还发展 了参麦饮和生脉散党参方等。现在主要用于治疗心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血 等症状、糖尿病、慢性支气管炎，各类心源性休克、冠心病、心律失常等。
[0004] 汤铭新等发现生脉散可显著抑制肺癌的自发转移，但是实验证明这种抗肿瘤作用 并非生脉散直接作用于癌细胞，而是通过提高机体免疫功能间接实现抗肿瘤。中国专利 201010148044. 0公开了一种具有抗肿瘤作用的组合物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用， 该专利将生脉散与其他中药复方添加到以含主药蟾酥的抗肿瘤药物组合物中，生脉散减少 了蟾酥所带来的心脏毒性问题；中国专利200510053562. 9公开了生脉注射液在制备治疗 肿瘤减毒药物中的用途，在对荷瘤小鼠化疗过程中，同时应用生脉散可保护肝肾功能。中国 专利03142266. 7公开了生脉注射液在制备治疗肿瘤增效药物中的用途。该专利中应用生 脉散注射液处理结肠癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌细胞株，证明生脉注射液单独应用时的抗肿 瘤作用效果时有时无，生脉散仅具较稳定的协同增效作用。上述发明专利中涉及生脉散的 抗肿瘤应用，均局限于将生脉散作为肿瘤治疗过程中的辅助用药应用。
[0005] 约30%的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后激活导致Ras蛋白表达水平增高造 成的。若Ras蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元 件，引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生。因此，Ras已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤 药物的靶标。
[0006] 研究表明组成生脉散的单味药人参、五味子和麦冬均具有抗肿瘤作用，但将它们 组方成为生脉散后，人们对其在抗肿瘤应用方面却只发现了它具较稳定的协同增效作用， 因此只能将该方剂作为治疗肿瘤的辅助用药。而通过本发明的实验证明，生脉散对ras原 癌基因突变后所致的过表达具有显著的抑制作用，而不作用于野生型ras原癌基因。
[0007] 但是，传统的生脉散水煎剂具有一定毒性，安全性差，因此，本发明在对生脉散进 行醇提的基础上，通过大孔树脂对其进行进一步分离纯化，分离纯化后的成分不仅保留了 生脉散水煎剂抑制ras原癌基因过表达的作用，并且大大降低了生脉散水煎剂的毒性，因 此效果更好，可在制备抑制ras原癌基因过表达的抗相关恶性肿瘤的药物中应用。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种生脉散醇提物，该生脉散醇提物可以有效降低传统生 脉散水煎剂的毒性，效果更好。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种生脉散醇提物在制药中的新用途，涉及生脉散醇 提物在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗 肿瘤药物中的应用，以期提供一种抗肿瘤活性高，毒性小，廉价的抗肿瘤药物。
[0011] 本发明中生脉散醇提物的制备方法如下： 先将人参、麦冬和五味子，加入乙醇溶液浸泡，加热回流后过滤，减压浓缩得到浸膏，其 特征在于：之后将上述浸膏用蒸馏水完全溶解，上大孔树脂柱吸附，之后用乙醇溶液冲洗收 集后制得的。
[0012] 其中，所述人参、麦冬和五味子的比例为9:9:6,所述乙醇溶液为无水乙醇。
[0013] 所述大孔树脂柱的型号为D101型。
[0014] 本发明所述的生脉散醇提物可以在抑制ras原癌基因过表达中应用。
[0015] 本发明所述的生脉散醇提物亦可在制备抗肿瘤药物中应用，其中所述的肿瘤是由 ras原癌基因过表达导致的。
[0016] 本发明所述的生脉散醇提物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，可以将生脉散醇提 物添加药学上可接受的载体如填充剂、润滑剂、湿润剂、促进吸收剂、吸附载体、稀释剂、赋 形剂等，必要时可加入甜味剂、香味剂等，制备成注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、 片剂等药物的多种剂型，这是本领域技术人员可以理解的。
[0017] 本发明提供一种生脉散醇提物及其在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药 物的新用途。本发明公开的生脉散醇提物及其应用具有以下的优势： (1)本发明的生脉散醇提物与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此 毒性更小，效果更好，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
[0018] (2)生脉散醇提物可以显著抑制ras原癌基因过表达，可在制备治疗由ras原癌基 因过表达导致的肿瘤药物中应用。
[0019] (3)生脉散醇提物中人参、麦冬和五味子之间的组方配比可以根据中药组方原则 合理改动，其仍然可以显著下调ras原癌基因过度激活，具有抗肿瘤活性。
[0020] (4)生脉散醇提物仅仅作用于过表达的突变体Ras蛋白，而对野生型Ras蛋白无影 响。提示生脉散醇提物在应用上安全，它仅作用于癌细胞，而不会作用于正常细胞。今后，我 们有望将生脉散醇提物应用在抗相关恶性肿瘤药物的制备中，其中，所述肿瘤是由ras原 癌基因的过表达导致的，从而为此类肿瘤患者提供更好的治疗，为一些疑难癌症的治疗提 供新的途径。
[0021] (5)生脉散醇提物显著下调ras原癌基因过表达，并不是致突变引起的，不致畸。
[0022] (6)由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码 保守的Ras蛋白，它与人类的Ras蛋白相比具有83%的同源性。如果ras原癌基因突变，在 秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的 发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫Ras/MAPK信号通路过度激 活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药 物。因此，本实验采用了秀丽隐杆线虫突变株作为评估抑制ras原癌基因通路过度激活药 物的模型，并得出了本生脉散醇提物对ras原癌基因过表达有明显下调作用、具有抑制ras 原癌基因通路过度激活，并且与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒 性更小，效果更好的结论。
[0023] 以下提供具体实施例以实现本发明所述的生脉散醇提物及其在制备抑制ras原 癌基因过表达的抗肿瘤药物中应用，但不限于这些实施例。
【具体实施方式】
[0024] 实施例一生脉散水煎剂的制备方法 材料：人参，麦冬，五味子均购自兰州黄河市场 制备方法：先将人参、麦冬、五味子用蒸馏水浸泡，煮沸，煎煮，定容后离心，弃去沉淀， 将上清无菌过滤，置4°C冰箱待用。其中，所述原料人参、麦冬、五味子的比例为9:9:6。
[0025] 实施例二生脉散醇提物的制备方法 材料：人参，麦冬，五味子均购自兰州黄河市场 (1)生脉散浸膏的制备方法： 将配比为9:9:6的人参、麦冬和五味子，加入无水乙醇浸泡，加热回流后过滤，减压浓 缩得到生脉散浸膏。
[0026] (2)生脉散醇提物的制备方法：将生脉散浸膏用蒸馏水完全溶解，上大孔树脂柱吸 附，之后用不同浓度的乙醇溶液冲洗收集后制得，乙醇浓度分别为30%、50%、70%、100%。同 时用水冲洗收集后获得水洗脱物，作为对照。
[0027] 其中，所用大孔树脂柱的型号为D101型。
[0028] 实施例三生脉散醇提物改善生脉散水煎剂毒性的效果 培养基、药品： NGM 培养基：NaCl 1. 5g，Κ2ΗΡ04 1. 3g，ΚΗ2Ρ04 8 . 5g，蛋白胨 1. 4g，琼脂粉 8. 5g，补充蒸 馈水至500mL。灭菌后加入过滤除菌的500μL胆固醇（5mg/mL，无水乙醇配制)，高压蒸汽 灭菌的 50〇μL 1 mol/L MgS04,50(^L lmol/L CaCl2。
[0029] LB液体培养基：NaCl lg，蛋白胨lg，酵母膏0. 5g，补充蒸馈水至100mL。溶解后 用1M NaOH调节pH值为7· 0,高温灭菌。
[0030] Μ9 缓冲液：Na2HP04 · 12Η20 15. 12g，KH2P04 3g，NaCl 5g，MgS04 · 7Η20 0· 25g，高温 灭菌。
[0031] S 基础液（1L) :NaCl 58. 5g，K2HP04 10g，KH2P04 6g ;补充蒸馏水至 1000mL，高温灭 菌。
[0032] 1M柠檬酸钾