（1L):柠檬酸· H20 20g，柠檬酸钾· H20 293. 5g，补充蒸馏水至 1000mL,高温灭菌。
[0033] Trace (1L) ：Sodium. EDTA 1. 86g, FeS04 · 7H20 0. 69g, MnCl2 · 4H20 0. 2g CuS04 · 5H20 0· 29g，ZnS04 · 7H20 0· 025g，补充蒸馏水至 1000 mL，高温灭菌。
[0034] S 液（1L) :，1M 柠檬酸钾 10mL，Trace 10mL，1M CaCl2 3mL，lM MgS04 3mL，5mg/mL 胆固醇lmL，补充S基础液至1L，临用前配制。
[0035] 仪器 高風死蔚锅 （上海申安医疗器械厂） 単人单面净化工作径 （苏州净化设备厂） SK智能III生化.培雜箱 （t波01南仪器厂） 恒温培莽摇床 （上海一·恒科技有限公司） 陽水式恒温培养箱 （上海一恒科学仪器脊限公司） 连续变倍体视显徽鏡 （上海睹科学伩器宵限公翔） 电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司） 漩涡搅拌器 （上海精科仪器有限公司） 离心机 (CT15E, Η立） 实验动物： 秀丽隐杆线虫株：秀丽隐杆线虫突变体ΜΤ2124,基因型为：let-60(nl046sd, gf)IV，购 买于 The Caenorhabditis Genetics Center (CGC)〇
[0036] 细菌株：尿啼陡渗漏突变型大肠杆菌0P50,购买于The Caenorhabditis Genetics Center (CGC)〇
[0037] 具体实验步骤： 线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌0P50的固体NGM板上，然后将放在20°C的培养 箱中培养，当线虫长到成虫，并且板子上有卵和小线虫的时候进行线虫的同步化。
[0038] 线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管； 4000rpm/ min离心3min，去除上清，然后在加入M9缓冲液，离心，重复几次，目的是将大肠 杆菌洗干净；加入裂解液(终浓度：3. 2% NaCIO和1M NaOH);在涡旋仪上震荡7min，使线虫 的虫体破裂，得到卵；4000rpm/ min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的线虫卵；M9 缓冲液冲洗两次，加入lml M9缓冲液，置于20°C培养箱中孵化48小时。
[0039] 药物作用：将生脉散醇提物稀释到一定的浓度，同步化好的线虫稀释到80条 /20ul左右，在96孔板中，每个孔中加 S液120ul，虫液20ul，20ul的10mg/ml的大肠杆 菌0P50,5mg/ml的胆固醇20ul，合适稀释的药液20ul，每个药物浓度（药物终浓度分别为 1. 25mg/mL、2. 5 mg/mL、5. 0 mg/mL)设置五个平行。空白对照组不加药液，将药液换成S液。 20°C恒温培养至线虫成熟，在显微镜下检测线虫的野生型比例（即只有一个真阴门的线虫 比例）。与空白对照组相比，野生型的比例越高，说明药物的作用更强。结果如下表所示： 表1生脉散醇提物抑制ras通路过度激活生物活性测定及对秀丽隐杆线虫 突变体MT2124生长的影响数据
表1的实验结果表明，生脉散水煎剂与生脉散醇提物均能显著抑制ras通路过度激活， 提高线虫的野生型比例，但是，生脉散水煎剂与经无水乙醇洗脱获得的生脉散醇提物相比， 毒性大，会引起线虫大量死亡。
[0040] 本发明的生脉散醇提物在保留生脉散水煎剂抑制ras通路过度激活效果的同时， 毒性大大下降，尤其是经无水乙醇洗脱获得的醇提物，在保证较高药效的同时，降低了线虫 死亡率，在药物终浓度为5. Omg/ml的条件下，线虫的野生型比例达到了 76%，而线虫死亡率 仅为2%。因此，相比前者，本发明的生脉散醇提物毒性更小，效果更好。
[0041] 实施例四生脉散醇提物对秀丽隐杆线虫MT8189 (lin-15突变失活）的作用 实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189,多阴门表型，基因型：lin-15(n765)X，购自CGC (Caenorhabditis Genetics Center);大肠杆菌0P50 (尿啼陡渗漏突变株）作为秀丽隐杆 线虫的食物，购自 CGC (Caenorhabditis Genetics Center)。
[0042] 具体实验步骤：同实施例二。
[0043] 秀丽隐杆线虫中，在lin-15 (n765)X位于ras的上游，正常情况下抑制ras原癌基 因的表达，MT8189线虫株系中该基因失活导致线虫呈多产卵器表型。
[0044] 实验结果显示，生脉散醇提物处理后的线虫的突变率仍然为100%，因此，生脉散 醇提物不能抑制lin-15 (n765) X的多阴门表型，根据遗传上位的原则，生脉散醇提物既然 可逆转其下游的let60/raS原癌基因过度激活导致的多阴门表型，那么也抑制MT8189的 多阴门表型，但本实验中未观察到预期结果，即生脉散醇提物不能抑制let60/raS上游基 因 lin-15(n765)X的多阴门表型。这可能是由于lin-15(n765)X线虫中包含的是野生型 let60/ras拷贝，生脉散醇提物仅仅对过表达的let60/ras起作用，对野生型let60/ras不 敏感，即生脉散醇提物仅仅作用于过度激活的Ras蛋白，对野生型Ras蛋白不敏感，这说明 生脉散醇提物仅仅作用于ras原癌基因过度激活的引起肿瘤细胞，而不作用于正常的细 胞。
[0045] 实施例五生脉散醇提物对秀丽隐杆线虫CB1275 (lin-Ι突变失活）的作用 实验材料：秀丽隐杆线虫CB1275基因型：lin-l(el275) IV购自CGC(Caenorhabditis Genetics Center);大肠杆菌0P50 (尿嘧啶渗漏突变株）作为秀丽隐杆线虫的食物，购自 CGC。
[0046] 具体实验步骤：同实施例二。
[0047] 1 in-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负 调节因子，调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-Ι突变失活后，线虫为多阴门表 型。由于lin-Ι为核转录因子，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多 阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多 阴门而呈非特异的细胞毒作用。
[0048] 本实施例的结果是CB1275株系线虫的多阴门表型未受到生脉散醇提物的影响 (突变率仍然为1〇〇%)，这表明药物作用于ras信号通路可抑制ras过度激活形成的假阴门， 不能抑制lin-Ι突变失活形成的假阴门表型，说明生脉散醇提物作用于ras原癌基因而不 作用于lin-Ι，证明药物下调了 ras原癌基因的过度激活而不是直接抑制了细胞的增殖起 作用的，即生脉散醇提物起作用是ras通路机制依赖，而非广泛的细胞毒作用。
[0049] 以上实施例的动物实验表明，本发明的生脉散醇提物可特异性下调ras原癌基因 突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因。同时，本发明的生脉散醇提物与传 统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，可应用在制备由 ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
【主权项】
1. 一种生脉散醇提物，先将人参、麦冬和五味子，加入乙醇溶液浸泡，加热回流后过滤， 减压浓缩得到浸膏，其特征在于：将上述浸膏用蒸馏水完全溶解，上大孔树脂柱吸附，之后 用乙醇溶液冲洗收集后制得的。2. 如权利要求1所述的生脉散醇提物，其特征在于，所述人参、麦冬和五味子的比例为 9:9:6〇3. 如权利要求1所述的生脉散醇提物，其特征在于，所述乙醇溶液为无水乙醇。4. 如权利要求1所述的生脉散醇提物，其特征在于，所述大孔树脂柱的型号为D101型。5. 如权利要求1-4所述的生脉散醇提物在抑制ras原癌基因过表达中的应用。6. 如权利要求1-4所述的生脉散醇提物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是由 ras原癌基因过表达导致的。
【专利摘要】本发明属中药领域，涉及一种生脉散醇提物及其在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用。研究表明约90%胰腺、50%结肠癌、30%-40%肺腺癌及5%-40%的白血病是由于ras原癌基因过表达造成的，Ras蛋白已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。动物实验表明生脉散醇提物可特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因。同时，本发明的生脉散醇提物与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/8968
【公开号】CN105288121
【申请号】CN201410249016
【发明人】李红玉, 李孟惠, 支德娟, 李洋, 李莹辉, 陈晓雨
【申请人】兰州大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年6月7日