物。接着，用正己烧 与水分配萃取乙醇抽粗物而取得正己烧层与水层。水层再W乙酸乙醋进行分配萃取而得到 乙酸乙醋层与水层。而正己烧层通入硅胶管柱后，利用不同浓度比例的正己烧/乙酸乙醋 混合液冲提W依序分离得11个分层。 W38] 第1个分层为W50:1的正己烧/乙酸乙醋混合液冲提得到的，含补骨脂酪 (bakuchiol);第3个分层为W20 :1的正己烧/乙酸乙醋混合液冲提得到的，含异补骨脂素 (isopsoralen);第4个分层为W7 :1的正己烧/乙酸乙醋混合液冲提得到的，含补骨脂素 (psoralen);第5个分层为W5 :1的正己烧/乙酸乙醋混合液冲提得到的，含补骨脂宁；第 7个分层为W1 :1的正己烧/乙酸乙醋混合液冲提得到的，含补骨脂次素（psoralidin)。
[0039] <补骨脂宁对酵母菌寿命的延长〉
[0040] 挑出单一酵母菌落至YEPD培养液中，并均匀混合。于菌液OD值达0. 6至0. 8时， 取20y1菌液至含不同浓度药剂的YEPD固态培养基，并采用S向显微定位系统取出20至 30个酵母菌细胞。于3(TC下培养酵母菌细胞3至5小时使其分离出第0代子细胞。接着， 于30°C下培养第0代子细胞3至5小时使其分离出第1代子细胞。重复上述步骤，直到未 有任何代数的子细胞分离出。最后，依据分离次数便可计算出酵母菌的代数。
[0041] 如图2所示，野生型酵母菌的代数较补骨脂宁处理的野生型酵母菌的代数少 (26. 9vs. 33. 2)，而sir2突变酵母菌的代数较补骨脂宁处理的sir2突变酵母菌的代数少 巧.8vs. 10.6)。意谓着补骨脂宁能延长酵母菌的寿命。又如图3所示，补骨脂宁的有效浓 度约为2至100yM，较佳地为2至15yM。
[0042] <补骨脂宁对酵母菌SIR2的活化〉
[0043] 酵母菌SIR2与哺乳类SIRTl互为同源，且咸知酵母菌SIR2与延长寿命有关 (GenesDev. 2000; 14 (9) :1021-6)。于此，将确认补骨脂宁延长寿命的效果是否与酵母菌 SIR2有关。
[0044] 首先，于补骨脂宁处理酵母菌不同时间后，萃取酵母菌的RNA。接着，利用反转录聚 合酶连锁反应取得酵母菌RNA所对应的cDNA。最后，W聚合酶连锁反应与即时聚合酶连锁 反应分析得到的cDNA。如图4A、4B所示，补骨脂宁可随着处理时间的增加来促进PNCl的转 5?O
[0045] 为了进一步验证上述结果，于W不同浓度补骨脂宁处理酵母菌不同时间后，萃 取酵母菌的蛋白质，并利用西方点墨法分析。如图4C所示，与经卡路里限制（calorie restriction) 10小时的酵母菌比较，可看出50yM补骨脂宁处理10小时的酵母菌可大量地 表现化cl。表示说补骨脂宁可促进PNCl的转译。
[0046] 化Cl为酵母菌Sir2的上游，因此推测补骨脂宁可经由活化化Cl来活化酵母菌 Sir2〇
[0047] <补骨脂宁对哺乳类SIRTl的活化〉
[0048] 于此，将确认补骨脂宁是否会活化哺乳类SIRTl。
[0049] 将人类骨肉瘤细胞U20S于37°C下培养至隔夜后，投予补骨脂宁至细胞，再于37°C 下培养。经不同的培养时间后，萃取细胞的蛋白质并W西方点墨法分析。
[0050] 如图5A所示，补骨脂宁可随着培养时间的增加来促进哺乳类SIRTl的表现。
[0051] 另外，将人类肺癌细胞A549或人类骨肉瘤细胞U20S于37°C下培养至隔夜后，先 添加含不同浓度药剂的培养液至细胞，再于37°C下预先培养4小时。然后，利用UV光照射 细胞W乙酷基化p53,并于37°C下继续培养4小时。最后，萃取细胞的蛋白质并W西方点墨 法分析。
[0052] 如图5B、5C所示，补骨脂宁可抑制p53的乙酷基化。依"现有技术"所述，p53为哺 乳类SIRTl的受质。此结果表示补骨脂宁可提升哺乳类SIRTl的下游受质的去乙酷基化； 亦即，补骨脂宁可活化哺乳类SIRTl的下游受质。
[0053] 烟酷胺已知为哺乳类SIRTl的抑制剂巧邱Hematol. 2012 ;40 (4) :342-55)，于此 利用此化合物进一步验证上述结果。先将人类肺癌细胞A549于37°C下培养隔夜后，加入含 烟酷胺的培养液至细胞，并于37°C下培养1小时。之后，加入不同浓度的补骨脂宁至培养液 内，且于37°C下培养细胞4小时。然后，利用UV光照射细胞W乙酷基化p53后，于37°C下 继续培养4小时。最后，萃取细胞蛋白质，并W西方点墨法分析。
[0054] 如图6所示，烟酷胺可抑制补骨脂宁活化哺乳类SIRTl所造成的p53去乙酷基化。 此结果可进一步证实补骨脂宁所造成的p53去乙酷基化须哺乳类SIRTl的参与。
[0055] 综上所陈，补骨脂宁可活化哺乳类SIRT1，故补骨脂宁具有作为哺乳类SIRTl活化 剂的潜力。
[0056] 当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟 悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但运些相应的改变和变形 都应属于本发明权利要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种补骨脂宁于制备哺乳类SIRTl的活化剂方面的用途，其特征在于，所述补骨脂 宁结构如式（1):2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述补骨脂宁为萃取自补骨脂。3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述补骨脂宁活化该哺乳类SIRTl的上 游。4. 一种补骨脂宁于制备延长寿命的药剂方面的用途，其特征在于，所述补骨脂宁结构 如式（1):5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述补骨脂宁为萃取自补骨脂。6. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述补骨脂宁活化哺乳类SIRTl来延长寿 命。7. -种补骨脂宁于制备与哺乳类SIRTl活化有关的疾病的药剂方面的用途，其特征在 于，所述补骨脂宁结构如式（1):8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述补骨脂宁为萃取自补骨脂。9. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，该疾病为心血管疾病、肥胖、阿兹海默症 或糖尿病。
【专利摘要】本发明公开一种补骨脂宁的用途，其可用于制备哺乳类SIRT1的活化剂，所述补骨脂宁如式(1)：本发明所提供的补骨脂宁的用途，其可用于制备哺乳类SIRT1的活化剂、延长寿命的药剂或与哺乳类SIRT1活化有关的疾病的药剂。
【IPC分类】A61P9/00, A61P3/04, A61P25/28, A61P3/10, A61K31/352, A61P39/00
【公开号】CN105343051
【申请号】CN201510670027
【发明人】陈金铨, 吕彦礼, 黄聪龙, 方嘉佑, 潘台龙
【申请人】长庚大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月13日