（p〈0. 001)。Day21天， 即灌胃给药三周后测FBG，结果显示，各组小鼠空腹血糖与Day14天比较，略有降低，但比 Day7和Day0天略有升高；而模型组比较发现，二甲双胍与总皂苷给药组FBG均显著降低 (p<0. 001) 〇
[0056] 实施例 4 口服葡萄糖耐量（Oralglucosetolerancetest, 0GTT)的测定
[0057] 给药第15day，进行0GTT实验。操作方法：全体小鼠禁食不进水，过夜后测定空腹 血糖值作为〇min时的血糖值，然后立即按体重分别灌胃2g/kg剂量的葡萄糖溶液，分别测 量灌胃后30、60和120min时的血糖值。
[0058] 如图3,二甲双胍与总皂苷均能有效的增加T2DM型C57db/db小鼠对葡萄糖的吸收 利用，达到降低血糖的目的。30min时高剂量组（120mg/kg组）的血糖比二甲双胍更低，说 明其降糖效果更好。
[0059] 实施例 5 胰岛素耐量（Insulintoleranceetest,ITT)的测定
[0060] 给药第18day，进行ITT测试。操作方法：各组小鼠禁食不进水，过夜后，分别测定 血糖值作为〇min时的血糖值，立即分别按体重腹腔注射0. 2U/kg剂量的胰岛素，测量注射 后30、60和120min时的血糖值。
[0061] ITT结果如图4显示，在腹腔注射胰岛素30min后，二甲双胍组与高剂量组 (120mg/kg组）占初始血糖百分比分别为44. 17%和47. 36%，与模型组占初始血糖百分比 66. 91%相比，二甲双胍组与高剂量组（120mg/kg组）的胰岛素增敏效果较显著。且当腹腔 注射胰岛素60min后，甲双胍组与高剂量组（120mg/kg组）胰岛素增敏效果最显著，二者占 初始血糖百分比分别为28. 08%和26. 83%，是模型组（占初始血糖百分比为50. 13% )的 二分之一左右。
[0062] 实施例6血清中胰岛素含量及尿素、总胆固醇、甘油三酯和高、低密度脂蛋白含量 的测定
[0063] 在灌胃给药第21天时测得各组小鼠血清中胰岛素的含量。血清中胰岛素含量由 武汉协和医院核学部测定，血清中尿素、总胆固醇、甘油三酯和高、低密度脂蛋白由武汉普 仁医院生化仪检测。
[0064] C57db/db小鼠为IR的T2DM型小鼠，因对胰岛素不敏感而代偿性分泌更多胰岛素 以维持血糖平衡。结果显示，与正常组相比，模型组血清胰岛素水平显著升高（P〈〇. 001)，二 甲双胍及总皂苷灌胃给药21天后均能有效降低血清胰岛素水平，且总皂苷组效果更显著 (图5所示）。
[0065] 胰岛素能促进细胞内糖原沉积，因此组织的糖原含量能直接反应胰岛素敏感性。 结果表明，与正常组相比，模型组的肝、肌糖原水平均下降。
[0066] 由表2可见，总皂苷还能减少血清中尿素、总胆固醇、甘油三酯以及高密度脂蛋白 含量，并增加血清中低密度脂蛋白含量，调节脂质代谢，改善胰岛素抵抗。
[0067] 表 2
[0068]
[0069] #p< 0· 05, < 0· 01，< 0· 001 与正常组比较广p< 0· 05,林p< 0· 01，辦p < 0. 001与模型组比较
[0070] 实施例7肝脏和骨骼肌组织中糖原含量测定
[0071] 按说明书操作：取新鲜肝脏或骨骼肌组织，用生理盐水漂洗后，用滤纸吸干，称重， 放入试管。按样本重量（mg)的3倍体积（yL)加入碱液，100°C水浴加热20min，将组织里 的糖原水解完全，制备成肝、肌糖原水解液，流水冷却。
[0072] 肝糖原检测液为肝糖原水解液的1%，按说明书要求加入肝脏重量的96倍体积 (yL)的蒸馏水；肌糖原检测液为肌糖原水解液的5%，按说明书要求加入骨骼骨骼肌重量 16倍体积（μL)的蒸馏水。
[0073]
[0074] 混匀，100°C水浴加热5min，冷却后于620nm波长，1cm光径，空白管调零，测各管0D
值
[0075] 计算公式：
[0076] 糖原含量（mg/g组织）=测定0D值/标准0D值X标准管含量（0.Olmg)X样本 稀释前稀释倍数+1.11
[0077] 二甲双胍组能提高肝脏糖原水平，但与模型组相比无显著性差异。总皂苷高剂量 组及中剂量组能显著提高肝脏糖原含量达到正常水平（26. 231 ± 1. 222mg/g组织），与模型 组相比有显著性差异。二甲双胍亦能提高骨骼肌组织总糖原含量（2.631±0.406mg/g组 织），但其效果不及总皂苷高剂量组（5. 263±0· 812mg/g组织）（见表2)。
[0078] 实施例8肝脏HE染色病理切片
[0079] 取新鲜肝脏用4%甲醛固定后，做HE染色病理切片。
[0080] 从HE染色病理切片结果观察发现T2DM组小鼠肝脏组织与正常组比较，表面红色 偏淡发白，而正常组小鼠的肝脏组织呈光泽的暗红色；且T2DM组小鼠肝脏组织略微偏大， 但各给药组中均有不同程度的改善。肝脏HE染色病理切片结果如图6所示，T2DM组小鼠肝 脏组织中有空泡样细胞，这是由于组织细胞中存在大量变性脂肪颗粒，是脂质沉积的表征。 在二甲双胍组给药后，脂肪颗粒明显减少，病理切片与正常组接近，总皂苷给药组的剂量依 赖性的改善脂质沉积现象，减少组织细胞中空泡样变性脂肪颗粒，其中高剂量组（120mg/kg 组）效果最好，病理切片与正常组接近，效果比阳性药二甲双胍更好。T2DM组小鼠肝脏组织 与正常组比较，表面红色偏淡发白，而正常组小鼠的肝脏组织呈光泽的暗红色；但各给药组 中均有不同程度的改善。
[0081] 实施例9Westernblot检测肝脏和骨骼肌组织糖代谢相关蛋白
[0082] 按组织蛋白体取试剂盒提取各组小鼠肝脏和骨骼肌组织蛋白。采用BCA试剂盒 蛋白定量后，用Westernblot方法检测肝脏组织中信号通路IRS-1/PI3K/AKT蛋白以及 ρ-ΑΜΡΚα及其下游p-ACC蛋白表达的变化，同时检测骨骼肌组织中GLUT-4蛋白表达的变 化。
[0083]图7结果显示，总皂苷高剂量组显著增加IRS-1蛋白的表达（ρ〈0. 001)，亦能提高 ρ-ΡΙ3-Κρ85α及p-AKTser473 蛋白的表达（ρ〈0. 001)，即激活IRS-1/PI3K/AKT信号通路 改善胰岛素抵抗，降低血糖。
[0084] Westernblot检测肝脏组织p-ΑΜΡΚ蛋白表达发现（结果如图8所示），模型组 小鼠肝脏组织P-AMPK蛋白表达下降，二甲双胍作用后能显著提高肝脏内p-AMPK蛋白的 表达（p〈0. 001)，总皂苷作用后亦能剂量依赖性提高肝脏内p-AMPK蛋白的表达，且高剂量 组的效果比阳性药二甲双胍更好（P〈〇. 001)。同时，二甲双胍和总皂苷高剂量组均能显著增 加ACC磷酸化（p〈0. 001)，使其失活，达到抑制脂肪合成，减弱IR的治疗目的。
[0085]Westernblot结果显示（图9)，模型组小鼠的骨骼肌组织中GLUT-4蛋白表达明 显减少，二甲双胍灌胃给药后能提高GLUT-4蛋白的表达，但与模型组相比不具有显著性差 异。而总皂苷中剂量组（60mg/kg组）和高剂量（120mg/kg组）能显著性提高骨骼肌组织 中GLUT-4点的表达（显著性差异分别为p〈0. 05和p〈0. 001)。
[0086] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种野木瓜总皂苷的提取方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 取野木瓜藤茎粉末以乙醇水溶液浸泡提取，提取液蒸干后，得到醇提物浸膏； (2) 步骤（1)得到的醇提物浸膏以甲醇水溶液溶解后，以乙酸乙酯萃取，分别收集上层 乙酸乙酯萃取液和下层水相部分； (3) 步骤（2)的下层水相部分以正丁醇萃取，分别收集上层正丁醇萃取液和下层水相 部分，正丁醇萃取液蒸干后即得粗总皂苷； (4) 以大孔树脂纯化步骤（3)得到的粗总皂苷，得到野木瓜总皂苷。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（4)以大孔树脂纯化步骤（3)得 到的粗总皂苷包括如下步骤： a. 采用HP20大孔树脂柱； b. 以水溶解野木瓜粗总皂苷，湿法上样； c. 对HP20大孔树脂柱进行洗脱，洗脱液浓缩、蒸干即得野木瓜总皂苷。3. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤a中，野木瓜粗总皂苷与HP20大 孔树脂柱的树脂的质量比为1:5~20。4. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤c中，依次以用5~10倍柱体积 的水、体积浓度为30 %的乙醇水溶液、体积浓度为50 %的乙醇水溶液、体积浓度为70 %的 乙醇水溶液和无水乙醇依次对HP20大孔树脂柱进行洗脱，合并体积浓度为50%的乙醇水 溶液和体积浓度为70%的乙醇水溶液的洗脱液，浓缩，蒸干即得野木瓜总皂苷。5. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1)所述的乙醇水溶液为体积浓 度60 %的乙醇水溶液。6. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤（1)的浸泡提取为浸泡3次，每 次浸泡时间为24小时，合并浸泡提取液，旋干得到醇提物浸膏。7. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2)所述的甲醇水溶液为体积浓 度10 %的甲醇水溶液。8. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2)中，醇提物浸膏以甲醇水溶 液加热溶解，加热温度不高于75°C。9. 野木瓜总皂苷用于制备抗糖尿病药物的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗糖尿病药物为抗T2DM的药物。
【专利摘要】本发明公开了一种野木瓜总皂苷的提取方法，包括如下步骤：(1)取野木瓜藤茎粉末以乙醇水溶液浸泡提取，提取液蒸干后，得到醇提物浸膏；(2)步骤(1)得到的醇提物浸膏以甲醇水溶液溶解后，以乙酸乙酯萃取，分别收集上层乙酸乙酯萃取液和下层水相部分；(3)步骤(2)的下层水相部分以正丁醇萃取，分别收集上层正丁醇萃取液和下层水相部分，正丁醇萃取液蒸干后即得粗总皂苷；(4)以大孔树脂纯化步骤(3)得到的粗总皂苷，得到野木瓜总皂苷。本发明还公开了野木瓜总皂苷用于制备抗糖尿病药物的应用。
【IPC分类】A61P3/10, A61K36/185
【公开号】CN105362313
【申请号】CN201510874899
【发明人】杨光忠, 汪莎, 李竣, 陈玉, 徐婧, 胡鑫, 王德彬
【申请人】中南民族大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月3日