用于在有此需要的受试者中抑制淋巴细胞增殖的方法和药物组合物的制作方法_2

列已知的基因的基因表达是本领域公知的（例如，见美 国专利号 6,566,135 ;6,566,131 ;6,365，354;6,410,323 ;6,107,091 ;6,046,321;和5,981， 732) 〇
[0024]小抑制性RNAs(SiRNA)也可以充当基因表达的抑制剂用于本发明。可以通过使肿 瘤，受试者或细胞与小双链RNA(dsRNA)，或导致小双链RNA产生的载体或构建物接触，使得 基因的表达被特异性的抑制（即RNA干扰或RNAi )，降低基因表达。用于对其序列已知的基因 选择适合的dsRNA或编码dsRNA的载体的方法是本领域公知的（例如，见Tuschi，T.等， (1999) ;Elbashir，S.M.等，（2001) ;Hannon，GJ. (2002) !McManus ,MT.等，（2002); Brummelkamp,TR.等，（2002);美国专利号6,573,099和6,506,559;和国际专利公开号WO 01/36646，W0 99/32619,和WO 01/68836)。
[0025] 核酶也可以充当基因表达的抑制剂用于本发明。核酶是酶促RNA分子，其能够催化 RNA的特异性剪切。合酶作用的机制涉及核酶分子和互补靶标RNA的序列特异性杂交，随后 核酸内切性剪切。因此，特异性并高效地催化目标mRNA序列的核酸内切性剪切的工程化发 夹或锤头基序核酶分子在本发明的范围内有用。首先通过扫描目标分子的核酶剪切位点鉴 定任意潜在RNA靶标内的特异性核酶剪切位点，其通常包括以下序列，GUA，GUU和GUC。一旦 鉴定，对应含有剪切位点的目标基因区域的约15至20个核糖核苷酸之间的短RNA序列可以 评价预测的结构特征例如二级结构，其可能使得所述寡核苷酸序列不适合。也可以通过使 用，例如核糖核酸酶保护试验，测试其与互补寡核苷酸杂交的可及性(accessibility)来评 价候选靶标的适合性。
[0026] 反义寡核苷酸和核酶两者作为有用的基因表达抑制剂可以通过已知方法制备。这 些方法包括用于化学合成的技术，例如，通过固相亚磷酰胺化学合成。或者，可以通过体外 或体内转录编码RNA分子的DNA序列生成反义RNA分子。这种DNA序列可以整合到各种各样的 载体中，所述载体整合了适合的RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子。可以引入对 本发明的寡核苷酸的各种修饰，作为增加细胞内稳定性和半衰期的方法。可能的修饰包括 但不限于，向所述分子的5 '和/或3 '端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸侧翼序列，或在寡 核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2'-0-甲基而不是磷酸二酯酶连接。
[0027] 本发明的反义寡核苷酸SiRNA和核酶可以体内单独递送或与载体联合。在其最广 泛的意义上，"载体"是能够促进反义寡核苷酸SiRNA或核酶核酸转移到细胞的任意媒介物。 典型地，所述载体将核酸转运到细胞，相对于所述载体不存在时将产生的降解程度具有减 少的降解。一般来说，在本发明中有用的载体包括但不限于，质粒，噬菌粒，病毒，其它衍生 于病毒或细菌来源的媒介物，其已经通过插入或整合所述反义寡核苷酸SiRNA或核酶核酸 序列操作。病毒载体是一种特别的载体类型，并包括但不限于来自以下病毒的核酸序列:逆 转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)，哈维鼠肉瘤病毒 (harvey murine sarcoma virus)，鼠乳腺月中瘤病毒(murine mammary tumor virus)，和劳 斯肉瘤病毒（rouse sarcoma virus);腺病毒，腺相关病毒；SV-40型病毒；多瘤病毒； Epstein-Barr病毒;乳头瘤病毒;疱疹病毒;牛痘病毒;脊髓灰质炎病毒;和RNA病毒例如逆 转录病毒。人们可以容易的采用未列出但本领域已知的其它载体。
[0028] 具体的病毒载体基于非细胞病变性真核细胞病毒，其中非必须基因已经被感兴趣 的基因取代。非细胞病变性病毒包括逆转录病毒(例如，慢病毒），其生命周期包含基因组病 毒RNA逆转录为DNA随后原病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已经被批准用于人基因 治疗试验。大多数有用的是复制缺陷的那些逆转录病毒(例如，能够指导所需蛋白的合成， 但不能制造感染性颗粒）。这种遗传改变的逆转录表达载体对于基因在体内的高效率转导 具有通用性。用于产生复制缺陷的逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤:将外源性遗传材 料整合到质粒中，使用质粒转染包装细胞系，由所述包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组 织培养基收集病毒颗粒，以及使用病毒颗粒感染目标细胞)提供于KRIEGLER(A Laboratory Manual，"W.H.Freeman C.O.,New York,1990)和MURRY("Methods in Molecular Biology，〃vol.7，Humana Press，Inc.，Cliffton，N.J·,1991)中。
[0029] 用于特定应用的具体病毒是腺病毒和腺相关病毒，其为双链DNA病毒，已经被批准 在基因治疗中用于人类用途。所述腺相关病毒可以经工程化而是复制缺陷的，并能够感染 许多各种不同的细胞类型和种类。其还具有优势例如，热和脂质溶剂稳定性;在不同品系的 细胞中高转导频率，包括造血细胞；以及缺乏超感染抑制（superinfection inhibition)从 而允许多重系列转导。据报道，腺相关病毒可以以位点特异性的方式整合到人细胞DNA中， 从而最大限度的减少插入诱变的可能性和逆转录病毒感染的插入基因表达特征的变化。另 外，在不存在选择压力下，已经在组织培养中跟踪了野生型腺相关病毒感染大于100代，这 意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也可以以染色体外的方式发 挥作用。
[0030] 其它载体包括质粒载体。质粒载体在本领域中已经广泛地描述且对于本领域的技 术人员是公知的。见，例如SANBR00K等，〃Molecular Cloning: A Laboratory Manual，〃 Second Edition ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。在过去的几年里，质粒载 体已经被用作DNA疫苗用于向细胞体内递送编码抗原的基因。对此它们是特别有利的，因为 它们不具有与许多病毒抗体相同的安全考虑。然而，这些与宿主细胞具有兼容启动子的质 粒，可以从所述质粒中可操作地编码的基因表达肽。一些通常使用的质粒包括PBR322， pUC18，pUC19，pRC/CMV，SV40,和pBlueScript。其它的质粒对于本领域的普通技术人员是公 知的。另外，可以使用限制性酶和连接反应以移除和增加 DNA的特异性片段来定制设计质 粒。可以通过各种肠胃外，粘膜和局部途径递送质粒。例如，可以通过肌肉内，皮内，皮下或 其它途径注射DNA质粒。其也可以通过鼻内喷雾或滴剂，直肠栓剂和口服施用。其还可以使 用基因枪施用到表皮中或粘膜表面。所述质粒可以提供于水溶液，在金颗粒上干燥，或与另 一个DNA递送系统联合，所述另一个DNA递送系统包括但不限于脂质体，树状物 (dendrimer)，螺旋状(cochleate)和微胶囊。
[0031] 典型地，本发明的CTPS1抑制剂以治疗有效量施用到受试者。
[0032] 如上文所述的本发明的CTPSl抑制剂的"治疗有效量"表示足够量的化合物。然而， 应当理解，本发明的化合物和组合物的总日常用量将由主治医生在合理的医学判断范围内 决定。对于任意具体的受试者，具体的治疗有效剂量水平将依赖于各种因素包括治疗的病 症以及所述病症的严重性;采用的特定化合物的活性;采用的具体组合物，所述受试者的年 龄，体重，总体健康状况，性别和饮食;施用的时间，施用的途径，已经采用的具体化合物的 排泄速率;治疗的持续时间；与采用的具体CTPSl抑制剂联合或同时使用的药物；以及在医 学领域中公知的类似因素。例如，在本领域的技术内化合物的起始剂量比需要达到所需治 疗效果的剂量低，而逐渐增加剂量直到达到所需效果。然而，产品的每日剂量可以在从0.01 至1000 mg每成年人每天的广泛范围内变化。典型的，所述组合物含有0.01，0.05，0.1，0.5， 1.0,2.5,5.0，10.0，15.0,25.0,50.0，100,250和50011^的活性成分，用于待治疗的受试者的 剂量症状调整。药物典型地含有从约〇. Olmg至约500mg的活性成分，典型地从Img至约IOOmg 活性成分。药物的有效量的剂量水平通常以从〇.〇〇〇2mg/kg至约20mg/kg的体重每天供应， 特别是从约0. 〇〇lmg/kg至7mg/kg体重每天。
[0033] 本发明的CTPSl抑制剂可以与药学上可接受的赋形剂，以及可选的缓释基质例如 可生物降解聚合物联用，以形成药学组合物。
[0034] "药学上"或"药学上可接受"指代分子实体和组合物，当其适当的施用到哺乳动 物，特别是人时，不产生不利的，过敏的或其它不良反应。药学上可接受的载体或赋形剂指 代无毒固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，封装材料或任意种类的剂型辅助剂。
[0035] 在用于口服，舌下，皮下，肌肉内，静脉内，经皮，局部或直肠施用的本发明的药物 组合物中，活性成分，单独或与另一种活性成分联合，可以以单位施用形式，作为与常规药 物支持物的混合物，施用到动物和人类。适合的单位施用形式包含口服途径形式，例如片 剂，凝胶胶囊，粉剂，颗粒剂和口服混悬液或溶液，舌下和颊施用形式，气溶胶，植入物，皮 下，经皮，局部，腹膜内，肌肉内，静脉内，真皮下，经皮，鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形 式。
[0036] 典型地，所述药物组合物含有媒介物，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。 这些媒介物可以具体是等渗的，无菌的，盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，钠，钾，钙或镁 氯化物和类似物或这些盐的混合物），或干燥的，特别是冷冻干燥的组合物，视情况而定，当 添加无菌水或生理盐水时，允许可注射溶液的构建。
[0037] 适合用于可注射用途的药学形式包括无菌水溶液或分散液;制剂包括芝麻油，花 生油，或含水丙二醇；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌干粉。在所有情况 下，所述形式必须是无菌的且必须是流动程度能够容易地注射。其必须在制造和储存的条 件下稳定，且必须针对微生物，例如细菌和真菌的污染保存。
[0038] 包含本发明的化合物作为游离碱(free base)或药学上可接受的盐的溶液可以在 适当地混合了表面活性剂的水中制备，例如，羟丙基纤维素。也可以在丙三醇，液体聚乙二 醇，和其混合物和油中制备分散液。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以阻 止微生物的生长。
[0039] 本发明的CTPSl抑制剂可以以中性或盐形式配制到组合物中。药学上可接受的盐 包括酸加成盐(使用蛋白的游离氨基形成)和使用无机酸形成的例如，盐酸或磷酸，或那些 有机酸例如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸，和类似物。使用游离羧基形成的盐也可以从无机碱 衍生，例如钠，钾，铵，钙，或铁的氢氧化物，和那些有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡 因(procaine)和类似物。
[0040] 所述载体也可以是溶剂或分散介质，含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，丙三醇， 丙二醇，和液体聚乙二醇，和类似物），其适合的混合物，以及植物油。可以通过，例如使用包 被例如卵磷脂，在分散液的情况下维持要求的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持适当的 流动性。可以通过各种抗生素和抗真菌可溶性试剂带来对于微生物作用的阻止，例如对羟 基苯甲酸酯类，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞，等等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例 如，糖或氯化钠。可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂带来对所述可注射组合物 延长的吸收，例如，单硬脂酸铝和明胶。
[0041] 通过将所需量的活性多肽整合到适合的溶剂中制备无菌可注射溶液，所述溶剂根 据需要具有上文枚举的各种其它成分，接着通过过滤除菌。通常来说，通过将各种无菌活性 成分整合到无菌媒介物中制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和所需的上文所 枚举的那些其它成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，制备的具体方法是真空 干燥和冷冻干燥技术，其产出活性成分加上任意另外的所需成分的粉末，来自于其预先无 菌过滤的溶液。
[0042] -经配置，溶液将以与剂型相符的方式且以治疗有效量施用。所述制剂以各种剂 量形式容易地施用，例如上文所述的可注射溶液的类型，但也可以采用药物释放胶囊等等。
[0043] 对于水溶液中的肠胃外施用，例如，如果必要所述溶液应当适合的缓冲，且所述液 体稀释剂首先使用足量的盐水或糖使得等渗。这些具体的水溶液特别适合用于静脉内，肌 肉内，皮下和腹膜内施用。在这一点上，可以采用的无菌水介质对于本领域的技术人员根据 本公开将是已知的。例如，一个剂量可以溶解于Iml等渗的NaCl溶液并添加到1000 ml皮下输 注液或注射于输注的建议位点。将依赖于治疗的受试者的情况而必要地发生一些剂量的变 化。对施用负责的人将，在任何情况下，确定对于个体受试者的适当剂量。
[0044] 除了本发明的化合物用于肠胃外施用，例如静脉内或肌肉内注射，其它药学上可 接受的形式包括，例如，用于口服施用的片剂或其它固体;脂质体制剂;时间缓释胶囊;和目 前使用的任意其它形式。
[0045] 本发明的CTPSl抑制剂可以与本领域已知的任意免疫抑制剂联合使用。免疫抑制 剂包括但不限于，他汀类药物;mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物;TGF-iH言号传 导剂;TGF-β受体激动剂;组蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如曲古抑菌素 A;皮质激素类;线粒体 功能的抑制剂，例如鱼藤酮;P38抑制剂;NF-κβ抑制剂，如6Bio，地塞米松，TCPA-I，IKK V