小分子非编码RNA miR-125b在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于基因工程领域，具体涉及小分子非编码RNA miR-125b及其在制备VETC血管类型肝癌治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002]原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中50%发生于中国，且发病率和致死率逐年上升，严重危害我国人民的健康。众所周知，易于发生转移是癌症难以根治并导致病人死亡的主要原因。一般认为，肿瘤中微血管密度越高，肿瘤越易于发生血行转移。但是，肝癌的微血管密度与肝癌复发转移的关系仍存在争议。最近我们发现:除毛细管状血管，肝癌中还广泛存在VETC(Xessels thatencapsulate tumor fluster，肿瘤包绕型血管)类型血管，它们相连成网，将肿瘤块包绕分隔开。具备VETC血管类型的肝癌病人通常术后复发率更高，生存时间更短。更为重要的是，VETC能够通过与癌旁血管融合释放被VETC分隔的肿瘤块，从而帮助肿瘤发生转移。这提示:VETC血管结构对肿瘤细胞发生转移具有重要的影响，因此制备针对VETC血管类型肝癌的治疗药物具有重要的应用价值。
[0003]Sugino等于2002年最早报道了肿瘤中类似VETC的血管结构的存在，他们观察到乳腺癌细胞移植瘤中血管发展成融合的血窦样结构，并包绕肿瘤团块;随后，该课题组在人肝癌、肾癌和甲状腺癌中都观察到融合的血窦样结构的现象。我们之前的报道首次证明了VETC结构是肝癌独立的预后不良预测因素，与肝癌的转移密切相关。至今，关于VETC形成的潜在分子机制知之甚少。分别有两个研究小组发现:乳腺癌细胞株过表达SLPI和黑色素瘤过表达VEGFA可促进肿瘤细胞株成瘤组织中VETC结构血管的形成，但是具体机制不明。最近，我们首次揭示了 Ang-2是诱导VETC形成的关键分子，在肿瘤细胞中敲低Ang-2的表达能够显著破坏VETC的形成，并最终导致转移率下降。
[0004]Ang-2是血管重塑的重要调控分子，能够通过结合其受体Tie-2，激活下游信号通路，下调内皮细胞中粘附分子VE-Cad的表达，增加血管的通透性，并抑制周细胞的募集，从而阻碍血管成熟。缺少周细胞保护的不成熟血管通常处于一种不稳定的状态，它们通过感受外部信号，决定是出芽还是凋亡。在缺乏促血管生成信号的情况下，Ang-2高表达会导致内皮细胞凋亡，进而发生血管衰退;然而在富含VEGF等促血管生成信号的肿瘤中，Ang-2会促进内皮细胞接受促血管生成信号，诱导内皮细胞的增殖和迀移，引起血管生成。研究表明，Ang-2在多种肿瘤组织中高表达，且其表达水平与患者的生存时间显著负相关。多个基于动物模型的研究表明，抑制Ang-2的活性不仅能够增加肿瘤血管上周细胞的覆盖，使得血管正常化，还显著抑制了移植瘤的血管生成以及肿瘤生长。我们的前期结果表明，抑制肝癌细胞中Ang-2的表达不仅能够抑制VETC的形成，还能够抑制转移。由此可见，Ang-2主要起到促肿瘤的作用，是一个重要的抗血管药物潜在的靶分子。
[0005]microRNA(miRNA)是一类保守的小分子非编码RNA，通过识别靶基因的3’非编码区域(3’UTR)抑制mRNA翻译或促进蛋白降解，从而在转录后水平调控蛋白编码基因的表达。miRNA的异常调控已被证实参与了多种肿瘤的发生发展。由于一个miRNA通常能够识别多个蛋白编码基因，同时调控多种生物学功能，包括增殖、凋亡、血管生成和转移等等，因此在肿瘤中过表达miRNA是一种潜在的抗肿瘤治疗策略。然而，国内外文献中至今未见有关miRNA参与VETC血管类型调控的研究报道。我们的研究中发现miR-100在VETC+肝癌组织表达显著降低，而且能够通过下调Ang-2的表达抑制小鼠移植瘤VETC形成及转移发生。因此，本申请进一步研究miR_125b在VETC类型血管生成中的作用及其在肝癌诊治中的应用。我们的研究将促进高效的抗肿瘤血管生成药物的制备以及肿瘤个体化治疗，具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0006]为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供抑制肿瘤细胞Ang-2表达和形成VETC血管，进而治疗肝癌的小分子非编码RNA
[0007]本发明涉及的小分子非编码RNA miR-125b和miR-100，其成熟体RNA序列从5’端到3’端分别为:
[0008]miR-125b，5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’；
[0009]miR-100，5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’；
[0010]本发明的其一实施方案是，提供了RNAmiR-125b在制备用于治疗VETC血管类型肝癌的药物中的应用。
[0011]在另一实施方案中，本发明提供了RNA miR-125b和RNA miR-100的组合在制备用于治疗VETC血管类型肝癌的药物中的用途。
[0012]本发明的小分子非编码RNA RNAmiR-125b和RNA miR-100抑制肿瘤细胞诱导形成VETC血管和肿瘤细胞中Ang-2的表达。
[0013]在另一实施方案中，本发明提供了小分子非编码RNAmiR-125在制备抑制肿瘤细胞中Ang-2的表达的试剂中的用途。
[0014]在另一实施方案中，小分子非编码RNAmiR-125在制备抑制肿瘤细胞诱导形成肿瘤包绕型血管的试剂中的用途。
[0015]在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗VETC血管类型肝癌的药物组合物，其包含小分子非编码RNAmiR-125b。
[0016]在优选的实施方案中，所述药物组合物还包含小分子非编码RNA miR-100。
[0017]在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗VETC血管类型肝癌的药物组合物，其包含表达miR-125b的试剂。
[0018]在优选的实施方案中，所述药物组合物还包含表达小分子非编码RNA miR-100的试剂。
[0019]在另一优选的实施方案中，所述表达miR-125b和miR-100的试剂包括RNA拟似物、过表达miR-125b或miR-100的质粒和携带有miR-125b或miR-100序列的病毒。
[0020]本发明通过免疫组化和实时定量PCR(qPCR)检测了人肝癌组织标本，表明肝癌病人组织标本中miR-125b的低表达与病人组织肿瘤包绕型血管(VETC)类型以及Ang-2的高表达显著相关;小鼠成瘤实验的结果表明恢复miR-125b的表达可显著抑制肝癌细胞表达Ang-
2、形成VETC类型血管和转移的能力。而且，miR-125b与miR-100同时低表达的肝癌组织中，出现VETC的比例显著更高，Ang-2的表达也显著更低。因此，miR-125b可以单独或者联合miR-100用于制备治疗形成VETC血管类型的肝癌病人的药物，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0021 ] 图1为肝癌组织标本miR-125b或miR-125b与miR-100的表达水平与包绕型血管结构的相关性统计图。其中，A为miR-125b的统计结果;B为miR-125b与miR-100的统计结果。。
[0022]图2为人原代肝癌细胞VETC-2小鼠移植瘤实验结果图，检测在肝癌细胞中过表达miR-125对血管形态和转移的影响。其中，图2A是免疫组化检测人原代肝癌细胞VETC-2小鼠移植瘤中包绕型血管的代表图和血管指数统计图，代表图下方标示对应的每组发生转移的荷瘤小鼠数目/成瘤小鼠总数；图2B是免疫组化检测鼠肝癌细胞Hepal-6移植瘤中包绕型血管的代表图和血管指数统计图，代表图下方标示对应的每组发生转移的荷瘤小鼠数目/成瘤小鼠总数。图2是实施例2中的实验结果。
[0023]图3为miR-125b调控肝癌细胞Ang-2表达的实验结果图。其中，图3A为在VETC-2或Hepal-6细胞中稳定过表达miR-125b后，肝癌细胞中Ang-2蛋白水平的蛋白质印迹检测图；图3B为在VETC-2或H印al-6细胞中拮抗内源miR-125b后，细胞中Ang-2蛋白水平的蛋白质印迹检测图。图3是实施例3中的实验结果。
[0024]图4为检测VETC-2和Hepal-6形成的小鼠移植瘤中Ang-2表达的实验结果图。其中，图4A为免疫组化检测稳定过表达miR-125b或对照的VETC-2小鼠移植瘤Ang-2表达的代表图和其相对表达量的统计图；图4B为免疫组化检测稳定过表达miR-125b或其对照的Hepal-6小鼠移植瘤Ang-2表达的代表图和其相对表达量的统计图。图4是实施例3中的实验结果。
[0025]图5为检测人肝癌组织中Ang-2表达的实验结果图。图5是实施例3中的实验结果。
【具体实施方式】
[0026]以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解