00% vs.57.1 % ) ο
[0069]综上所述，过表达miR_125b可以显著抑制人或鼠肝癌细胞于小鼠体内形成包绕型血管以及发生转移的能力。这表明能表达miR_125b的试剂可以用于制备治疗VETC血管类型肝癌的药物。
[0070]实施例3:miR-125b能够抑制肝癌细胞表达Ang-2
[0071]3.1细胞感染或转染
[0072]细胞感染:
[0073](I)包装病毒:以24孔板为例，用磷酸钙转染法将0.3yg包装混合质粒和0.3yg表达质粒共转至预先贴好的293T包装细胞中。转染后48h收集含有慢病毒的上清。500g离心1min去除细胞碎片，病毒上清，于_80°C贮存。
[0074](2)感染靶细胞:在24孔板中种植适当密度的VETC-2或Hepal-6，加入慢病毒感染，24h后更换培养基，换入新鲜的培养基。多次传代得到一定数目的细胞后，通过流式分选GFP阳性的细胞。后置于5 % CO2、37°C培养箱中培养。
[0075]细胞转染:
[0076]采用Lipofectamine RNAi MAX转染试剂(购自Life Technology)反转的方式转染RNA寡核苷酸，具体步骤如下(以24孔板为例):
[0077]( I )将10nM miRNA抑制剂加至ΙΟΟμΙ o p t 1-MEM中并混匀，加入I μ ILipofectamine RNAi MAX并轻柔混勾，室温静置15min;
[0078](2)将上述静置的混合液加入24孔板，随后加入500μ1细胞悬液，米字形混匀后置于5%C02、37°C培养箱中培养。
[0079]miRNA抑制剂购自上海吉玛，为单链RNA，其RNA序列从5，端到3 ’端分别为:
[0080]ant1-miR-125b:UCACAAGUUAGG⑶CUCAGGGA[0081 ]对照 ant1-miR-C: CAGUACUUUUGUGUAGUACAA
[0082]3.2蛋白质印迹
[0083](I)电泳前:制备SDS-PAGE胶；I X SDS细胞裂解液提取蛋白；
[0084](2)电泳:蛋白在浓缩胶中按恒流I OmA/块进行电泳，在分离胶中则按恒流20mA/块进行电泳；
[0085](3)转膜:电泳结束后取出凝胶，根据目的蛋白分子量的大小，割取相应大小的凝胶。按照海绵垫一滤纸一 PVDF膜(0.45μπι孔径)一凝胶一滤纸一海绵垫的顺序制备“夹心饼”，在电泳槽中置入冰盒，恒流250mA转膜4小时；
[0086](4)封闭及孵育抗体:转膜结束后取出PVDF膜，I XTBS洗5分钟后加入含有5%脱脂奶粉的TBS/T封闭半小时以上；弃封闭液，I X TBS/T溶液洗膜，5min/次，重复3次。加入适当比例稀释的Ang-2 (购自Novus公司)或β-actin (内源对照，购自武汉博士德公司)一抗溶液(稀释液为含I % BSA的TBS/T)，4°C孵育过夜。回收一抗，I X TBS/T溶液室温洗膜，5min/次，重复3次。加入相应种属的二抗，室温孵育lh。
[0087](5)显影:将膜浸泡于ECL试剂3-5min显色，然后用Tanon 5200进行成像以及分析。
[0088]3.3免疫组化
[0089]小鼠的肿瘤组织切片取自步骤2.3，人肝癌组织切片取自1.2。
[0090](I)脱蜡以及抗原修复:55°C烤片30min以上，放于二甲苯中脱蜡两次，1min/次；依次用100%、95%、90%、80%、70%和双蒸水洗311^11;然后用0.3%的双氧水处理101^11，灭活内源性过氧化物酶;双蒸水再洗3次，3min/次;浸泡于修复液中，于1mM柠檬酸钠修复液(pH 6.0)中高压热修复1min，室温冷却半小时；I XPBS洗3次，3min/次；
[0091](2)抗体孵育及染色:用抗Ang-2的抗体(能检测人源和鼠源Ang-2，购自Novus公司)进行孵育，4°C过夜;恢复室温，弃去抗体液，用I X PBS洗3次，5min/次;加入二抗，37°C半小时；用I X PBS洗3次，5min/次;加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染。
[0092](3)计数:Ang-2染色后在高倍视野(400 X )下拍照，用ImagePro Plus软件扫描，并计算整个视野中Ang-2阳性信号面积。对于人肝癌组织，拍摄10个代表视野，并将所有标本的平均值定义为I;对于小鼠移植瘤组织，拍摄5个视野，并将对照组的平均值定义为I。
[0093]3.4结果分析
[0094]如图3所示，A图显示稳定过表达miR-125b可明显抑制人肝癌细胞VETC-2和鼠肝癌细胞株Hepal-6中内源Ang-2的表达;B图显示抑制细胞内源的miR-125b后，肝癌细胞Ang-2的蛋白表达上调。
[0095]如图4所示，A图显示，在小鼠移植瘤模型中，相较于对照组(VETC2-Ctrl)，miR-125b过表达的细胞所形成的移植瘤中Ang-2的蛋白水平显著较低;在小鼠肝癌细胞中也观察到类似现象，B图显示过表达miR-125b抑制Hepal-6肿瘤细胞形成的移植瘤中Ang-2的表达。
[0096]如图5所示，A图显示，相对于miR-125b高表达的病人，miR-125b低表达的临床肝癌病人组织标本表达更高水平的AngU图显示，miR-100和miR-125b均下调的肝癌组织，Ang-2的水平显著更高。
[0097]综上所述，miR-125b单独或同时与miR-100表达下调导致人或鼠肝癌细胞高表达Ang-2。这表明，miR-125b单独或联合miR-100均可以用作制备治疗VETC血管类型肝癌的药物。
[0098]本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
【主权项】
1.小分子非编码RNAmiR-125b在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的应用，其中所述miR-125b的RNA序列为5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’。2.小分子非编码RNAmiR-125b和小分子非编码RNA miR-100的组合在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的用途，其中所述miR-125b的RNA序列为5’ -UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3 ’，所述miR-1 OO的RNA序列为5 ’ -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3 ’。3.小分子非编码RNAmiR-125在制备抑制肿瘤细胞中Ang-2的表达的试剂中的用途。4.小分子非编码RNAmiR-125在制备抑制肿瘤细胞诱导形成肿瘤包绕型血管的试剂中的用途。5.用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物组合物，其包含小分子非编码RNAmiR-125bo6.根据权利要求5的药物组合物，其还包含小分子非编码RNAmiR-100。7.用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物组合物，其包含表达小分子非编码RNAmiR-125b的试剂。8.根据权利要求7的药物组合物，其中所述能表达小分子非编码RNAmiR-125b试剂包括小分子RNA拟似物、质粒和病毒载体。9.根据权利要求7的药物组合物，其还包含表达小分子非编码RNAmiR-100的试剂。10.根据权利要求9的药物组合物，其中所述能表达小分子非编码RNAmiR-125b和小分子非编码RNA miR-100的试剂包括小分子RNA拟似物、质粒和病毒载体。
【专利摘要】本发明提供一种小分子非编码RNA？miR-125b在制备用于治疗肿瘤包绕型血管(VETC)类型肝癌的药物中的用途，其中所述miR-125b的RNA序列为5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’。本发明通过免疫组化和实时定量PCR(qPCR)检测了人肝癌组织标本，表明肝癌病人组织标本中miR-125b的低表达与病人组织肿瘤包绕型血管(VETC)类型以及Ang-2的高表达显著相关；小鼠成瘤实验的结果表明恢复miR-125b的表达可显著抑制肝癌细胞表达Ang-2、形成VETC类型血管和转移的能力。而且，miR-125b与miR-100同时低表达的肝癌组织中，出现VETC的比例显著更高，Ang-2的表达也显著更低。因此，miR-125b可以单独或者联合miR-100用于制备治疗形成VETC血管类型的肝癌病人的药物。
【IPC分类】A61K31/713, A61K48/00, A61P35/00
【公开号】CN105497916
【申请号】CN201510672272
【发明人】庄诗美, 周慧超, 方坚鸿, 尚丽茹
【申请人】中山大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年10月15日