据输入到Excel表格中计算信背比（S/B)，信噪比（S/N)，Z因子W及待测 化合物对病毒的抑制率。计算公式如下：5/8 = 4。/^巾山。表示细胞对照组信号的平均值，4乂表 示病毒对照组信号的平均值，S/N=(iic-i〇/(〇c-〇v)，〇c表示细胞对照组信号的标准差，Ov表 示病毒对照组信号的标准差，Z = l-((3日C+3日v)/|iic-iiv|)，Z因子在0.5与1之间表示实验方 法能够有效的区分对照组之间的差异^ 23^也合物的抗病毒活性(：阳抑制率=(山。<1-1〇/(山-Uv) X 100 % ,Ucpd表不侍测化合物的平均f曰号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率= Ucpd/ iicX 100%。半数最大效应浓度化Cso)是指能引起50%最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度 (CCso)是指引起50%细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组巧光强 度降低50%。在利用Macsne巧y II分析两种化合物的相互作用效果时，在95%置信度，大于 零的体积代表两个化合物的相互作用为协同效果，负值代表括抗作用。位于-25和+25之间 的数值代表两种化合物见的作用不显著，位于25和50之间的数值代表显著但较弱的协同作 用，位于50和100间的数值意味着中等协同作用，大于100的数值表示强协同作用。
[0136] 实施例1单组分活性测定
[0137] 伊曲康挫、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074能够有效抑制EV71对细胞的感 染，呈剂量依赖关系。
[013引图1.伊曲康挫、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074抑制EV71的感染。(A)畑细胞 中分别加入2倍倍比稀释的伊曲康挫、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074，加入病毒或培 养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测四种化合物对EV71的抑制效 果及对细胞的毒性作用。（B)RD细胞中分别加入病毒和2倍倍比稀释的伊曲康挫、芦平曲韦、 法匹拉韦、苏拉明和GW5074,培养48小时后收集上清，并用TCIDso法测定病毒滴度。结果使用 Gra地pad Pri sm5进行处理。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行 实验的标准差。
[0139] 实施例2法匹拉韦作用于肠道病毒71型3D蛋白
[0140] 通过筛选对法匹拉韦具有耐药性的病毒，本发明人得到两株具有耐药性的病毒。 病毒效价减少实验表明运两株病毒均能对法匹拉韦产生耐药性，且通过序列分析本发明人 发现在3D蛋白上出现相同的突变。耐药病毒表型实验证明带有3D蛋白第121位突变的EV71 对法匹拉韦具有抗性。利用反向遗传学系统，本发明人构建出带有该突变的病毒，并验证其 对法匹拉韦的耐药性。结果表明，肠道病毒71型的3D蛋白第121位由丝氨酸突变为天冬氨酸 会赋予EV71耐药性，因此本发明人推断法匹拉韦作用于EV71的3D蛋白。此外，本发明人测试 了伊曲康挫、芦平曲韦、苏拉明和GW5074对该突变病毒的抑制效果，通过与野生型病毒 (G082)比较，没有发现交叉耐药性。结果如图2所示。
[0141] 图2.法匹拉韦通过作用于肠道病毒71型3D蛋白抑制病毒复制。（A)将肠道病毒71 型和法匹拉韦共同培养，并不断增加法匹拉韦浓度。收集第16代培养基上清，测序。利用反 向遗传学系统构建含有3D蛋白突变的EV71，利用空斑形成实验测定病毒滴度，利用病毒效 价减少实验检测病毒对法匹拉韦的耐药性，实验方法与化合物验证实验相同。（B)利用基于 细胞病变效应的实验测定伊曲康挫、芦平曲韦、苏拉明和GW5074对含有3D蛋白突变的病毒 的作用效果。结果使用Graphpad PrismS进行处理。图中的数据来自两个独立的平行实验， 误差线代表两组平行实验的标准差。
[0142] 实施例3组合活性测试
[0143] 伊曲康挫、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074相互组合在治疗EV71感染中产生 协同、叠加或者括抗=种不同效果。结果如图3所示。
[0144] 图3.不同药物组合在治疗EV71感染中的相互作用效果。3D图使用MacSynergyII软 件做出，图中的数据来自至少S次独立的平行实验。(A)伊曲康挫和GW5074组合，（B)伊曲康 挫和苏拉明组合，（C)苏拉明和芦平曲韦组合，（D)法匹拉韦和芦平曲韦组合，化)法匹拉韦 和苏拉明组合，（F)法匹拉韦和伊曲康挫组合。水平面代表两种药物的相互作用为叠加效 果，水平面W上的点代表两种药物的作用为协同效果，水平面W下则为括抗效果。
[0145] 表1
[0147]表1为根据MacSynergy II软件所计算得到的协同、叠加或括抗结果。
[0148] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
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