免疫调节剂、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物化学领域，具体地，本发明设及免疫调节剂、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 免疫治疗作为一种新兴的疾病治疗方式逐渐成为研究的热点，免疫治疗是利用患 者本身的免疫系统对患者进行疾病治疗。其中，免疫调节剂对于免疫系统的调控发挥重要 作用。但是，目前上市的免疫调节剂只有少数几种，发展新的免疫调节剂对于疾病治疗具有 重要意义。
[0003] 因而，目前关于免疫调节剂的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。 为此，本发明的一个目的在于提出一种免疫调节效果好且制备过程简单的、能够有效用于 治疗肿瘤且用于提高疫苗效果的免疫调节剂。
[0005] 依据本发明的一方面，提供一种免疫调节剂，其由如式(I)所示化合物、长度为15-30nt的CpG寡脱氧核巧酸和如式（III)所示化合物结合而成，所述CpG寡脱氧核巧酸（CpG 0DN)具有 CpG 基序 GACGTT，
其中0 <m< 10，
[0006] 该免疫调节剂能够有效地调控免疫细胞的活性，进而达到对免疫系统的调控，包 括正调控和负调控，W实现疾病的有效治疗;该免疫调节剂还能够通过调控免疫系统的功 能抑制肿瘤细胞的生长，达到治疗肿瘤的目的；并且该免疫调节剂能够有效地提高疫苗的 免疫效果。此外，该免疫调节剂可W通过上述S种物质非共价键组装而获得，制备简单快 捷。
[0007]依据本发明的另一方面，提供上述免疫调节剂在调控免疫系统、制备抗肿瘤药物 和/或增强疫苗效果中的用途。
[000引依据本发明的再一方面，提供一种组合物，包括一种疫苗，所述疫苗包括本发明一 方面的免疫调节剂。包含该免疫调节剂的疫苗的能够提高疫苗的免疫效果。
[0009] 依据本发明的又一方面，提供一种组合物，包括一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物 包括本发明一方面的免疫调节剂。包含该免疫调节剂的抗肿瘤药物能够通过调控免疫系统 增强药物抑制肿瘤细胞的生长的能力，达到治疗肿瘤的目的。
[0010] 依据本发明的一方面，还提供一种制备本发明一方面的免疫调节剂的方法，该方 法包括:将如式I所示化合物、长度为15-30nt的CpG寡脱氧核巧酸和如式III所示化合物溶 于水中，任选的震荡获得的溶液，W获得所述免疫调节剂，所述CpG寡脱氧核巧酸含有的CpG
[0011] 依据本发明的运一方法能够快速高效地制备该免疫调节剂，该方法简单，方便快 捷，易于实现大规模生产。 基序为GACGTT ^中0<111< 10，
【附图说明】
[0012] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[001引图1显示了本发明一个实施例中的式I所示化合物Pa邮CSK4-Km的合成路线图； [0014]图2显示了本发明一个实施例中的式HI所示化合物MDP-Kn的合成路线图；
[001引图3显示了本发明一个实施例中的化合物M4的合成路线图；
[0016] 图4显示了本发明一个实施例中的化合物M6的合成路线图；
[0017] 图5显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂的组装过程；
[0018] 图6显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂的透射电子显微镜结果；
[0019] 图7显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂的动态光散射结果；
[0020] 图8显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂被巨隧细胞吞隧的结果；
[0021] 图9显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂活化巨隧细胞的结果；
[0022] 图10显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂的抗肿瘤实验结果；
[0023] 图11显示了本发明一个实施例中的免疫调节剂的提高疫苗效果实验结果。
【具体实施方式】
[0024] 根据本发明的实施例提供的一种免疫调节剂，其由如式（I)所示化合物、长度为 15-30nt的CpG寡脱氧核巧酸和如式(III)所示化合物结合而成，所述CpG寡脱氧核巧酸(CpG 0DN)含有的CpG基序为GACGTT，
其中0 <m< 10，
其中0含n含10。所称的免疫调节剂是指调节免疫应 答的媒介物，所称"调节"包括诱导、增强、刺激或指导免疫应答。
[00巧]所称的CpG 0DN(CpG oligonucleotide,CpG寡脱氧核巧酸）是人工合成的含有非 甲基化的胞喀晚鸟嚷岭二核巧酸(CpG)的寡脱氧核巧酸(ODN)，可模拟细菌DNA刺激多种哺 乳动物包括人的免疫细胞。根据本发明的较佳实施例，CpG ODN的长度为18-25nt，更佳的为 20-24nt。根据本发明的一个实施例，设计CpG ODN为5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'（沈Q ID NO: 1 )，序列可自己合成或者委托他人合成，该序列能够使组装成的免疫调节剂结构稳定， 具有高效的调节免疫系统的能力。
[0026] 根据本发明的一个实施例，所述免疫调节剂由如式（I)所示化合物、长度为15-30nt的CpG ODN和如式（III)所示化合物S者自组装而成的，所述CpG寡脱氧核巧酸含有的 CpG基序为GACGTT。所谓自组装(self-assembly )，是指基本结构单元(分子，纳米材料，微米 或更大尺度的物质）自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基 于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。 自组装技术简便易行，无须特殊装置，通常W水为溶剂，具有沉积过程和膜结构分子级控制 的优点。
[0027] 经试验验证，实施例中的任一免疫调节剂都能够有效地调控免疫细胞的活性，进 而达到对免疫系统的调控，实现疾病的有效治疗;该免疫调节剂还能够通过调控免疫系统 的功能抑制肿瘤细胞的生长，达到治疗肿瘤的目的；并且该免疫调节剂能够有效地提高疫 苗的免疫效果。此外，该免疫调节剂可W通过上述S种物质非共价键组装而获得，制备简单 快捷。
[0028] 根据本发明的实施例，提供上述任一实施例中的免疫调节剂在调控免疫系统、审U 备抗肿瘤药物和/或增强疫苗效果中的用途。
[0029] 根据本发明的实施例提供的一种组合物，其包括一种疫苗，所述疫苗包括上述任 一实施例中的免疫调节剂。包含该免疫调节剂的疫苗的能够提高疫苗的免疫效果。
[0030] 根据本发明的一个实施例，该组合物进一步包括一种药学上可接受的赋形剂。所 称药学上可接受的赋形剂是指一种药理学上无活性的物质，该物质被添加到本发明的化合 物、结合物或组合物中来进一步协助它的给药。本实施例对药学上可接受的赋形剂的类型 不作限制，包括但不限于碳酸巧、憐酸巧、稀释剂、糖或各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明 胶、植物油W及聚乙二醇等。
[0031] 根据本发明的实施例提供的一种组合物，其包括一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药 物包括上述本发明任一实施例中的免疫调节剂。包含该免疫调节剂的抗肿瘤药物能够通过 调控免疫系统增强药物抑制肿瘤细胞的生长的能力，达到治疗肿瘤的目的。
[0032] 根据本发明的一个实施例，该组合物进一步包括一种药学上可接受的赋形剂。所 称药学上可接受的赋形剂是指一种药理学上无活性的物质，该物质被添加到本发明的化合 物、结合物或组合物中来进一步协助它的给药。本实施例对药学上可接受的赋形剂的类型 不作限制，包括但不限于碳酸巧、憐酸巧、稀释剂、糖或各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明 胶、植物油W及聚乙二醇等。
[0033] 根据本发明的实施例的一种制备免疫调节剂的方法，该方法能够用W制备上述本 发明任一实施例中的免疫调节制剂，该方法包括:将如式I所示化合物、长度为15-30nt的 CpG寡脱氧核巧酸和如式III所示化合物溶于水中，任选的震荡获得的溶液，W获得所述免 疫调节剂，所述CpG寡脱氧核巧酸含有的CpG基序为GACGTT，
其中0 <m< 10，
其中0含n含10。本发明的运一方法利用化合物分子 非共价键自组装，能够快速高效地制备免疫调节剂，方法简单易行、无须特殊装置、方便快 捷，易于实现免疫调节剂的大规模生产。
[0034] 根据本发明的实施例，该方法还包括利用多肤固相合成法制备式I所示化合物，其 中包括，利用尸111〇(3多肤固相合成法合成561-化73)4-化73)111，0<111<10，将口日邮切3活化形成 五氣苯酪醋Pams切S-OPfp，将Pam3切S-OPf P与Ser-(； Lys )广(；Lys )m偶联;和/或利用多肤固相 合成法制备式HI所示化合物，其中包括，分别利用Fmoc多肤固相合成法合成N-乙酷胞壁酷 和Ala-D-Glu,接着基于N-乙酷胞壁酷和Ala-D-Glu连接反应W及利用Fmoc多肤固相合成法 在连接产物的C末端加上不同数目的赖氨酸，W获得式HI所示化合物。
[0035] 下面详细描述本发明的实施例。实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理 解为对本发明的限制。需要说明的，除非另有说明，"多个"的含义是两个或两个W上。
[0036] 除另有交待，W下实施例中设及的未特别交待技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段，可W参照《分子克隆实验指南》第=版或者相关产品说明书进行，未特别交待 的试剂、序列和载体等也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公 知的常规方法，所用试剂的来源、商品名W及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标 明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均W首次标明的内容相同。
[0037] 实施例1:免疫调节剂的制备
[003引一、式I所示化合物(脂肤Pa邮CSK4-U的制备
[0039] 采用化OC多肤固相合成策略，在微波辅助多肤自动合成仪上合成C末端为不同数 目赖氨酸的脂肤结构。合成路线如图1所示，将Pa邮切S通过活化形成五氣苯酪醋化m3切S-OPfp偶联到多肤N末端，Pams切S的制备参见[Glunz,P.W.,et al.,Design and synthesis of Le(y)-bearing glycopeptides that mimic cell surface Le(y)mucin glycoprotein architecture.Journal of the American Chemical Society,2000,122, 7273-7279.]进行，接下来，使用TFA(S氣乙酸)/此0/TIS(S异丙基硅烷）（90/5/5，v/v/v) (TFA，TIS购于Sigma-Aldrich公司）把脂肤从树脂上切下来，同时所用氨基酸的侧链保护基 也同时被切下来，通过乙酸沉淀所得到的粗肤通过HPLC法(色谱柱:CN填料柱(购于美国安 捷伦公司）；流动相：乙腊/水混合体系；流速：12.0ml/min;检测波长:215nm;柱溫:室溫)进 行分离纯化，减压蒸馈除去乙腊，再通过冷冻干燥机除去水，即得到式I所示化合物。
[0040] 二、式HI所示化合物(胞壁酷二肤MDP-Kn)的制备
[0041] 采用化OC多肤固相合成策略，在微波辅助多肤自动合成仪上合成C末端为不同数 目赖氨酸的MDP-Kn结构。合成路线如图2所示，其中，结构单元M4和M6的合成路线分别如图3 和图