用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体与外界环境接触的屏障，不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用，而且参与免疫反应和维持机体内环境的稳定。作为人体最表露的皮肤，其受损伤及大面积烫烧伤意外的发生率较高。早期的烧伤创面覆盖可以抑制细菌生长、预防感染、防止水分及电解质的丢失；自体皮肤移植是治疗烧伤的首选，但是对于大面积烧伤，自体皮肤不能满足需求，而异体皮肤能引起明显的免疫排斥，因此，截至目前，严重创伤和大面积烧伤患者的皮源缺乏仍然是临床亟待解决的难题。
[0003]目前，组织工程化皮肤的研究已成为生命科学研究领域的热点之一，而市场上也已出现用于临床的组织工程皮肤产品，虽有一定的临床效果，但不仅价格昂贵，技术操作繁琐，有一定的技术难度且成本造价较高。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中组织工程皮肤覆盖物制作较繁琐，难度较大且修复效果差等缺陷，提供一种制作简单且修复效果较好的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，包括以下步骤:
[0006]分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；
[0007]将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜上于培养基中培养至所述脂肪干细胞完全覆盖所述脱细胞羊膜。
[0008]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，在所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜之前，还包括对脱细胞羊膜进行杀菌的过程，包括以下步骤:
[0009]取脱细胞羊膜于无菌环境下装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，钴60辐照灭菌3?5小时，辐照剂量为3?5kGy。
[0010]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜时，所述脱细胞羊膜处于平整状态。
[0011]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的接种密度为(0.5?5)X104/cm2。
[0012]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述培养基中含有质量分数为10%?20%血清。
[0013]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脱细胞羊膜的获取过程包括以下步骤:
[0014]取胎盘羊膜，去除血块和绒毛膜，用1.0-3.0g/L胰酶于恒温水浴中酶解消化去除羊膜表面的上皮细胞，清洗后，去除羊膜的海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液，再次清洗，即获得所述脱细胞羊膜。
[0015]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程包括以下步骤:
[0016]取脂肪组织，去除血管和纤维，剪碎，洗涤后，离心，吸取中间层脂肪组织，清洗后再次离心，取上层脂肪组织于质量分数为0.03%?0.06%的I型胶原酶中消化15?30分钟，加入PBS或生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，经细胞过滤器过滤，收集滤液，并将滤液以1000?2000转/分的转速离心，获得细胞沉淀，洗涤细胞沉淀后对其再次离心，收集沉淀，即原代脂肪干细胞。
[0017]在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程，还包括对所述原代脂肪干细胞进行传代培养的过程，具体步骤为:
[0018]将所述脂肪干细胞以(3?8)X 14个/cm2的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，每隔2?3天更换新的培养基;待细胞融合度达到70?80%后，消化、洗涤并稀释细胞，然后离心弃上清液，用所述无血清培养基重悬细胞后，按1: (3?6)进行传代培养，每隔2?3天换液，待细胞融合度达到70?80 %后，重复细胞消化传代的步骤，收集第2?4代脂肪干细胞。
[0019]本发明还提供一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，由上述用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片制备方法所获得的。
[0020]实施本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法，可以达到以下有益效果:通过利用脂肪干细胞的分化潜能，以及脱细胞羊膜对脂肪干细胞的刺激诱导作用，促使脂肪干细胞分化成上皮细胞;而脱细胞羊膜的抗原性较低，又能够为细胞提供充足的营养物质，以保持细胞活性及细胞正常的生长，从而使得脂肪干细胞的存活率及转化率较高，提高皮肤修复效果，达到快速修复皮肤创伤的目的；除此之外，由于加快了修复速度，因此不易造成创伤部位色素累积形成疤痕等，减轻患者痛苦;另外，羊膜和脂肪干细胞均来自于废弃的组织，因此成本较低，能够减轻患者负担。
【具体实施方式】
[0021]为解决现有技术中通过组织工程获得的皮肤修复创伤效果不佳、修复效率低且成本较高，操作复杂等缺陷，本发明的创新点在于提供一种负载有脂肪干细胞的羊膜贴片及其制备方法，利用脂肪干细胞的分化能力，以及脱细胞羊膜对脂肪干细胞的刺激分化作用，使得脂肪干细胞转化成上皮细胞，从而能够实现修复皮肤创伤的目的。
[0022]具体地，本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，其制备方法包括以下步骤:
[0023]S1、分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；
[0024]S2、将脂肪干细胞接种于脱细胞羊膜上于培养中培养至细胞完全覆盖脱细胞羊膜。
[0025]羊膜是人体最厚的基膜，来源广泛，多为孕妇生产后的废弃物，成本较低且不存在伦理问题。羊膜分为五层:上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层;其中，羊膜基底膜含有纤维粘连素、层粘连素、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其他一些蛋白多糖大分子和一些细胞生长因子如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，能够满足脂肪干细胞所需营养物质需求，促进脂肪干细胞的黏附、迀移、生长、增殖和分化成上皮细胞等重要功能，且羊膜基底膜易于上皮细胞移行长入，增强上皮细胞的黏附性，促进上皮细胞的生长增殖，阻止上皮细胞凋亡；除此之外，羊膜基底膜中含有多种蛋白酶抑制剂，通过抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用，从而起到抑制炎症的目的；另外，由于羊膜不表达人白细胞抗原A、B、C及DR或β微球蛋白，同时有无血管的基质，因此，抗原性较低。
[0026]羊膜经多步骤的脱细胞处理后，组织中的可溶性蛋白成分和细胞成分被去除，只保留了原有组织结构中的不可溶成分，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖和结构蛋白等，为细胞生长和皮肤创伤修复提供了营养基础。在本发明中经胰酶消化后获得的脱细胞羊膜，其上皮细胞层、成纤维细胞层、海绵层均消失，仅保留了基膜层和致密层，有效地去除了羊膜中的细胞成分，保留了纤维网状结构，进一步降低了抗原性，有利于提高皮肤创伤的修复效率。
[0027]而脂肪干细胞具有较强的分化潜能，通过脱细胞羊膜的刺激作用，能够诱导脂肪干细胞转化为上皮细胞，从而达到修复皮肤创伤的目的。而脂肪干细胞通常来源于人体多余的脂肪组织，来源及采集较为简便，成本较低。
[0028]进一步地，在步骤SI中，脱细胞羊膜的获取过程，包括以下步骤:
[0029]SI 1、无菌环境下，取胎盘羊膜，去除血块和绒毛膜，用1.0-3.0g/L胰酶于恒温水浴中酶解消化20?40分钟，去除羊膜表面的上皮细胞，清洗后，去除羊膜的上皮层、海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液，再次清洗，即获得脱细胞羊膜，放入PBS溶液中，于2?6°C密封保存备用。可以理解的是，脱细胞羊膜也可采用机械法制备获取，具体为现有技术，在此不再赘述。
[0030]进一步地，在步骤SI中，本发明优先采用细胞活性较强的第2?4代脂肪干细胞，第2?4代脂肪干细胞的获取过程为:
[0031]S12、原代脂肪干细胞的获取；
[0032]取脂肪组织，去除血管和纤维，剪碎，洗涤后，离心，吸取中间层脂肪组织，清洗后再次离心，取上层脂肪组织于质量分数为0.03%?0.06%的I型胶原酶中消化15?30分钟，加入PBS或生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，经细胞过滤器过滤，收集滤液，并将滤液以1000?2000转/分的转速离心，获得细胞沉淀，洗涤细胞沉淀后对其再次离心，收集沉淀，即原代脂肪干细胞。
[0033]S13、对原代脂肪干细胞进行传代培养至收获第2?4代脂肪干细胞；
[0034]取步骤S12中获得的原代脂肪干细胞进行细胞计数，以(3?8)X 14个/cm2的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，每隔2?3天更换新的无血清培养基，待细胞融合度达到70?80 %后，胰酶消化2?4分钟，加入等体积的I3BS溶液或生理盐水稀释，反复吹打清洗，然后离心弃上清液，用无血清培养基重悬细胞后，按1: (3?6)的传代比例进行培养，采用无血清培养基进行扩增培养第一代脂肪干细胞，扩增过程中每隔2?3天更换新鲜的无血清培养基，待细胞融合度达到70?80%后，如此重复上述细胞消化传代步骤，完成第2?4代脂肪干细胞的传代和扩增培养。
[0035]步骤S2中，在接种脂肪干细胞之前，需对脱细胞羊膜进行杀菌处理，具体过程为:
[0036]无菌环境下，取步骤Sll中获得的脱细胞羊膜装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，用钴60辐照霉菌3?5小时即可；其中，辐照剂量为3?5kGy，以不改变脱细胞羊膜的理化性质为宜。
[0037]另外，在接种脂肪干细胞之前，还需在无菌环境中，将杀菌后的脱细胞羊膜铺平，且脱细胞羊膜上皮面朝上，具体可将脱细胞羊膜固定平铺在略小于脱细胞羊膜面积的玻璃平板上，或平铺与细胞培养皿内，多余的脱细胞羊膜内折，使脱细胞羊膜的接种面处于平整状态，然后再接种脂肪干细胞，并且在接种脂肪干细胞之后，脱细胞羊膜需始终保持平整状态以使脂肪干细胞均匀分布于脱细胞羊膜上，避免脂肪干细胞堆积，影响其细胞活性及正常生长。
[0038]步骤S2的具体过程为:
[0039]取步骤S13中获得的脂肪干细胞，细胞计数后，以(0.5?5)X 104/cm2密度接种于平铺杀菌后的脱细胞羊膜上进行培养至细胞贴壁，再添加含有10%?20%血清的培养基进行培养，待细胞长满脱细胞羊膜后待移植应用。
[0040]为了使