抗老化并使创伤愈合的化合物的制作方法

专利名称：抗老化并使创伤愈合的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于使创伤愈合并使皮肤老化作用逆转的含基质金属蛋白酶抑制剂的制剂。所述抑制剂为肽，肽的序列与基质金属蛋白酶的酶原形式的切割位点有关。
背景技术：
皮肤的状况通常会受到诸如湿度，紫外线，化妆用组合物，老化，疾病，压力和饮食习惯等因素的影响。因此，各种皮肤疾病都可能发生。通过皱纹的形成证实了皮肤可随着年龄的增长而渐渐失去弹性。老化通常与皮肤变薄和普遍退化有关。随着皮肤自然地老化，供给皮肤的细胞和血管数降低。而且真皮-表皮接合处的变平还会导致该接合处的机械阻力变弱。因此，老年人如果遭遇机械创伤或疾病过程，更容易形成水疱。(见Oikarinen，(1990)“The Aging of SkinChronoaging Versus Photoaging”，Photodermatal.Photoimmunol.Photomed.，Vol.7，pp3-4)。
皮肤含有维持弹性的精细的弹性蛋白纤维网。随着过度暴露于阳光下，弹性纤维系统渐渐增生，变得没有规则，并最终被破坏。该过程被称作光化性弹性组织变性，而且它是机体暴露区域的皮肤起皱纹，变色，以及松驰的主要原因。随着新的成纤维细胞，内皮细胞和角质形成细胞的形成，皮肤可自我修复。然而，随着年龄的增长，皮肤越来越不可能做到这一点。因此，需要使用能够促进生长并促进过早老化皮肤的修复的试剂。
创伤愈合也是通过某些细胞类型的细胞迁移和增殖的增加而促进的。涉及创伤愈合的机制通常分为4个阶段止血，炎症，增殖和成熟。在炎症过程中，白细胞积聚从而对抗细菌，并使血管壁的渗透性增加，导致肿胀。如果感染不再发展，则白细胞数减少。单核细胞可替换白细胞。巨噬细胞和淋巴细胞可释放出生长因子(细胞因子)，以及大量化学物质，如组胺，5-羟色胺，和前列腺素。这些物质可帮助调节创伤愈合过程。在增殖阶段，新的成纤维细胞，内皮细胞和角质形成细胞产生，结缔组织形成，新的血管生长，受损组织再生。大约一周后，成纤维细胞占优，炎症减轻，创伤周围组织的强度迅速增加。在成熟阶段，胶原沉积，瘢痕组织形成。该成熟阶段可能会持续很长时间，在此过程中，各种类型的组织再生。为了使皮肤及相关组织的愈合最佳，应当充分供给各种维生素和微量元素，以及营养物和氧。
慢性创伤或无痛，未愈合的创伤可由不同原因引起，包括感染，异物或有毒刺激物的存在，烧伤，长时间对皮肤施压，以及由于循环受损导致的血液供给不足。在慢性创伤中，组织的内环境稳定和创伤环境受到损害，从而导致愈合失败，或愈合刚刚开始即停止。导致慢性创伤愈合失败的因素是组织坏死，脱水，慢性创伤水肿，纤维变性硬化和小血管疾病。
慢性创伤不愈合的一个主要原因在于一类被称作基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白酶破坏了新形成的创伤床(Vaalamo等，1997；Weckroth等，1996；DiColandrea等，1998；Moses等，1996)。通常是通过4种金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs1-4)的作用而阻碍这些基质金属蛋白酶破坏创伤层的，其中所述金属蛋白酶组织抑制剂与基质金属蛋白酶形成非常特异性的抑制复合物(Olson等，1997；Taylor等，1996；Howard等，1991)。即，每种TIMP仅抑制特定的基质金属蛋白酶亚型。在慢性创伤中，基质金属蛋白酶与TIMP的比例较高，导致大部分基质金属蛋白酶没有受到抑制(Vaalamo等，1996；Saarialho-Kere，1998)。事实上，随着蛋白酶水平的提高，TIMP分子自身被水解。目前还没有各自抑制所有基质金属蛋白酶类型的天然TIMP分子。
人们已经提出过很多方法来控制基质金属蛋白酶的活性，包括小分子(Levy等，1998；Wojtowicz-Praga等，1997；Duivenvoorden等，1997)和基于肽的抑制剂(Odake等，1994)以及抗-MMP抗体(Su等，1995)。然而，用于使创伤愈合并使老化作用逆转的理想组合物不仅要提供最佳的金属蛋白酶抑制，而且还应刺激生长和受损组织的再生。
发明概述本发明提供可用作抗-老化和创伤愈合剂的含肽组合物。本发明的肽不仅抑制金属蛋白酶，而且刺激某些细胞类型，包括成纤维细胞，内皮细胞和角质形成细胞的细胞增殖和迁移。本发明还考虑了各种局部洗液，敷料，及组合物，以及利用所述肽使老化作用逆转并使创伤愈合的方法。
因此，本发明涉及基质金属蛋白酶的肽抑制剂。这些肽抑制剂的氨基酸序列与跨基质金属蛋白酶两个球形结构域的连接区相同或相关。某些类型的基质金属蛋白酶及其序列是已知的，包括基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-5，基质金属蛋白酶-6，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-8，和基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-10，基质金属蛋白酶-11，基质金属蛋白酶-12，和基质金属蛋白酶-13。本发明考虑了所含氨基酸序列来源于所述基质金属蛋白酶任何一个的连接区的抑制剂。例如，本发明肽抑制剂的氨基酸序列可来源于基质金属蛋白酶-2序列(SEQ ID NO14)中从约氨基酸70到约氨基酸120的任何区，和所有其它基质金属蛋白酶的类似区。
本发明提供式(I)，(II)，(III)任何一个的肽Xaa-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；
Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽能够抑制基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-5，基质金属蛋白酶-6，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-8，或基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-10，基质金属蛋白酶-11，基质金属蛋白酶-12，和基质金属蛋白酶-13的活性。在某些实施方案中，所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-8，或基质金属蛋白酶-9的活性。
非极性氨基酸可以是，例如，甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。碱性氨基酸，例如，可以是组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，或2，4-二氨基丁酸。本发明的半胱氨酸样氨基酸包括，例如，半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
脂族氨基酸包括，例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸。酸性氨基酸包括，例如，天门冬氨酸或谷氨酸。极性氨基酸包括，例如，天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。本发明的芳族氨基酸可以是，例如，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
本发明还提供式(IV)的肽(SEQ ID NO18)
Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)其中Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸；Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸； Xaa4是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天门冬氨酸； Xaa7是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸；Xaa8是缬氨酸或亮氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是苏氨酸； Xaa10是天门冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸；Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸； Xaa12是天门冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是苏氨酸或丙氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸； Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是赖氨酸或天门冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是赖氨酸；且其中所述肽能够抑制金属蛋白酶的活性。例如，所述基质金属蛋白酶可以是基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-5，基质金属蛋白酶-6，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-8，和基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-10，基质金属蛋白酶-11，基质金属蛋白酶-12，或基质金属蛋白酶-13。优选的肽可抑制基质金属蛋白酶-2或基质金属蛋白酶-9。
可以衍生本发明肽抑制剂的连接区具有例如SEQ ID NO14的约70-到约120位的氨基酸，和其它基质金属蛋白酶的类似区。在某些实施方案中，本发明肽抑制剂具有SEQ ID NO14的约77到约110位的氨基酸序列，和其它基质金属蛋白酶的类似区。某些肽抑制剂的例子包括含有氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQID NO13的那些。
本发明的肽对不同的基质金属蛋白酶具有不同的亲和性。例如，在其中一个实施方案中，所述肽抑制剂可以约1.0μM-约500.0μM的ki值抑制基质金属蛋白酶-2。在另一实施方案中，所述肽抑制剂可以约1.0μM-400.0μM的ki值抑制基质金属蛋白酶-2。在另一实施方案中，所述肽抑制剂可以约1.0μM-约50.0μM的ki值抑制基质金属蛋白酶-2。
本发明进一步提供含有治疗有效量的本发明的肽和药学上可接受载体的组合物。本发明还考虑了创伤的治疗及皮肤洗液。
本发明进一步提供用于治疗创伤或使老化作用逆转的方法，包括给予治疗有效量的式I，II，III或IV的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO21)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；
Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸，Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；和Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；Xaaa是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸；Xaac是苏氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸；Xaaf是亮氨酸；Xaag是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸；Xaaj是苏氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸；Xaam是苏氨酸或丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaao是精氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸；其中所述肽能够抑制基质金属蛋白酶的活性。
本发明肽中的非极性氨基酸可以是，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。碱性氨基酸可以是，例如，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。半胱氨酸样氨基酸可以是，例如，半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。脂族氨基酸可以是，例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸。酸性氨基酸可以是，例如，天门冬氨酸或谷氨酸。极性氨基酸可以是天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
在另一实施方案中，本发明提供治疗创伤或改善老化作用的方法，包括给予治疗有效量的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ IDNO13的肽。


图1提供所选MMP酶原的切割跨越区的CLUSTAL XTM(1.8版本)多重序列比对。图1A提供突出显示保守残基的序列比对，其中‘*’表示序列之间完全相同，‘’表示7/9保守位置，‘.’表示与大多数保守取代相比，有超过80％的位置相同。图1B中的粗体表示异质性的位置。
图2提供MMP-1酶原的结构(蛋白质数据库档案1FBL.ENT)。表1所示SEQ ID NOS2-10的区域跨越了两个大结构域之间的短区。该区在活化过程中切割。
图3提供MMP-9的三维模型。产生活性蛋白酶N-末端的切割区用交叉阴影线表示。两个锌离子用球形表示。切割结构域肽可与其在酶原中的标准位置附近的MMP结合。这种结合(也接近催化锌)可空间位阻性阻断活性位点的一部分。这种阻断可阻碍底物结合。
图4举例说明利用19聚体(SEQ ID NO11)切割结构域肽对MMP-9活性的抑制。MMP-9是在进行FRET测定之前与1 9聚体(SEQ ID NO11)肽混合的。19聚体(SEQ ID NO11)肽的浓度如下0mM(实心圆形)，0.01mM(空心圆形)，0.03mM(实心正方形)，0.06mM(空心正方形)，0.125mM(实心三角形)，0.25mM(空心三角形)，0.5mM(x′s)，1mM(倒实心三角形)，2mM(倒空心三角形)。
图5举例说明利用10聚体(SEQ ID NO13)切割结构域肽对MMP-9活性的抑制。MMP-9是在进行FRET测定之前与10聚体(SEQ ID NO13)肽混合的。10聚体(SEQ ID NO13)肽的浓度如下0mM(实心三角形)，0.25mM(空心三角形)，0.5mM(空心倒三角形)，1.0mM(实心倒三角形)，2.0mM(x′s)。
图6举例说明利用9聚体(SEQ ID NO12)切割结构域肽对MMP-9活性的抑制。MMP-9是在进行FRET测定之前与9聚体(SEQ ID NO12)肽混合的。9聚体(SEQ ID NO12)肽的浓度如下0mM(实心三角形)，0.25mM(空心三角形)，0.5mM(空心倒三角形)，1.0mM(实心倒三角形)，2.0mM(x′s)。
图7举例说明利用19聚体(SEQ ID NO11)切割结构域肽对MMP-9活性的抑制。MMP-9是在进行荧光胶原测定之前与19聚体(SEQ IDNO11)肽混合的。19聚体(SEQ ID NO11)肽的浓度如下0mM(实心圆形)，0.06mM(空心菱形)，0.1mM(空心正方形)，0.25mM(空心圆形)，0.5mM(x′s)。
图8举例说明利用19聚体(SEQ ID NO11)切割结构域肽对MMP-9活性的抑制。MMP-9是在进行荧光胶原测定之前与19聚体(SEQ IDNO11)肽混合的。19聚体(SEQ ID NO11)肽的浓度如下0mM(实心圆形)，0.06mM(空心菱形)，0.1mM(空心正方形)，0.25mM(空心圆形)，0.5mM(x′s)。
图9举例说明利用10聚体(SEQ ID NO13)切割结构域肽对MMP-9活性的长时间抑制。MMP-9是在进行荧光胶原测定之前，与10聚体(SEQ ID NO13)肽混合的。10聚体(SEQ ID NO13)肽的浓度如下0mM(空心圆形)，0.1mM(空心菱形)，0.2mM(空心正方形)，0.4mM(x′s)。
图10举例说明利用9聚体(SEQ ID NO12)切割结构域肽对MMP-9活性的长时间抑制。MMP-9是在进行荧光胶原测定之前与9聚体(SEQID NO12)肽混合的。9聚体(SEQ ID NO12)肽的浓度如下0mM(实心圆形)，0.06mM(空心菱形)，0.1mM(空心正方形)，0.25mM(空心圆形)，0.5mM(x′s)。
图11提供典型剪接反应的HPLC洗脱曲线。箭头表示随着反应过程的进行，第一个峰(MMP-9酶原的峰)的面积减少，其次的两个峰(分别为成熟的MMP-9和N-末端切割产物)的面积增加。
图12举例说明利用基质溶素(stromilysin)将MMP-9酶原转化成N-末端和C-末端结构域。MMP-9酶原与基质溶素在0(实心圆形)，0.5μM(空心正方形)或1.0μM(实心正方形)19聚体(SEQ ID NO11)肽存在的条件下反应。在指定时间除去等分试样，然后进行HPLC。求MMP酶原峰面积的积分，并把零时间点的样品设为100％。空心圆形表示在没有基质溶素或19聚体(SEQ ID NO11)肽的缓冲液中温育的MMP酶原。
图13A提供19聚体(SEQ ID NO11)抑制剂肽与MMP-9相互作用的等温滴定量热分析。各峰表示通过注射以及随后的结合反应所产生的热量。图13B提供通过相对于时间求图13A各注射峰值的积分所产生的结合等温线。
图14提供19聚体(SEQ ID NO11)抑制剂肽与MMP-2相互作用的等温滴定量热分析。图14A提供25℃时，在20mM二甲胂酸盐(pH6.8)，10mM NaCl中，将19聚体(SEQ ID NO11)(1mM)滴定成MMP2(20μM)的原始等温量热数据。各峰表示通过注射以及随后的结合反应所产生的热量。图14B提供通过相对于时间求图14A各注射峰值的积分所产生的结合等温线。
图15提供当19聚体(SEQ ID NO11)肽在固定的MMP-9的表面上流过时，所产生的表面等离子共振结合等温线。
图16提供用两种浓度的肽进行治疗后，与阳性对照组相比，皮肤模型中活细胞百分比的柱状图。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理过的第一份样品为阳性对照，可用于确立代表100％存活的细胞数。第二份样品是阴性对照，其中的细胞与1％Triton-X100接触，表示该测定法可检测细胞的死亡。接下来的三份样品是浓度为500μM的19聚体(SEQ IDNO11)，10聚体(SEQ ID NO13)，和9聚体(SEQ ID NO12)肽。最后三份样品是浓度为2mM的19聚体(SEQ ID NO11)，10聚体(SEQ IDNO13)，和9聚体(SEQ ID NO12)肽。所给出的数据代表三次试验的平均值。
图17以图形的形式描述了db/db糖尿病小鼠中，创伤愈合的时间过程。该图表示对于用标准盐水(空心圆形)或20μg/mL 19聚体肽(SEQID NO11)(实心圆形)处理过的小鼠而言，相对的平均创伤面积与创伤后的天数。所给出的数据表示10只受试动物的平均相对创伤直径。
图18以图形的形式描述了在有和没有19聚体(SEQ ID NO11)存在的条件下，正常人类真皮成纤维细胞(Clonetics，CC-2509)的增殖。细胞生长是通过测量490nm处的光密度而检测的。柱标记的“19mer6”表示在有1×10-6M浓度的19聚体(SEQ ID NO11)存在条件下的细胞生长。柱标记的“19mer5”表示在有1×10-5M浓度的19聚体(SEQ ID NO11)存在条件下的细胞生长。柱标记的“19mer4”表示在有1×10-4M浓度的19聚体(SEQ ID NO11)存在条件下的细胞生长。“对照组”细胞是在没有加入肽的条件下生长的。
图19以图形的形式描述了在有和没有19聚体(SEQ ID NO11)存在的条件下，正常人类角质形成细胞的增殖。如图所示，19聚体(SEQ IDNO11)导致角质形成细胞以剂量-依赖性的方式增加。没有加入19聚体肽的对照组细胞具有最低的细胞密度。与没有接受1 9聚体肽的细胞相比，接受少至1×10-5M 19聚体(SEQ ID NO11，在图19中标记为19mer5)的细胞显示出明显较大的细胞密度(P＞0.01)。接受1×10-4M19聚体(在图19中标记为“19mer4”)的细胞甚至显示出更大的细胞生长(P＞0.001)。然而，接受1×10-6M19聚体(在图19中标记为“19mer6”)的细胞仅显示出少量的细胞增殖(P＞0.05)，在统计学上没有显著性差异。
图20描述用于进行正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)迁移测定的48-孔趋化室(Neuroprobe，Inc.)。
图21A和21B举例说明正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)的迁移。图21A表示没有NHDF存在时，具有8μm孔(以圆形出现)的用于进行迁移测定的薄膜(300X放大率)。图21B表示由于加入阳性对照化合物(1.25μg/mL血浆纤连蛋白)，导致NHDF迁移后的薄膜。这张照片是使用300X放大率拍摄的。NHDF的核被染成紫色。某些NHDF已经通过薄膜迁移，而其它似乎被捕获在8μm的孔中。
图22的柱状图举例说明相对于接触阳性对照(血浆纤连蛋白)的NHDF迁移，与各种浓度19聚体肽(SEQ ID NO11)接触的正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)的迁移百分比。因为某些趋化性物质具有非常窄范围的活性浓度，因此使用10-倍稀释的19聚体进行初步实验。其中给出的是三次独立实验的平均值(100μg/mL的数据是6次实验的平均值)。1000和100μg/mL的19聚体肽(SEQ ID NO11)浓度对于成纤维细胞是趋化性的(分别为阳性对照组的55±3％和46±3％)。使用低于100μf/mL浓度的19聚体(SEQ ID NO11)进行的成纤维细胞迁移实验仅比阴性对照组高约2倍，而且不是显著性的。
图23的柱状图举例说明相对于接触阳性对照(纤连蛋白)的NHDF迁移，与各种浓度19聚体肽(SEQ ID NO11)及其衍生物接触的正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)的迁移百分比。100μg/mL乙酰化19聚体(SEQ ID NO11)肽(Ac-19聚体)引发的NHDF迁移与19聚体引发的程度大约相等，但更高浓度的Ac-19聚体则没有那么有效。9聚体(SEQ ID NO12)和10聚体(SEQ ID NO13)肽只有在1000μg/mL时才能引发NHDF迁移。有趣的是，14聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ IDNO19)和17聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)肽在任何浓度时，对NHDF都不是趋化性的(没有给出数据)。14聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQID NO20)的肽序列来源于MMP酶，开头部分仅稍稍进一步向下接近N-末端。因此，所述肽的氨基酸序列对于NHDF迁移的诱导而言很重要。
图24的柱状图举例说明加入19聚体肽(SEQ ID NO11)可导致人类皮肤成纤维细胞中胶原产生的增加。没有加入19聚体(SEQ ID NO11)肽的对照组人类皮肤成纤维细胞仅产生少量的胶原。相反，与没有接受19聚体肽的细胞相比，接受少至1×10-6M19聚体(SEQ ID NO11，在图24中标记为19mer6)或1×10-5M19聚体(SEQ ID NO11，在图24中标记为19mer5)的细胞显示出明显更高的细胞密度(P＞0.001)。
发明详述本发明提供可用于对抗皮肤老化作用，并促进创伤愈合的基质金属蛋白酶抑制剂。通常，本发明的抑制剂和组合物促进创伤愈合，防止瘢痕形成，改善皮肤张力，减少皱纹，并刺激平滑，健康皮肤的发育。
基质金属蛋白酶是作为无活性的酶原在体内产生的。酶原的蛋白酶切割可导致成熟基质金属蛋白酶的活化及形成。切割下来的肽序列是在蛋白的最氨基末端发现的，长度约为100-110个氨基酸的酶原前导序列。根据本发明，这些酶原前导肽可阻断基质金属蛋白酶的活性位点并抑制基质金属蛋白酶的活性。基质金属蛋白酶的酶原前导肽的给药可降低胞外基质破坏的速度，并提供更快速的创伤愈合。
大多数抑制策略都包括使用有机小分子阻碍基质金属蛋白酶的酶活性。这些化合物对于机体常常是有毒的，而且不是天然存在的分子。使用天然肽抑制活化的基质金属蛋白酶可提供更高程度的蛋白酶控制，而且没有毒副作用。与小分子抑制策略不同，本发明的肽可用于同时抑制全部或单个基质金属蛋白酶种类的活化。所述肽可被随意引入到皮肤上，引入到创伤环境中，或通过皮肤遮盖物或创伤敷料而被固定，或递送。
本发明提供对酶原活性水平的更高程度控制，从而使慢性创伤愈合并改善老化作用。例如，由于在慢性创伤愈合过程中需要一定量的蛋白酶水平(Agren等，1999)，本领域的技术人员可选择仅仅部分抑制蛋白酶活性。通过调节所用抑制剂肽的类型和量，可控制基质金属蛋白酶抑制的程度。
肽根据本发明，所含序列与切割位点区中的基质金属蛋白酶酶原前导序列有关的肽可用于使创伤愈合并促进健康皮肤的发育。这些肽可抑制许多类型基质金属蛋白酶的活性，并促进成纤维细胞和角质形成细胞的细胞生长和迁移。
基质金属蛋白酶酶原前导序列的切割位置在酶原氨基酸序列的大约110位氨基酸处。本发明肽抑制剂的序列与酶原氨基酸70位-大约120位内的任何区有关。这种肽可抑制许多类型基质金属蛋白酶的活性。本发明的肽还可阻碍酶原基质金属蛋白酶的活化，并抑制成熟基质金属蛋白酶的酶活性。所含序列在各种基质金属蛋白酶中更加保守的肽，例如，所含序列朝向切割区N-末端侧的肽，可用于提供普遍有效拮抗各种基质金属蛋白酶的抑制剂。然而，所含序列保守程度较低的肽，例如，所含序列朝向切割区C-末端侧的肽，可用于提供对单个基质金属蛋白酶特异的抑制剂。
因此，本发明考虑了可作为基质金属蛋白酶抑制剂的，所含序列来源于基质金属蛋白酶任何酶原前导区的肽，还考虑了其中一个或多个氨基酸取代了天然存在于基质金属蛋白酶中的氨基酸的变体肽。还考虑了具有不同序列的肽的混合物。
通常，配制肽序列，肽变体和肽混合物，并以使创伤愈合，皮肤再生，防止瘢痕形成，或使皱纹逆转并阻止皱纹产生达到最佳的方式使用。因此，只要能够促进愈合并抗老化，就可改变本发明的肽组合物和制剂，从而获得更低或更高水平的抑制。
肽抑制剂的大小可以改变。通常，仅仅约有5个氨基酸的肽太小，以致不能提供最佳的抑制。然而，超过大约8-9个氨基酸的肽就足够长，以提供抑制。因此，虽然全长并不是关键性的，但本发明中常使用长于8个氨基酸的肽。本发明所用的其它肽长于9个氨基酸。本发明使用的其它肽长于10个氨基酸。此外，本发明还使用了长于约15个氨基酸的肽。肽的大小没有特定的上限。然而一般说来，使用较短的肽比使用较长的肽更便宜。因此，本发明的肽抑制剂通常短于约100个氨基酸。本发明所用的许多肽抑制剂都短于约50个氨基酸。本发明所用的其它肽抑制剂短于约30个氨基酸。还可使用短于约25个氨基酸的肽。同样，本发明还可使用短于约23个氨基酸的肽。用于进行本发明的肽的例子是具有19个氨基酸的SEQ ID NO11。
表1提供了来源于酶原氨基酸约70位-约120位的若干代表性基质金属蛋白酶的序列。
表1基质金属蛋白酶切割区的序列

表1所列的各个肽，以及具有SEQ ID NO1，11，12和13的肽被考虑为本发明的肽抑制剂。此外，具有SEQ ID NO1-13任何一个的肽变体和肽衍生物也可用作肽抑制剂。这种肽变体和衍生物可具有一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入或其它修饰，只要所述肽变体或衍生物可抑制基质金属蛋白酶。
分离肽的氨基酸残基可以是上述任何一个的，遗传编码的L-氨基酸，天然存在的非遗传编码的L-氨基酸，合成的L-氨基酸或D-对映异构体。这里所用的20个遗传编码的L-氨基酸和通用非编码的氨基酸的符号是传统约定的，并在表2中列出。
表2


可使用具有相似化学和/或物理性质的氨基酸取代包括在本发明范围内的肽的一个或多个氨基酸，只要这些变体或衍生的肽仍保留有抑制基质金属蛋白酶的活性，刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞生长，或刺激成纤维细胞的细胞迁移的能力。
彼此可以取代的氨基酸通常存在于相似的种类或亚类中。正如本领域技术人员已知的，氨基酸可分成三个主要的种类亲水氨基酸，疏水氨基酸和半胱氨酸样氨基酸，这主要取决于氨基酸侧链的性质。这些主要种类又可进一步分成亚类。亲水氨基酸包括具有酸性，碱性或极性侧链的氨基酸，疏水氨基酸包括具有芳族或非极性侧链的氨基酸。非极性氨基酸又可进一步细分成，包括除其它之外的脂族氨基酸。这里所用氨基酸种类的定义如下“疏水氨基酸”是指侧链在生理pH值下不带电，而且被水溶液排斥的氨基酸。遗传编码的疏水氨基酸的例子包括Ile，Leu和Val。非遗传编码的疏水氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”是指侧链含有至少一个具有共轭π-电子体系的环(芳基)的疏水氨基酸。芳基可进一步被取代基，如烷基，烯基，炔基，羟基，磺酰基，硝基和氨基等取代。遗传编码的芳族氨基酸的例子包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码的芳族氨基酸包括苯甘氨酸，2-萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
“非极性氨基酸”是指侧链在生理pH值下通常不带电，而且是非极性的疏水氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸的例子包括甘氨酸，脯氨酸和甲硫氨酸。非编码的非极性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”是指具有饱和或不饱和的直链，支链或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸的例子包括Ala，Leu，Val和Ile。非编码的脂族氨基酸的例子包括Nle。
“亲水氨基酸”是指侧链被水溶液吸引的氨基酸。遗传编码的亲水氨基酸的例子包括Ser和Lys。非编码的亲水氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”是指侧链pK值小于7的亲水氨基酸。酸性氨基酸通常具有因为失去氢离子而在生理pH值下带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括天门冬氨酸(天门冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。
“碱性氨基酸”是指侧链pK值大于7的亲水氨基酸。碱性氨基酸通常具有因为与水合氢离子缔合而在生理pH下带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括非-环状氨基酸鸟氨酸，2，3二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“极性氨基酸”是指侧链在生理pH值下不带电的亲水氨基酸，但在它所具有的键中，通常由两个原子共有的电子对被其中一个原子更紧密地占有。遗传编码的极性氨基酸的例子包括天门冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
“半胱氨酸样氨基酸”是指侧链能够与另外一个氨基酸残基的侧链形成共价键，如二硫键的氨基酸。通常，半胱氨酸样氨基酸的侧链含有至少一个巯基(SH)。遗传编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遗传编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
本领域那些技术人员应认识到，上述分类不是绝对的。很多氨基酸都具有不止一种性质，并因此可被包括在不止一个种类中。例如，酪氨酸既具有芳环又具有极性羟基。因此，酪氨酸具有双重性质，可包括在芳族和极性类中。同样，除了能够形成二硫键外，半胱氨酸还具有非极性的特性。因此，虽然不能被严格分为疏水或非极性氨基酸，但在很多情况下，半胱氨酸可用于赋予肽疏水性。
一些常见的氨基酸，即，它不是遗传编码的，而且存在于本发明的肽及肽类似物中，或取代本发明肽及肽类似物中的氨基酸，包括，但不限制于，β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸，如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔-丁基丙氨酸(t-BuA)；叔-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；ρ-氨基苯丙氨酸(Phe(ρNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也落在上面定义的种类中。
上述遗传编码的和非编码的氨基酸的分类在下面的表3中概括。应当理解表3仅仅用于举例说明，而不意味着对可构成这里所述的肽和肽类似物的氨基酸残基的穷举。用于制备这里所述的肽和肽类似物的其它氨基酸残基可在，例如，Fasman，1989，CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.，和这里引用的参考文献中找到。对于这里没有具体提到的氨基酸，可通过与具体鉴定过的氨基酸的已知行为和/或它们的化学和/或物理性质进行比较而常规分到上述种类中。
表3

本发明肽的任何氨基酸都可被任何相似分类的氨基酸取代，从而产生变体或衍生肽，只要肽的变体或衍生物仍保留有抑制基质金属蛋白酶活性的能力。
在其中一个实施方案中，本发明的肽抑制剂包括肽式I，II或III的任何一个。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸，例如，甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa2是碱性氨基酸，例如，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸，例如，半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸，例如，极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸；Xaa7是酸性氨基酸，例如，天门冬氨酸或谷氨酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸，例如脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸，或极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸，例如，脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸，非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸；Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸，例如，极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，酸性氨基酸，如天门冬氨酸或谷氨酸，碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸，例如，极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或芳族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸，例如，极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸，例如，芳族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸，或极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或酸性氨基酸，如天门冬氨酸或谷氨酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸，例如，芳族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸，例如，非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或酸性氨基酸如天门冬氨酸或谷氨酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸，例如，碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸，例如，碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或极性氨基酸，如天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，酸性氨基酸，如天门冬氨酸或谷氨酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸，例如，非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸，例如，碱性氨基酸，如，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸；
在某些实施方案中Xaa1是脯氨酸，Xaa2是精氨酸，Xaa3是半胱氨酸，Xaa4是甘氨酸，Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺，Xaa6是脯氨酸，Xaa7是天门冬氨酸，Xaa8是缬氨酸，亮氨酸或丝氨酸，Xaa9是丙氨酸，甘氨酸或组氨酸，Xaa10是天门冬酰胺，天门冬氨酸，组氨酸，精氨酸，谷氨酰胺或甘氨酸，Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸，Xaa12是天门冬酰胺，丝氨酸，精氨酸，谷氨酰胺，缬氨酸，或甲硫氨酸，Xaa13是苯丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，苏氨酸，丝氨酸，或谷氨酸，Xaa14是苯丙氨酸，甲硫氨酸或苏氨酸，Xaa15是脯氨酸或谷氨酸，Xaa16是精氨酸，天门冬酰胺或甘氨酸，Xaa17是赖氨酸，苏氨酸，丝氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，天门冬氨酸或天门冬酰胺，Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，Xaa19是赖氨酸，缬氨酸或精氨酸。
本发明理想的肽包括由SEQ ID NO1-13限定的序列。例如，具有SEQ ID NO11的19个氨基酸的肽(PRCGNPDVANYNFFPRKPK)是理想的。该肽(SEQ ID NO11)跨越MMP-2的切割位点。两个较小的肽(PRCGNPDVA(SEQ ID NO12))和NYNFFPRKPK(SEQ ID NO13))代表了SEQ ID NO11肽的一半，也是理想的肽。所有这三个肽都可抑制MMP-9的活性并抑制其它基质金属蛋白酶至不同的程度。
所含序列与基质金属蛋白酶切割区的序列相同的单一肽可用于抑制单个或仅仅几个基质金属蛋白酶的活性。这种单一肽的制剂可抑制一个或多个，但不是全部的基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶活性的这种部分抑制促进愈合。可选择性地，可把两个或多个肽组合，从而针对两个或多个基质金属蛋白酶，提供对基质金属蛋白酶活性的更完全抑制。
本领域的技术人员可利用现有的教导和这里提供的教导，设计一种适宜的肽抑制剂或肽抑制剂的组合，从而获得所需的抑制质量和数量。抑制“质量”是指所抑制基质金属蛋白酶的类型。不同的基质金属蛋白酶可具有多少不同的底物及活性位点。抑制的“数量”是指抑制所有基质金属蛋白酶的总体量。通过调节所用肽抑制剂的类型和量，可调节抑制的质量和数量。本领域的技术人员可很容易地对本发明提供的肽进行修饰，并观察被抑制的基质金属蛋白酶的类型和程度。
例如，本领域的技术人员可对图1所示的肽序列进行比较和比对，并设计出一种肽抑制剂，从而获得所需的抑制质量和数量。在其中一个实施方案中，通过实施例提供了对三处创伤位点的基质金属蛋白酶，mmp2，mmp9和mmp1的比对的氨基酸序列进行的比较，从而鉴定序列中的同源区和趋异区。
MMP序列SEQ ID NOmmp2MQKFFGLPQTGDLDQNTIETMRKPRCGNPDVANYNFFPRKPKWNO15mmp9LQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKWNO16mmp1MQEFFGLKVTGKPDAETLKVMKQPRCGVPDVAQFVLTEGNPRW NO17在该序列比对中，粗体表示在MMP-1中找到，但在MMP-2或MMP-9中没有找到的氨基酸，下划线表示在MMP-1中找到，并仅在MMP-2或MMP-9中找到的氨基酸。
在其中一个实施方案中，希望能够抑制MMP-2和9，但保持MMP-1的水平相对不被调节，从而使慢性创伤愈合。根据上述序列比对，本领域的技术人员可设计出一种肽，该肽的氨基酸可在MMP2和MMP9的酶原序列中找到，但没有在MMP1的酶原序列中找到，从而产生一种抑制MMP-2和9，但使MMP-1不受抑制的肽。这种肽由式I V提供。
Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-
Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸；Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺，理想是天门冬酰胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天门冬氨酸；Xaa7是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸； Xaa8是缬氨酸或亮氨酸，理想是亮氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸；Xaa9是丙氨酸或甘氨酸，理想是甘氨酸；Xaaj是苏氨酸；Xaa10是天门冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸， Xaa11是酪氨酸或苯丙氨理想是异亮氨酸； 酸，理想是酪氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸，Xaa12是天门冬酰胺或谷理想是谷氨酸； 氨酰胺；Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaam是苏氨酸或丙氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸，理想是脯氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸，理想是精氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸；Xaa17是赖氨酸或天门冬氨酸；Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，理想是亮氨酸；并且Xaa19是赖氨酸。
肽的修饰本发明还考虑对肽抑制剂进行修饰，从而使它们稳定，促进它们的摄取和吸收，改善本领域技术人员已知的，肽的任何其它特性和性质。例如，可将肽抑制剂环化，中和肽抑制剂的电荷，还可将肽抑制剂与其它化学部分连接。
利用本领域技术人员可获得的任何方法将肽环化。例如，通过已知的过程使N-末端和C-末端稠合形成肽键。还可将存在于肽中氨基酸侧链上的官能团连接，从而使本发明的肽环化。例如，可形成共价键的官能团包括--COOH和--OH；--COOH和-NH2；和--COOH和--SH。可用于使肽环化的氨基酸对包括Asp和Lys；Glu和Lys；Asp和Arg；Glu和Arg；Asp和Ser；Glu和Ser；Asp和Thr；Glu和Thr；Asp和Cys；及Glu和Cys。能够彼此形成共价键的氨基酸残基的其它例子包括半胱氨酸样氨基酸，如Cys，hCys，β-甲基-Cys和Pen，它们可彼此形成二硫键。理想的半胱氨酸样氨基酸残基包括Cys和Pen。可用于使肽环化的其它氨基酸对是本领域那些技术人员显而易见的。
用于使肽环化的基团不一定是氨基酸。能够与肽氨基末端形成共价键的官能团的例子包括羧酸和酯。能够与肽羧基末端形成共价键的官能团的例子包括--OH，--SH，--NH2和--NHR，其中R是(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基和(C1-C6)炔基。
适于在带有官能团的两个侧链之间形成这种键的反应种类，以及适于形成这种连接的反应条件，对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。用于使肽环化的理想反应条件要足够温和，这样才不致使肽降解或对肽造成损害。用于保护各种官能度所必需的适宜基团是本领域技术人员熟知的(见，例如，Greene & Wuts，1991，2nded.，JohnWiley & Sons，NY)，用于制备这种保护性分子的各反应流程也是本领域技术人员熟知的。
在其中一个实施方案中，将N-末端和C-末端的电荷有效除去。这一点可由本领域技术人员通过任何可获得的方法进行，例如，使N-末端乙酰化，并使C-末端酰胺化。
制备环状肽和以其它方式对肽进行修饰的方法是本领域熟知的(见，例如，Spatola，1983，Vega Datal(3)，一般性综述)；Spatola，1983，“肽主链的修饰”Chemistry and Biochemistry of AminoAcids Peptides and Proteins(Weinstein ed.)，Marcel Dekker，New York，p.267(一般性综述)；Morley，1980，TrendsPharm.Sci.1463-468；Hudson等，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(--CH2NH--，--CH2CH2--)；Spatola等，1986，Life Sci.381243-1249(--CH2--S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1307-314(--CH＝CH--，顺式和反式)；Almquist等，1980，J.Med.Chem.231392-1398(--COCH2--)；Jennings-White等，Tetrahedron.Lett.232533(--COCH2--)；欧洲专利申请EP 45665(1982)CA9739405(--CH(OH)CH2--)；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(--C(OH)CH2--)；和Hruby，1982，Life Sci.31189-199(--CH2--S--)。
创伤愈合及抗老化本发明的肽可用于使创伤愈合，改善皮肤老化作用，并对慢性创伤的愈合特别有益。各个肽，肽变体，肽衍生物及其混合物(例如，具有不同序列的那些)都可在制剂中组合，从而促进创伤愈合，并防止或治疗与老化有关的皮肤问题。最理想的愈合及皮肤再生可能需要某些基质金属蛋白酶活性。因此，本发明的组合物及制剂无需促进基质金属蛋白酶的最大抑制。相反，可根据需要改变肽抑制剂制剂的活性，从而使愈合情况达到最佳，并促进健康皮肤的发育。通过改变肽抑制剂的类型，内含物及量可获得更低或更高水平的抑制，从而促进愈合以及健康皮肤的发育。
为了促进健康皮肤的发育和/或治疗创伤，可按照本领域技术人员选择的任何方式把本发明的肽引入到皮肤上或创伤中。例如，可把肽配制成治疗组合物，该治疗组合物含有治疗有效量的一种或多种肽及药学上可接受的载体。这种组合物可作为乳膏，喷雾剂，泡沫状物，凝胶或任何其它制剂形式而被引入到皮肤上或创伤中。在另一实施方案中，本发明的肽可被配制成皮肤遮盖物或敷料，其中含有浸渗到遮盖物或敷料中，与遮盖物或敷料共价连接或以其它方式缔合的治疗有效量的一种或多种肽。在其中一个实施方案中，所述皮肤遮盖物或敷料可释放肽抑制剂。肽抑制剂的释放可以不受控制或受控制的方式进行。因此，本发明的皮肤遮盖物或创伤敷料可将肽抑制剂缓慢或计时释放到创伤中。皮肤遮盖物和敷料可以是本领域使用的任何材料，包括绷带，纱布，无菌包扎材料，水凝胶，水胶体以及类似材料。
治疗有效量的本发明肽是指肽的量可抑制基质金属蛋白酶至促进健康皮肤发育和/或创伤愈合所需的程度。例如，存在于治疗或药物组合物中的本发明肽的量占组合物重量的约0.001％-约35％。所述肽可占组合物重量的约0.5％-约20％。可选择性地，所述肽可占组合物重量的约1.0％-约10％。肽抑制剂的治疗有效量可随给药途径而改变。例如，30-112,000μg/kg体重的治疗量对于静脉内给药是有效的。然而，用于健康皮肤发育或创伤治疗所需的肽抑制剂的量不仅随给药途径而改变，而且还根据所治疗疾病的性质以及患者的年龄和健康状况而改变，并最终由主治医师或临床医师决定。
给药剂量和方法视所治疗皮肤或组织的位置和/或创伤的严重程度而定。肽以及肽偶联物的有效剂量可由它们相关的体外活性，以及在这里所述的动物模型中的体内活性而定。所述化合物可以单位剂型给药；例如，每个单位剂型含有约0.001μg-约10mg，优选约0.01μg-约5mg，更优选约0.10μg-约1mg，甚至更优选约1.0μg-500μg的肽。所需剂量可以单一剂量，分割剂量，或连续输注给出。所需剂量还可间隔适当的时间给药，例如，每天两次，三次，四次或更多个亚剂量给药。本领域的技术人员可使用这里提供的教导，根据所得到的信息，很容易地制备并给予有效制剂。
本发明的肽抑制剂可配制成药物组合物，并以适合所选给药途径，即，口服或肠胃外，静脉内，肌内，局部或皮下途径的不同剂量形式给予哺乳动物宿主，如人类患者。
因此，所述肽抑制剂可以全身给药，例如，通过输注或注射静脉内或腹膜内给药。肽抑制剂的溶液可在水中制备，任选与无毒的表面活性剂混合。也可在甘油，液态聚乙二醇，三乙酸甘油酯及其混合物和油中制备分散液。在普通的贮藏和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
适于注射或输注或局部涂抹的药物剂型包括含有活性成分的无菌水溶液或分散液或无菌粉末，其中所述活性成分适于无菌可注射或可输注的溶液或分散液的临时制备，任选地，所述活性成分还可包在脂质体中。在所有情况下，最终的剂型在制备和贮藏条件下必须是无菌，可流动且稳定的。液态载体或赋形剂可以是含有，例如，水，乙醇，多元醇(丙三醇，丙二醇，液态聚乙二醇等)，植物油，无毒甘油酯，及其适宜混合物的溶剂或液态分散介质。适当的流动性可通过形成脂质体，维持分散液的必须粒径，或使用表面活性剂而维持。通过使用各种抗细菌剂或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫汞撒等可防止微生物的作用。在某些情况下，本领域的技术人员可选择使用等渗剂，例如，糖，缓冲液或氯化钠。在组合物中使用延迟吸收剂，例如，一硬脂酸铝和明胶，可延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液是通过把所需量的肽或肽偶联物掺入含有上面所列各种其它成分的溶剂中而制备的，如果需要还可进行过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，从而产生含有活性成分以及存在于先前无菌过滤溶液中的任何其它所需成分的粉末。
在某些情况下，肽抑制剂还可与药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂或可同化的食用载体联合口服给药。还可把它们装入硬壳或软壳的明胶胶囊中，还可把它们压制成片剂，或直接掺入患者的饮食。对于口服治疗给药而言，肽抑制剂可与一种或多种赋形剂组合，并以可摄取的片剂，颊片，锭剂，胶囊剂，酏剂，混悬液，糖浆剂，薄膜片等形式使用。这种组合物和制剂可以含有至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可发生改变，占已知单位剂型重量的约2％-约60％。这种治疗有效组合物中的活性化合物的量可获得有效的剂量水平。
片剂，锭剂，丸剂，胶囊剂等还可含有下列成分粘合剂，如黄芪胶，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖，果糖，乳糖或天冬甜素；或调味剂，如薄荷，冬青油或樱桃味的调味剂。当单位剂型为胶囊剂时，除了上述类型的材料之外，它还可含有液态载体，如植物油或聚乙二醇。各种其它物质还可作为包衣存在，或改变固态单位剂型的物理形式。例如，片剂，丸剂或胶囊剂可用明胶，蜡，虫胶或糖等包衣。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯，染料和调味剂，如樱桃味或橙味的调味剂。当然，制备任何单位剂型所用的任何材料都应当是药学上可接受的，而且所用的量应基本无毒。此外，还可把肽抑制剂掺入到持续释放制剂和装置中。
有用的固态载体包括精细分割的固体，如滑石粉，粘土，微晶纤维素，二氧化硅，氧化铝等。有用的液态载体包括水，醇或二醇或水-醇/二醇混合物，其中可将存在的化合物以有效水平溶解或分散在其中，任选地，还可借助于无毒的表面活性剂。此外，还可加入佐剂，如香料和其它抗菌剂，从而优化已知用途的性质。
增稠剂，如合成聚合物，脂肪酸，脂肪酸盐和酯，脂肪醇，改性纤维素或改性矿物质也可与液态载体一起使用，从而形成容易涂抹的糊剂，凝胶，软膏剂，肥皂等，用于直接涂抹在使用者的皮肤上。
通常，可局部给予本发明的肽，用于创伤的治疗并促进健康皮肤的发育。活性肽可以任何方式局部给药，例如以喷雾剂，泡沫状物，粉剂，乳膏剂，胶冻，糊剂，栓剂或溶液直接或间接给予所选择的组织。本文件中使用的术语“糊剂”包括乳膏剂和其它粘性、容易涂抹的组合物，例如常常直接涂在皮肤上或摊在绷带或敷料上的组合物。本发明的肽还可与皮肤遮盖物或创伤敷料共价连接，稳定吸附或以其它方式涂在皮肤遮盖物或创伤敷料上。为了促进手术后的愈合，可把本发明的活性肽直接涂在目标组织或假体装置或可植入的持续释放装置上。所述组合物还可利用气溶胶，作为泡沫状物或烟雾给药，其中可有或没有其它药剂，直接涂在皮肤或创伤处。
所述肽可以制剂的形式给药，该制剂包括肽在蜡，油，乳化剂，水，和/或在水存在下形成凝胶、又基本上不溶于水的物质中的乳状液。该制剂可提供理想的乳状液性质，它易于分散，并具有乳状液的乳脂状稠度，当经历标准灭菌过程，例如，蒸汽灭菌时不会分解，这是因为凝胶可使乳状液稳定。它还显示出与传统凝胶相比，更好的水保留性，这是因为水同时保存在乳状液和凝胶中。
该制剂还可含有湿润剂，从而减少乳膏或洗液中水的部分蒸汽压，降低乳膏或洗液干燥的速度。适宜的湿润剂可与水很大程度地混溶，通常适于涂在皮肤上。多元醇尤其适于这个目的，适宜的多元醇可包括一丙二醇或丙三醇(甘油)。多元醇可占总制剂(重量)的20-50％；优选30-40％。相对较高比例的多元醇可确保在糊剂干燥至任何程度时，最终的糊剂仍然保持柔软并可塑，这是因为甘油可作为聚合物的增塑剂起作用。当把糊剂涂在绷带上时，例如，可很容易地把它从皮肤上除去，当糊剂失去水份时，无需撕下绷带。当与皮肤或创伤，特别是感染的创伤接触时，多元醇还具有防止糊剂中的细菌增殖的作用。
所述制剂可含有其它成分。可用的成分包括氧化锌，鱼石脂，炉甘石，silver suphadiazine，醋酸洗必太，煤焦油，葡萄糖酸洗必太，水杨酸，甲硝唑或其它抗菌剂，或其组合。另外还可找到适于掺入到乳膏中的其它成分。
这些成分可以有利的量加入，例如，可加入多至约15重量％的氧化锌；通常使用6-10％的氧化锌，还可与其它成分，如鱼石脂(0-3重量％)和/或炉甘石(0-15重量％)混合。鱼石脂或炉甘石也可单独使用。醋酸洗必太的使用浓度为1重量％；通常为0.5重量％。
乳状液蜡的例子是甘油一硬脂酸酯，或甘油一硬脂酸酯与PEG100硬脂酸酯的组合，PEG100硬脂酸酯是作为CITHROLGMS/AS/NA从CrodaUniversal Ltd.获得的。这种组合可同时提供蜡和乳化剂(PEG100硬脂酸酯)，所述乳化剂尤其可与蜡相容，用于在水中形成乳状液。制剂中还可含有第二种乳化剂，从而增加乳状液的稳定性，例如，PEG20硬脂酸酯，如Croda Universal Ltd.提供的CITHROL 10MS。乳膏中的乳化剂总浓度通常应为3-15％。当使用两种乳化剂时，其中一种的浓度可能比另外一种要高。
水不溶性物质可与制剂中的水形成凝胶。因此该物质是亲水的，但不能在水中溶解至任何较大的程度。所述物质可以是聚合物，吸水的水不溶性聚合物。然而，也可使用与水形成凝胶并在较高温度下稳定的非聚合物，例如，粘土，如高龄土或膨润土。用于本发明中的某些聚合物是超级-吸收性的聚合物，如在WO-92/16245中公开的那些，它们含有已经部分交联，从而形成三维结构的亲水性纤维素衍生物。适宜的交联纤维素衍生物包括羟低级烷基纤维素的那些，其中所述烷基含有1-6个碳原子，例如，羟乙基纤维素或羟丙基纤维素，或羧基纤维素，例如，羧甲基羟乙基纤维素或羧甲基纤维素。本发明所用聚合物的例子是Akzo Chemicals B.V.作为AKUCELL X181提供的部分交联的羧甲基纤维素钠聚合物。这种聚合物是超级吸收性聚合物，它可吸收至少为自身重量10倍的水。聚合物的交联结构可防止它在水中溶解，但水又很容易吸收到其中，并在聚合物的三维结构内保持，形成凝胶。水从这种凝胶损耗的速度要比从溶液损耗的速度慢，这对于减缓或防止乳膏制剂干燥十分有利。制剂的聚合物含量通常低于10％，例如，聚合物含量可占重量的约0.5-约5.0％，或占重量的约1.0％-2％。
所述制剂可以是灭菌的，此外应当对制剂的成分进行选择，通过改变聚合物含量而提供具有所需流动性的终产物。也就是说，如果产物是灭菌的，那么应当在灭菌前对制剂进行选择，从而提供粘度/弹性相对较高的产物。如果没有对制剂的某些成分进行灭菌，那么可在加入那些成分之前对制剂灭菌，或将每个成分单独灭菌。所述制剂还可通过在无菌条件下，将分别灭菌的成分混合而制备。当对各成分单独灭菌，然后混合在一起时，可调节聚合物的含量，从而产生具有所需流动性的终产物。乳状液的含量决定了加工性质和制剂的感觉，乳状液含量越高，就越容易涂抹，而且是乳脂状的。
此外，还可把制剂装到管，桶或其它适宜的贮存容器形式中，或把它涂在基质上，然后包装。适宜的基质包括敷料，如薄膜敷料，和绷带。
下列实施例用于举例说明，而不是对本发明的限制。
实施例1肽抑制剂通用材料所有肽都是由Sigma-Genosys，Inc.合成的。由公司利用RP-HPLC把释放的肽纯化至均一性＞95％。除去所收集的洗脱峰物质中的盐分，并将其冷冻干燥。质谱分析证实可证实肽的分子量和纯度。除非另有说明，所有化学品都是从Sigma Chemical Corp.或Fluka Chemical Co购买的。活性MMP-9酶是从Calbiochem购买的。
分子模型分子模型利用了两个可视程序，Swiss PDB Viewer(Guex andPeitsch，1997)和Rasmol(Sayle and Milner-White，1995)。建立模型的工作是在Compaq PC running Windows95，以及SiliconGraphics，Inc.Octane UNIX工作站上进行的。此外，在Octane上利用了Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子包。三维结构的文件是从蛋白质数据库下载的，(文件名，参考文献)如下MMP-1(1FBL，Li等，1995)，MMP-2(1GEN，Libson等，1995)，MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等，1995；Reinemer等，1994)，MMP-9(1MMQ，Browner等，1995)，TIMP-2/MT-1MMP复合物(1BUV，Fernandez-Catalan等，1998)，TIMP-2(1BR9，Tuuttila等，1998)，和TIMP-1/MMP复合物(1UEA，Gomis-Ruth等，1997；Huang等，1996；Becker等，1995)。这些文件用于分析蛋白的三维结构，而且是原始序列数据的来源。
抑制测定法这里进行了两个酶测定法。第一个测定法测量作为时间的函数的MMP-9对荧光化胶原的酶水解。将5μM浓度的荧光化胶原(MolecularProbes，Inc.)加入到反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mMNaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，然后放在Spectrosil石英荧光计的比色杯中。将0.1μM浓度的MMP与不同量的肽混合，25℃温育10分钟，从而引起结合。将蛋白混合物加入到胶原底物中，迅速混合。在Shimadzu RF5301荧光计中测量作为时间的函数(激发波长495nm)的520nm处的荧光发射强度(Lakowicz，1983)。荧光素释放测定法可用于测定肽抑制剂([I])的抑制常数(Ki)，它是按照Segel(1993)利用Dixon图(1/v vs.[I])获得的斜率＝Km/(Vmax Ki[S])(1)其中，Km是Michaelis常数，Vmax是反应最大速率，[S]是底物浓度。
第二个测定法利用了荧光共振能转移(FRET)技术。使7个氨基酸的底物肽(Calbiochem)与羧基末端的二硝基苯受体，和氨基末端的2-氨基苯并氨茴酰(Abz)部分供体偶联。利用MMP-9切割该底物，释放出荧光产物(365nm激发，450nm发射)。将5μM浓度的肽加入到反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，并放在先前已经用1％BSA封闭的黑色96-孔微量滴定平板的孔中。将0.1μM浓度的MMP与不同浓度的9聚体(SEQ ID NO12)，10聚体(SEQ ID NO13)，或19聚体(SEQ ID NO11)肽混合，25℃温育10分钟，从而引起结合。将蛋白混合物加入到荧光肽底物中，迅速混合。用Dynex MFX荧光微量滴定平板阅读器测量作为时间的函数的荧光强度。通过使用含非-FRET肽的Abz产生的标准曲线可知，荧光强度与切割的肽摩尔数有关。抑制常数就是从该曲线得到的。其它基质金属蛋白酶是以类似方法，利用特异性的底物FRET肽(全部来源于Calbiochem)测试的。
抗活化测定法该测定法用于测量有多少酶原转化为成熟的基质金属蛋白酶。将酶原MMP-9酶原(100μg)与0.5μg基质溶素在PBS中混合。35℃温育该反应物。80分钟后，除去反应物中的等分试样。将各等分试样与EDTA混合至1mM的终浓度，然后注射到BioSelect 125 HPLC柱上，在PBS中进行层析。0(注射)时间点是一个单峰，它是在大约750秒时从柱子上洗脱下来的。该峰的大小随时间而降低，并出现了两个新的峰。第一个峰是在大约800秒时洗脱下来的，代表MMP-9的成熟形式。第二个峰是在大约1100秒时洗脱下来的，与N-末端的酶原结构域片段相对应。峰面积是通过求洗脱曲线的积分而测定的，并绘制了面积改变的百分比图。
等温滴定量热法等温滴定量热法(ITC)是用MicroCal，Inc.的VP-ITC仪器进行的。滴定是通过将5μL抑制剂肽溶液(浓度为0.5mM-2.0mM)注射到1.4mL搅拌的反应细胞中进行的。细胞中MMP-9的浓度为50-80μM。抑制剂和酶存在于20mM二甲胂酸钠(pH5.5-7.0)，40mM NaCl，或20mMTris-HCl(pH7.0-7.5)，40mM NaCl中。滴定是在20℃-40℃进行的。进行滴定的典型实验条件为10秒的注射周期，在总共40次的注射之间有240秒的延迟。将抑制剂肽空白滴定到缓冲液中，从而校正稀释和混合的热量。
对于结合实验评估而言，多个结合位点的独立设置是最常见的模型。分析溶液的总热量是通过下列公式(Freire等，1990)测定的Q=VΔH×[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K]...(2)]]>其中Q是总热量，V是细胞体积，ΔH是焓，M是大分子(细胞中的结合配偶体)浓度，n是结合化学计量，L是配体(注射器中的结合配偶体)浓度，K是缔合常数。利用Origin版本5(MicroCal，Inc.)使数据拟合于该模型。
表面等离子共振利用BiaCore-X表面等离子共振(SPR)装置(BiaCore，Inc.)测量19聚体(SEQ ID NO11)肽(P)与MMP-9之间的相互作用。在这些实验中，羧甲基葡聚糖传感器芯片(CM-5，Lofas等，1993)是用50mM N-羟基琥珀酰亚胺，0.2M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺活化的，流速为10μL/分钟，共进行了10分钟。使75ng/μL浓度的MMP-9以10μL/分钟的流速与活化表面偶联10分钟。终表面是以10μL/分钟的速率，使1M乙醇胺-HCl在传感器表面流动5分钟而灭活的。使浓度为10-50nM的19聚体(SEQ ID NO11)肽以20μL/分钟的速率在传感器表面流动。结合等温线的缔合与解离相是在模拟速率常数前，利用自动化FFT程序校正的。通过使正向(ka)和反向(kd)速率常数同时配合评估结合等温线d[P-MMP-9]/dt＝(ka[P][MMP-9])-(kd[P-MMP-9])(3)(Karlsson和Falt，1997)，其中[P]，[MMP-9]，和[P-MMP-9]分别为游离肽，游离MMP-9，及复合物的浓度。平衡亲和力常数(KA)的定义如下KA＝ka/kd (4)以SPR信号正确表达等式3为(Morton等，1995)dR/dt＝ka C Rmax-(kaC+kd)R (5)其中R是t时间的SPR信号(反应单位，RU)，Rmax是RU的最大MMP-9结合能力，C是螯合肽的浓度。动力学分析是使用Microcal，Inc.的Origin进行的(O’Shannessy等，1993)。
存活力测定法9聚体(SEQ ID NO12)，10聚体(SEQ ED NO13)和19聚体(SEQ IDNO11)肽的相对毒性是使用MatTek Corp.的皮肤模型Epiderm测定的。在加入肽之前，将装有各皮肤样品的容器在37℃，5％CO2的培养基中预温育2小时。把含样品的容器转移到含有新鲜培养基的6孔平板中。将所有的肽都溶解在PBS中，使其最终浓度达到10mM，然后将100μl各肽溶液吸移到Epiderm样品容器的表面上。在37℃，5％CO2的条件下温育12小时。温育期后，用PBS洗涤样品容器3次，然后把含样品的容器转移到每个孔含有300μL MTT(MTT浓度为1mg/mL)测定培养基的24孔平板中。进行比色测定使显色进行3小时(37℃，5％CO2温育)。然后把含样品的容器转移到每个孔含有2mL异丙醇的24孔培养平板中。室温提取有色沉淀物4小时。在570nm和650nm处阅读各样品的吸光度。然后按照下列公式计算各样品相对于PBS对照组的存活力百分比100×(OD570sam-OD650sam)/(OD570con-OD650con)(6)通常，肽样品是一式三份测定的。
结果基质金属蛋白酶-2的序列(SEQ ID NO14)在下面提供，从而帮助限定基质金属蛋白酶中的不同结构域和区。
1 MEALMARGAL TGPLRALCLL GCLLSHAAAA PSPIIKFPGD41 VAPKTDKELA VQYLNTFYGC PKESCNLFVL KDTLKKMQKF81 FGLPQTGDLD QNTIETMRKP RCGNPDVANY NFFPRKPKWD121 KNQITYRIIG YTPDLDPETV DDAFARAFQV WSDVTPLRFS161 RIHDGEADIM INFGRWEHGD GYPFDGKDGL LAHAFAPGTG201 VGGDSHFDDD ELWTLGEGQV VRVKYGNADG EYCKFPFLFN241 GKEYNSCTDT GRSDGFLWCS TTYNFEKDGK YGFCPHEALF281 TMGGNAEGQP CKFPFRFQGT SYDSCTTEGR TDGYRWCGTT321 EDYDRDKKYG FCPETAMSTV GGNSEGAPCV FPFTFLGNKY361 ESCTSAGRSD GKMWCATTAN YDDDRKWGFC PDQGYSLFLV401 AAHEFGHAMG LEHSQDPGAL MAPIYTYTKN FRLSQDDIKG441 IQELYGASPD IDLGTGPTPT LGPVTPEICK QDIVFDGIAQ481 IRGEIFFFKD RFIWRTVTPR DKPMGPLLVA TFWPELPEKI521 DAVYEAPQEE KAVFFAGNEY WIYSASTLER GYPKPLTSLG541 LPPDVQRVDA AFNWSKNKKT YIFAGDKFWR YNEVKKKMDP601 GFPKLIADAW NAIPDNLDAV VDLQGGGHSY FFKGAYYLKL641 ENQSLKSVKF GSIKSDWLGC9个MMP氨基酸序列切割区的加强成对序列比对是使用CLUSTALTM(Higgins等，1992)程序计算的。该比对限定了活化蛋白酶切割位点侧翼的保守及非保守氨基酸的位置。挑选活化切割位点的任意数量的N-末端氨基酸和C-末端氨基酸数进行比对。MMP序列(表1)的比对在图1中给出，表明所有MMP活化区都可以统计学显著的方式进行比对。为了进行比对所选择的区大体上与氨基酸70-120相对应，假定MMP结构的平均信号序列为氨基酸1-20，前肽结构域为氨基酸21-100，成熟活性酶则来源于氨基酸101到末端。为了进行研究而选择的19聚体(SEQ ID NO11)序列包含在比对区内。具体而言，在MMP-2中，19聚体(SEQ ID NO11)与氨基酸100-118相对应。
MMP序列的比对表明，活化结构域的中心区PRCGVPDV(SEQ ID NO1)是高度保守的，该区域侧翼有较大程度的序列变异。序列异质性可用于设计能够抑制特异性MMP酶，或MMP组合的肽序列，这一点是通过选择氨基酸(以所述比对为基础)进行的。此外，改变特定肽的长度以调节效力。
MMP-1酶原的三维结构在图2中提供，表明表1和图1所示的活化区各自构成一个桥，从而将两个大的球形结构域相互连接起来。切割区被定义为一种短的非结构化的结构域，它将前肽结构域连接于活性酶结构域。作为活化步骤的一部分，该序列被切割为两半。它还是对HgCl2介导的体外活化敏感的区域。
活化可除去露出成熟酶活性位点的空间阻断(即，前肽的结构域)。N-末端接近催化锌离子，该离子通常是酶活性所需的。活性MMP-9的结构在图3中给出，锌离子以实心的球形表示。第二个锌离子是一种结构性离子，即，它有助于蛋白的稳定，但不能催化。19聚体(SEQ IDNO11)肽的C-末端部分现在成为酶的极端氨基末端，如图3左侧所示，作为最后一个环的上升部分(交叉线阴影部分)。从活化结构域肽到活化MMP的表面的模型化表明，该肽(特别是，如果包括较长的N-末端区)可与活性位点区相互作用，实际上，阻断底物接近活性位点。以此方式，它可起到微型酶原结构域或酶的“帽”的作用。
已知酶可被蛋白水解成片段，这些片段进行重构，从而再生活性酶。各种肽结构域重新聚集，并被非共价分子间力结合在一起。这种肽-蛋白相互作用的典型例子包括核糖核酸酶S-肽/核糖核酸酶S-蛋白的相互作用(Levit和Berger，1976)。核糖核酸酶S-肽在适当的位置与S-蛋白结合，所得复合物恢复了RNASE-S的酶活性。
根据本发明，活化结构域肽可与区域中的活化MMP再次结合，其中它们存在于形成非活性复合物的MMP酶原中。这种结合是可以测量的(见下文)。此外，19聚体(SEQ ID NO11)肽可通过其半胱氨酸残基与锌离子配合，防止催化。
MMP酶活性的抑制第一项抑制研究是用来源于MMP-2切割结构域区的19氨基酸肽(SEQ ID NO11)进行的。该肽是从CLUSTAL序列比对区中选择的，证实了最高程度的保守。所选择的19聚体(SEQ ID NO11)在N-末端是严格保守的，但在C-末端部分则显示出较高程度的变异性。此外，还对代表该肽N-末端和C-末端部分的两个较小的肽进行了试验。这两个部分大致把肽分成保守的N-末端部分(9聚体(SEQ ID NO12))和非-保守的C-末端部分(10聚体(SEQ ID NO13))。这不仅可以测试抑制的总体有效性，而且还可以测试选择性。
19聚体PRCGNPDVANYNFFPRKPK (SEQ ID NO11)9聚体 PRCGNPDVA(SEQ ID NO12)10聚体NYNFFPRKPK (SEQ ID NO13)在荧光测定法中，所有这3个肽都能抑制MMP-9。在所有研究情况下，与两个一半的肽相比，19聚体(SEQ ID NO11)是更好的酶抑制剂。9聚体(SEQ ID NO12)与C-末端的10聚体(SEQ ID NO13)肽相比，是更有效的抑制剂。这些结果表明，半胱氨酸作为锌配体是必需的，或者需要N-末端区来影响酶活性位点的空间阻断。这个假设可通过生产含有更多N-末端序列(残基100之前的有效氨基酸)的抑制剂肽而加以测试。使用19聚体(SEQ ID NO11)滴定MMP-9的典型抑制图在图4中给出。
使用10聚体(SEQ ID NO13)和9聚体(SEQ ID NO12)肽进行的类似抑制分析分别在图5和6中表示。在FRET测定法中，各肽都能够抑制MMP-9，抑制常数(Ki)为45.2-327.7μM(见表4)。与三个肽的相对抑制相比，底物选择(FRET肽或荧光胶原)的差异较小，但具有一致的趋势，即19聚体(SEQ ID NO11)＞9聚体(SEQ ID NO12)＞10聚体(SEQ ID NO13)。用肽滴定MMP-9的典型反应图在图7-9中给出。
总的说来，胶原底物的抑制常数稍低，胶原为30.3-221.3μM，FRET-肽为45.2-327.7μM。这些数据表明，当使用胶原底物时，肽在一定程度上是更有效的抑制剂，表明抑制剂肽可阻断活性位点，且因为胶原明显比FRET-肽底物更大，因此更容易阻止它接近酶活性位点。较小的FRET-肽底物可能更容易接近活性位点，甚至是在抑制剂肽存在的情况下也是如此。
典型的酶测定(如图4-7所示)通常进行30-40分钟。延时测定显示，19聚体(SEQ ID NO11)可有效抑制MMP-9催化的胶原水解直至超过1000分钟(图8)。与9聚体(SEQ ID NO12)肽相比，10聚体(SEQID NO13)肽在长时间阻止胶原破坏方面不是很有效(图9)。此外，19聚体(SEQ ID NO11)肽显示出最大程度的抑制。
对其它MMP酶进行类似的酶研究，从而测试19聚体(SEQ ID NO11)肽的有效性。这些测定法使用的是FRET肽，所述肽把特异性MMP切割位点插入到它们的序列中。19聚体(SEQ ID NO11)肽能够有效抑制多个MMP。19聚体(SEQ ID NO11)肽对各MMP的有效性如下MMP-2＞MMP-3＞MMP-8＞MMP-7＞MMP-9＞MMP-1，抑制剂常数为3.1μM(MMP-2)-41.1μM(MMP-1)。这些数据在表2中总结。
表4.抑制剂数据的总结

19聚体(SEQ ID NO11)肽的抗剪接活性MMP是以非活性酶原的形式生物合成产生的。利用各类膜结合MMP对酶原进行蛋白切割可导致MMP活化。酶原前导序列的长度大约为100个氨基酸(根据MMP不同它也会改变)，而且它是在蛋白的最氨基末端被找到的。抑制酶原活化对于降低慢性创伤中的MMP酶活性而言，可能是一种富有成效的方法。如果这些酶不能发挥作用，那么ECM降解的速率就会降低，从而导致慢性创伤愈合的速度加快。
很明显，活化结构域肽(19聚体(SEQ ID NO11)，9聚体(SEQ IDNO12)，和10聚体(SEQ ID NO13))可抑制各种MMP的酶活性。除这种活性之外，19聚体(SEQ ID NO11)肽还可阻碍MMP-9的酶原(非活性)形式的活化。因此，19聚体(SEQ ID NO11)肽可通过抑制已经活化的MMP或通过防止新合成的MMP酶原的活化而降低皮肤和慢性创伤渗出物内的总体MMP活性水平。
图11表示典型的剪接测定。在大约700秒时洗脱的第一个峰是MMP-9酶原。随着剪接反应的进行，该峰的强度降低(用向下的箭头标记)，并出现了两个新的峰。在大约800秒时洗脱下来的第一个新的峰是成熟的活性MMP-9。在大约1050秒时洗脱下来的第二个新的峰是酶原结构域。随着剪接反应的进行，这两个峰的强度增加(用向上的箭头标记)。当反应完成时，没有检测到剩余的MMP-9酶原。使用19聚体(SEQ ID NO11)肽滴定标准剪接反应可防止MMP-9酶原转化成酶原结构域及活性酶。图12表示这次滴定的结果。剪接可使用微摩尔的19聚体(SEQ ID NO11)肽以剂量依赖性的方式抑制。
等温滴定量热法量热法可用于测定19聚体(SEQ ID NO11)肽是否能与活性MMP-9形成稳定的非-共价复合物。这些数据可用于进一步理解酶抑制的机理和19聚体(SEQ ID NO11)肽的抗活化性。图13表示19聚体(SEQ IDNO11)MMP抑制剂与MMP-9之间相互作用的等温量热实验。将肽溶解在20mM二甲胂酸盐(pH6.8)，20mM NaCl中，使终浓度达到1mM。将MMP-9透析到相同的缓冲液中，终浓度为20μM。一系列标准注射是按照上面所述进行的。MMP-9与19聚体(SEQ ID NO11)之间相互作用的结果如下化学计量 0.975±0.02ΔH(kcal/mol) -26.1±1.45ΔS(cal mol-1K-1)-11.6±2.2KA(M-1) 1.65×106±4.5×104这些结果表明19聚体(SEQ ID NO11)肽与MMP-9之间的相互作用是焓驱动的，ΔH为负值。通过ΔS为负值可证实该反应不是熵促进的。然而，焓这个术语的数量级比术语TΔS要大，因此，总的自由能(ΔG)都是负值。
我们观察到了19聚体(SEQ ID NO11)与MMP-2的反应，并发现该反应是焓驱动的，并且是熵不利的。图14所示的等温量热分析是通过使用MMP-2滴定19聚体(SEQ ID NO11)产生的。下列值就是从这些实验获得的。
化学计量0.99±0.03ΔH(kcal/mol) -15.4±2.05ΔS(cal mol-1K-1) -21.1±1.8KA(M-1)2.40×106±-3.7×104因此，结合反应是熵不利的。这大概是由于结合后构型熵的损耗造成的。完全柔韧的肽含有大量自由度。在所有结合情况中，肽与MMP化学计量为1∶1，表明单一的19聚体(SEQ ID NO11)肽可与单一的MMP分子相互作用。
表面等离子共振19聚体(SEQ ID NO11)与MMP-9结合的动力学研究是使用表面等离子共振(SPR)技术进行的。传感器芯片是按照制造商推荐的标准化学把活性MMP-9连接在BIACore，Inc.的CM-5芯片的表面而构造的。使19聚体(SEQ ID NO11)在BIACore-XTM仪器中的MMP-9表面上流动，并实时监测结合及解离。典型的结合等温线在图15中表示。缔合相(30-430秒)与单一的结合位点模型最佳拟合，并产生2.2×104M-1s-1的缔合速率常数。解离相(440-700秒)同样拟合，并产生4.1×10-3s-1的解离速率常数(kd)。计算出来的5.3×106的平衡缔合常数(Ka＝ka/kd)与热力学数据非常一致。在解离开始时，观察到约100个反应单位的批量转运作用，它没有模型化。因此，19聚体(SEQ ID NO11)肽与MMP-9的结合是动力学和热力学促进的。
存活力测定法与很多小分子MMP抑制剂不同，当把本研究中的三个肽给予EpiDermTM皮肤模型时，它们对细胞是无毒的。图16表示，与PBS对照组相比，两个浓度(500μM和2mM)的肽都仅导致存活力稍稍降低。肽的总平均存活力为97.6％(19聚体(SEQ ID NO11))，89.6％(10聚体(SEQ ID NO13))，和95.8％(9聚体(SEQ ID NO12))。这些结果表明，用于慢性创伤愈合的这种肽治疗方法对于哺乳动物细胞是无毒的。图16中标绘的数据是三份样品的平均值。该研究存活力的标准差为2.2-3.7，而且与剂量或肽的同一性无关。肽浓度较高时，存活力稍低。
这些结果显示，EpiDermTM皮肤模型中的肽是无毒的，它们是动力学和熵促进的，从而与MMP形成结合复合物，而且它们可抑制酶活性并防止基质金属蛋白酶活化。
实施例2利用肽抑制剂使创伤愈合方法创伤是用4mm的活检钻孔器在C57BL6/KsJ db/db小鼠中制造的。小鼠从Jackson Laboratories获得，在开始进行创伤方案前，年龄为3-7个月。在制造创伤前，将所有小鼠麻醉。将皮肤拉离下面的结构，并使钻孔器穿过分离开的皮肤，从而在每只动物的上背部引入两处创伤。通常，所制造创伤的平均深度为1.7mm，范围在1.3-2.2mm。在制造创伤的过程中没有累及肌肉。创伤形成后，立即用标准盐水(作为非治疗对照组)或5μL 20μg/mL的19聚体肽(SEQ ID NO11)治疗。
每天都要对创伤进行数字照相，并通过使用计算机求照片的积分而测定创伤面积。所有创伤的治疗和随后的数据分析都是以盲法进行的(见，例如，Brown等，1994)。对所有创伤而言，将形成创伤时(第0天)的创伤面积任意设置为1的相对值；这样就可通过用第n天的创伤面积除以第0天的创伤面积而把后来的创伤面积转化成相对创伤面积。
结果从图17可看出，单一剂量19聚体肽的使用(在形成创伤时，第0天)可大大促进糖尿病小鼠模型中全部创伤闭合的时间。用19聚体肽处理过的创伤平均在形成创伤后的9天内闭合，而用盐水对照组处理过的创伤则在14天内闭合。此外，用19聚体肽(SEQ ID NO11)处理过的创伤显示出，炎症在创伤形成后的第1天减轻。此外还观察到，与盐水对照组处理过的相比，用19聚体肽(SEQ ID NO11)处理过的创伤开始收缩的过程更快(5天8天)。
实施例3利用肽抑制剂刺激成纤维细胞的生长本实施例提供的数据表明，本发明的肽可刺激成纤维细胞增殖。
材料和方法对人类皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常的人类真皮成纤维细胞，新生儿的，目录号CC-2509)进行测试，从而确定与本发明的肽接触是否能刺激细胞增殖。19聚体肽(SEQ ID NO11)对人类皮肤成纤维细胞系的增殖反应是使用没有血清的培养基作为对照，在96-孔平板测定系统中测量的。在水中制备含有0.5g/L 19聚体肽(SEQ ID NO11)的原液，然后用没有血清的Dulbecco′s改良的Eagle’s培养基(DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)稀释，从而形成含有1×10-4M，1×10-5M和1×10-6M肽的溶液。把细胞接种在96孔平板中，其浓度为在100μl含10％胎牛血清的DMEM中(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)含有1×103个细胞。在37℃、湿润的5％CO2气氛中，温育平板24小时。温育后，吸出培养基，并用100μl没有血清的DMEM洗涤该孔两次。吸出最后的洗出物，向20个孔中加入100μl 1×10-4M，1×10-5M或1×10-6M的19聚体(SEQ ID NO11)溶液。此外，将100μl赋形剂(没有血清的DMEM)加入到10个孔中作为对照。将所有的孔在37℃、湿润的5％CO2气氛中温育28小时。温育后，将20μl Cell Titer 96 Aqueous One溶液加入到所有孔中。轻轻旋转平板，放回到温育箱中温育45分钟，阅读490nm处的分光光度吸光度。使用单向ANOVA对结果进行统计学分析。
结果从图18可知，加入19聚体肽(SEQ ID NO11)可使成纤维细胞的生长以剂量依赖性的方式增加。没有加入19聚体肽的对照组具有最低的细胞密度。与没有接受19聚体肽的细胞相比，接受少至10-5M 19聚体(SEQ ID NO11，在图18中标记为19mer5)的细胞显示出明显更大的细胞密度(P＞0.01)。接受1×10-4M 19聚体(在图18中标记为“19mer4”)的细胞甚至显示出更大的细胞生长(P＞0.001)。然而，接受1×10-6M 19聚体(在图18中标记为“19mer6”)的细胞显示出少量的细胞增殖(P＜0.05)，而且在统计学上并不很显著。
因此，在对照组细胞和用19聚体肽(SEQ ID NO11)处理过的细胞之间可观察到细胞生长的统计学显著差异。以这些统计学显著差异为基础，19聚体肽(SEQ ID NO11)对于成纤维细胞而言似乎是一种良好的细胞增殖剂。
实施例4利用肽抑制剂刺激角质形成细胞的生长本实施例提供的数据表明，本发明的肽可刺激角质形成细胞的增殖。
材料和方法使来源于Clonetics的人类皮肤角质形成细胞系(Walkersville，MD，正常的人类表皮角质形成细胞，新生儿的，目录号cc-2503)与19聚体(SEQ ID NO11)接触，从而确定该肽是否能刺激角质形成细胞的增殖。这些人类皮肤角质形成细胞对19聚体肽(SEQID NO11)的增殖反应是使用角质形成细胞基本培养基(KBM，Clonetics，目录号CC-3103)作为对照，在96-孔测定系统中测量的。在水中制备含有0.5g/L 19聚体肽的原液，然后用KBM稀释，形成含有1×10-4M，1×10-5M和1×10-6M肽的溶液。将细胞接种在96孔平板中，浓度为在100μl KBM中含有2.5×103个细胞。在37℃、湿润的5％CO2气氛中，温育该平板24小时。温育后，向10个孔中各加入100μl1×10-4M，1×10-5M或1×10-6M的19聚体(SEQ ID NO11)溶液。此外，将100μl赋形剂KBM加入到10个孔中作为对照。将平板在37℃、湿润的5％CO2气氛中温育48小时。温育后，向所有孔中加入20μl CellTiter 96 Aqueous One溶液。轻轻旋转平板，然后放回到温育箱中温育3小时。阅读490nm处的分光光度吸光度。使用单向ANOVA对结果进行统计学分析。
结果从图19可知，加入19聚体肽(SEQ ID NO11)可使角质形成细胞的生长以剂量依赖性的方式增加。没有加入19聚体肽的对照组细胞具有最低的细胞密度。与没有接受19聚体肽的细胞相比，接受少至1×10-5M 19聚体(SEQ ID NO11，在图19中标记为19mer5)的细胞，显示出明显更大的细胞密度(P＞0.01)。接受1×10-4M 19聚体(在图19中标记为“19mer4”)的细胞甚至显示出更大的细胞生长(P＞0.001)。然而，接受1×10-6M 19聚体(在图19中标记为“19mer6”)的细胞显示出少量的细胞增殖(P＞0.05)，而且在统计学上并不显著。
因此，在对照组细胞和用19聚体肽(SEQ ID NO11)处理过的细胞之间可观察到统计学显著差异。因此，19聚体肽(SEQ ID NO11)对于角质形成细胞而言似乎是一种良好的细胞增殖剂。
实施例5肽抑制剂刺激成纤维细胞迁移本实施例提供的数据可举例说明本发明的肽可刺激成纤维细胞迁移。
材料和方法正常的人类真皮成纤维细胞(NHDF)是从Biowhittaker，(Walkersville，MD)获得的，并在含有胰岛素，hFGF-b，GA-100，和胎牛血清(10mL)的FBM培养基(500mL，Biowhittaker)中的T75瓶中增殖至传代12次。为了进行迁移测定，用10mL Hank′s缓冲盐溶液(HBSS)洗涤NHDF一次。将3毫升EDTA中的胰蛋白酶(0.25％)加入到T75瓶中不超过5分钟，从而除去瓶中的NHDF。将胰蛋白酶溶液中的NHDF加入到7mL没有添加物的FBM中。离心NHDF5分钟，除去上清液。将NHDF重悬浮在10mL FBM中进行计数。再次将NHDF离心5分钟，除去上清液。以1×106个细胞/mL的密度将NHDF重悬浮在没有添加物的FBM中。在迁移测定法中仅使用FBM培养基是很重要的，这是因为完全培养基含有成纤维细胞生长因子和血清，两者都可引发成纤维细胞迁移。
肽是由Microchemical Facility at Emory University或SigmaGenesis合成并纯化的。在进行HPLC后利用质谱对所有的肽进行分析，从而评估纯度。使用大约0.5-2.0毫克的肽制备新鲜原液(在PBS中的浓度为5mg/mL)，进行迁移测定。用PBS中的肽原液制备在FBM(没有添加物)中的更多稀释液(1mg/mL，100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL)用于迁移测定。
用90％乙醇洗涤具有8mm孔、没有聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯薄膜(Neuroprobe，Inc.，Gaithersburg，MD)15分钟，然后用去离子水清洗4次。把薄膜放在含有5μg/mL明胶水溶液的玻璃皿中。将玻璃皿放在约90℃的水浴中1小时。除去明胶溶液中的薄膜，在37℃的温育箱中干燥1小时。
使用48-孔趋化室(Neuroprobe，Inc.，Gaithersburg，MD)(见图20)进行迁移测定。将28μL各测试溶液一式四份加入到室底部的孔中。将明胶处理过的薄膜小心放在底部孔的上面。然后，将该室的垫圈和顶部小心放在薄膜的顶部。用6个指旋螺钉将该装置拧紧。含有估计细胞密度(2×105个细胞/mL)的NHDF溶液是通过把320μL 1×106个细胞/mL的溶液加入到1.28mL FBM(没有添加物)中制备的。将50μL2×105个细胞/mL的NHDF溶液加入到室中各孔的顶部。将该室放在37℃/5％CO2的温育箱中温育3小时。移去该室，卸去指旋螺钉，然后将该室倒放在纸巾上。移去该室的底部，揭去含有NHDF的薄膜，其中NHDF穿过面朝上的薄膜迁移。小心移开该薄膜。使用细胞刮刀(Neuroprobe，Inc.)，通过用PBS湿润薄膜的一侧而刮去薄膜中没有穿过薄膜迁移的细胞。用甲醇将薄膜固定，并用Diff-Quik染色溶液I和II染色。NHDF的核被染成了紫色。使用杉木浸渍油和盖玻片把膜固定在载玻片上。用Zeiss光学显微镜(25X物镜×10X目镜×1.25X)对与不同室相对应的三个区域中每个区域的三个独立视野上的细胞计数。从实验(肽)数据和阳性对照数据中减去阴性对照组中迁移NHDF的平均数。然后用与血浆纤连蛋白阳性对照组(1.25μg/mL)相比的迁移NHDF百分比表示该数据，如下NDHF迁移％＝ 结果如图21A(顶部)所示，成纤维细胞(NHDF)迁移所用的薄膜具有8μm的孔。化学引诱物溶液对通过薄膜迁移的成纤维细胞发出信号。一旦成纤维细胞穿过薄膜，它们就会粘附在化学引诱物一侧的膜上。如图21B(底部)所示，成纤维细胞的核被染成了紫色，从而进行可视计数。孔内捕获的细胞(孔看起来呈暗紫色)包括在总细胞计数中。阳性对照组的NHDF迁移导致每个视野的细胞数为27-60个NHDF。用于NHDF迁移测定中的阳性对照是血浆纤连蛋白(1.25μg/mL，溶解在FBM培养基中)。纤连蛋白是在创伤修复过程中帮助构成ECM的分子。与成纤维细胞α4β1整联蛋白受体结合的纤连蛋白在非常狭窄的浓度范围(0.8-1.6μg/mL)内是趋化性的。Postlethwaite，A.E.；Kang，A.H.“成纤维细胞化学引诱物”，Methods of Enzymology，vol.163，Academic PressNew York，1988，pp.694-707。每个视野的阴性对照(没有添加物的FBM培养基)细胞数在1-7个NHDF之间(＜阳性对照的10％)(见图22)。
将多个浓度的19聚体肽用于NHDF迁移测定中。因为血浆纤连蛋白对NHDF趋化的浓度范围较为狭窄，因此使用10-倍稀释的肽才能检测较大范围的浓度。如图23所示，19聚体肽的浓度高于0.1mg/mL时，有大量NHDF迁移通过薄膜(对1000μg/mL和100μg/mL而言，分别为55％±3％和46％±3％)。19聚体的浓度低于100μg/mL时，仅仅是微趋化性的。因为19聚体的这些浓度可诱导大约20％的NHDF迁移，而这仅仅约为阴性对照组NHDF迁移的两倍，因此不认为这些数据是显著性的。由两个不同商业来源制备的19聚体原液诱导的迁移没有差异(数据没有给出)。
合成19聚体序列的不同变异，并进行纯化，从而确定氨基酸序列的改变是否会影响成纤维细胞的迁移。其中对下列肽进行了试验9聚体PRCGNPDVA(SEQ ID N012)，10聚体NYNFFPRKPK(SEQ ID NO13)，14聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)，和17聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)。14聚体和17聚体肽序列分别是以进一步接近MMP-2和MMP-9的N-末端序列为基础的。9聚体(SEQID NO12)和10聚体(SEQ ID NO13)肽都可抑制MMP活性。19聚体(SEQ ID NO11)肽是用分别位于N和C末端的保护性乙酰基和酰胺基(Ac-10聚体)合成的，从而确定加入这些基团是否能改变对成纤维细胞迁移的作用。如图23所示，100(44±3％)和1000(40±6％)μg/mL的Ac-19聚体对成纤维细胞都是趋化性的。10聚体(SEQ ID NO13)肽在1000μg/mL(30±2％)时是趋化性的，但在100μg/mL(11±0％，与图22所示的阴性对照的数量级相似)时则不是。9聚体(SEQ ID NO12)在1000μg/mL(32±2％)时是趋化性的，但在100μg/mL(16±0％)时则不是。有趣的是，在9聚体的N-末端加入氨基酸可导致NHDF迁移的缺乏。14聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)在1000μg/mL-10ng/mL的浓度范围内都不能诱导NHDF迁移(数据没有给出)。因为不同肽之间的NHDF迁移有很大的改变，因此氨基酸序列对于NHDF的活化以及迁移而言可能很重要。
成纤维细胞到创伤位点的迁移对于适当愈合而言是至关重要的。19聚体肽(≥100μg/mL)，Ac-19聚体，9聚体，和10聚体衍生物的趋化性已经利用NHDF迁移测定法加以证实。因为9聚体和10聚体可诱导NHDF迁移至大约相等的程度，因此很难评估具体哪个氨基酸对活化是否是至关重要的。有趣的是，14聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)对成纤维细胞的移动性没有影响。虽然还不知道19聚体化学引诱的准确机理，但肽的氨基酸序列对于成纤维细胞的活化而言很重要。
实施例6肽抑制剂并不刺激中性粒细胞迁移本实施例提供的数据可举例说明本发明的肽不能刺激中性粒细胞迁移。
材料和方法肽是由Microchemical Facility at Emory University或SigmaGenesis合成并纯化的。进行HPLC后，利用质谱对所有的肽进行分析，从而评估纯度。使用约0.5-2.0毫克的肽制备新鲜的原液(在HBSS/HSA中的浓度为5mg/mL)，进行迁移测定。用肽原液制备在HBSS/HSA中的更多稀释液(1mg/mL，100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，100ng/mL，和10ng/mL)，用于测定。
中性粒细胞是通过把血液/EDTA混合物(大约20mL)铺在50mLFalcon试管中的HistopaqueTM1119(底层，18mL)和1077(顶层，7mL)这两层的上面而从人的血液(收集在含有EDTA的VacutainerTM试管中)中分离出来的。将该试管1800rpm离心30分钟(没有制动)。旋转后，试管中出现了4层(从顶层到底层)血浆，1077，1119，和红细胞。血浆和1077层之间的血沉棕黄层含有淋巴细胞，单核细胞及一些血小板。分离血浆层，血沉棕黄层，和绝大多数1077层并弃去。除去含有中性粒细胞的1119层，并放在洁净的50mL试管中。加入Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(DPBS)，使体积达到50mL。2100rpm离心该细胞15分钟。把细胞重悬浮在10mL DPBS中，然后转移到15mL试管中，2000rpm再次离心10分钟。重复该过程，第二次洗涤该细胞。除去上清液后，通过向每15mL上清液中加入6mL冷的无菌水而裂解红细胞。将细胞在水中混合30秒。然后加入6mL冷的2％无菌盐水。2000rpm再次离心该细胞10分钟。除去红色上清液(含有红细胞的血红蛋白)。重复红细胞的裂解过程2次或多次，从而除去所有红细胞。除去绝大部分红细胞后，将中性粒细胞重悬浮在10mL HBSS/HAS中，使用台盼蓝计数。将细胞离心，并以1.25×106个细胞/mL的浓度重悬浮在HBSS/HSA中。
中性粒细胞的迁移测定是用24-孔transwell平板(薄膜孔径为3μm)一式两份进行的。用20-40μL的HBSS/HSA(0.04-0.4％)预湿润transwell薄膜。向各孔底部加入趋化溶液(500μL)。将中性粒细胞(200μL 1.25×106个细胞/mL的溶液)加入到transwell的薄膜上。然后把transwell放在趋化溶液中。将平板放在温育箱(37℃，5％CO2)中1小时。使用台盼蓝对穿过薄膜迁移的细胞计数。
结果在中性粒细胞迁移实验中，分离出来的中性粒细胞约有95％是存活的。将中性粒细胞重悬浮在HBSS/0.4％HAS中，进行本实验。IL-8(在HBSS/0.4％HSA缓冲液中为10nM)用作中性粒细胞迁移的阳性对照。所用19聚体的浓度为1mg/mL，100，10和1μg/mL。
表5的第2栏描述了第一次实验的结果。阴性对照和阳性对照分别为HBSS/HAS和IL-8。
表5.各趋化性底物的中性粒细胞迁移百分比

*实验1的HSA浓度为0.4％，实验2的*HSA浓度为0.04％。
19聚体肽(SEQ ID NO11)诱导的中性粒细胞迁移与阴性对照组相似。加入IL-8导致通过薄膜迁移的中性粒细胞增加了81％。当阳性对照似乎较好地发挥作用时，阴性对照(29％)似乎十分高。因此，在第二个实验中，HSA的量降低了10-倍至0.04％。如表5第3栏所示，阴性对照迅速下降至0％中性粒细胞迁移。IL-8阳性对照也下降，但仍然显示出大量的中性粒细胞迁移(51％)。在第一个实验中，19聚体对中性粒细胞的迁移没有影响。
成纤维细胞到创伤位置的迁移对于适当愈合至关重要。19聚体肽(SEQ ID NO11)的趋化性已经利用NHDF迁移测定加以证实。然而，19聚体似乎对中性粒细胞的迁移没有影响。很可能有一种受体为成纤维细胞所固有，但不为中性粒细胞所固有的，它参与19聚体的识别，结合，及趋化性信号传递。
实施例7刺激胶原产生19聚体肽(SEQ ID NO11)对人类皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人真皮成纤维细胞，新生儿的，目录号CC-2509)中胶原产生的刺激反应是使用Panvera(Madison，WI)的TakaraBiomedicals EIA测定试剂盒(TAK MK101)测量的。首先，使用含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良的Eagle’s培养基(DMEM)，使细胞在96-孔测定系统中生长，其中的培养基和血清都是从SigmaChemical Co，St.Louis，MO购买的。没有血清的DMEM用作对照。在水中制备含0.5g/L 19聚体肽(SEQ ID NO11)的原液，然后用没有血清的DMEM稀释，形成含有1×10-5M和1×10-6M肽的溶液。以100μl含10％胎牛血清的DMEM(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中含有5×103个细胞的浓度，把细胞接种在96-孔平板中。在37℃、湿润的5％CO2气氛中温育该平板24小时。温育后，吸出培养基，用100μl没有血清的DMEM洗涤该孔两次。吸出最终的洗出物，向孔中加入100μl1×10-5M或1×10-6M的19聚体(SEQ ID NO11)溶液(各浓度的n＝2)。此外，将100μl赋形剂(没有血清的DMEM)加到4个孔中作为对照。将所有孔在37℃、湿润的5％CO2气氛中温育48小时。
使用来源于96-孔平板各孔的20μl上清液进行测定。标准缓冲液和终止溶液是在进行测定之前新制备的。使用预先包被抗体的96孔平板(用试剂盒供给)将100μl抗体-POD偶联物溶液(用试剂盒供给)加入到孔中。将20μl标准溶液和试验溶液(来源于含有成纤维细胞的96孔平板)加入到适当的孔中。轻轻混合平板，密封，37℃温育3小时。
温育后，用PBS缓冲液(400μl)仔细洗涤各孔4次。在使用任何液体洗涤结束后，完全清空所有孔。将100μl底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺的缓冲液，用试剂盒供给)加入到各孔中，温育平板15分钟。在该点，按照与底物相同的顺序向各孔中加入100μl终止溶液(新制备的1N H2SO4)。轻轻混合平板，在450nm处阅读吸光度。使用单向ANOVA对结果进行统计学分析。
结果如图24和表6所示，加入所用两种浓度的19聚体肽(SEQ ID NO11)都可导致胶原的产生增加。没有加入19聚体肽(SEQ ED NO11)的对照细胞具有最低量的胶原。10-5和10-6M浓度的19聚体肽(SEQ ID NO11)可产生统计学上显著(P＜0.001)量的胶原。这些结果表明，19聚体肽(SEQ ID NO11)可刺激胶原的产生。
表6数据的总结

参考文献以下参考文献和此处引用的任何其它参考文献都在此引入作为参考。
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序列表<110>S.奎尔克S.马利克J.M.比利亚努埃瓦<120>抗老化并使创伤愈合的化合物<130>16626.2<150>US 10/032,376<151>2001-12-21<150>US 10/153,185<151>2002-05-21<150>US 60/312,726<151>2001-08-16<160>21<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val1 5<210>2<211>44<212>PRT<213>人<400>2Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp35 40<210>3
<211>50<212>PRT<213>人<400>3Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn1 5 10 15Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Met Asn Leu35 40 45Thr Tyr50<210>4<211>56<212>PRT<213>人<400>4Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Lys Leu Ser Pro Arg1 5 10 15Val Met Glu Ile Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Glu Phe Ser Leu Met Pro Asn Ser Pro Lys Trp His Ser Arg Thr Val35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr50 55<210>5<211>54<212>PRT<213>人<400>5Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn50<210>6<211>55<212>PRT<213>人
<400>6Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Thr Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Ser Ser Phe Pro Gly Met Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr50 55<210>7<211>54<212>PRT<213>人<400>7Met Gln His Phe Leu Gly Leu Lys Val Thr Gly Gln Leu Asp Thr Ser1 5 10 15Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val His20 25 30His Phe Arg Glu Met Pro Gly Gly Pro Val Trp Arg Lys His Tyr Ile35 40 45Thr Tyr Arg Ile Asn Asn50<210>8<211>47<212>PRT<213>人<400>8Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His Asn35 40 45<210>9<211>54<212>PRT<213>人<400>9Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala
20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Glu Asn50<210>10<211>55<212>PRT<213>人<400>10Met Gln Arg Phe Phe Gly Leu Asn Val Thr Gly Lys Pro Asn Glu Glu1 5 10 15Thr Leu Asp Met Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Ser Gly20 25 30Gly Phe Met Leu Thr Pro Gly Asn Pro Lys Trp Glu Arg Thr Asn Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Arg Asn Tyr50 55<210>11<211>19<212>PRT<213>人<400>11Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg1 5 10 15Lys Pro Lys<210>12<211>9<212>PRT<213>人<400>12Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>人<400>13Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys
1 5 10<210>14<211>660<212>PRT<213>人<400>14Met Glu Ala Leu Met Ala Arg Gly Ala Leu Thr Gly Pro Leu Arg Ala1 5 10 15Leu Cys Leu Leu Gly Cys Leu Leu Ser His Ala Ala Ala Ala Pro Ser20 25 30Pro Ile Ile Lys Phe Pro Gly Asp Val Ala Pro Lys Thr Asp Lys Glu35 40 45Leu Ala Val Gln Tyr Leu Asn Thr Phe Tyr Gly Cys Pro Lys Glu Ser50 55 60Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gln Lys Phe65 70 75 80Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn Thr Ile Glu Thr85 90 95Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe100 105 110Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp Lys Asn Gln Ile Thr Tyr Arg Ile115 120 125Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe130 135 140Ala Arg Ala Phe Gln Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Ser145 150 155 160Arg Ile His Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp165 170 175Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala180 185 190His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Val Gly Gly Asp Ser His Phe Asp195 200 205Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gln Val Val Arg Val Lys210 215 220Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn225 230 235 240Gly Lys Gln Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe245 250 255Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly260 265 270Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly275 280 285Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser290 295 300Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr305 310 315 320
Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala325 330 335Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro340 345 350Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg355 360 365Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp370 375 380Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val385 390 395 400Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp405 410 415Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg420 425 430Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser435 440 445Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val450 455 460Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln465 470 475 480Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr485 490 495Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe500 505 510Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln515 520 525Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser530 535 540Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly545 550 555 560Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys565 570 575Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn580 585 590Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp595 600 605Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln610 615 620Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu625 630 635 640Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp645 650 655Trp Leu Gly Cys660<210>15<211>43<212>PRT
<213>人<400>15Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp35 40<210>16<211>43<212>PRT<213>人<400>16Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp35 40<210>17<211>43<212>PRT<213>人<400>17Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp35 40<210>18<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能够抑制金属蛋白酶活性的肽<221>位点<222>2<223>Xaa＝谷氨酰胺或谷氨酸
<221>位点<222>5<223>Xaa＝天门冬氨酸或谷氨酸<221>位点<222>8<223>Xaa＝谷氨酰胺或丝氨酸<221>位点<222>9<223>Xaa＝天门冬酰胺或丙氨酸<221>位点<222>11<223>Xaa＝异亮氨酸或亮氨酸<221>位点<222>(12)...(12)<223>Xaa＝谷氨酸或赖氨酸<221>位点<222>(13)...(13)<223>Xaa＝苏氨酸或丙氨酸<221>位点<222>(16)...(16)<223>Xaa＝赖氨酸或苏氨酸<221>位点<222>(21)...(21)<223>Xaa＝缬氨酸或天门冬酰胺<221>位点<222>(24)...(24)<223>Xaa＝缬氨酸或亮氨酸<221>位点<222>(25)...(25)<223>Xaa＝丙氨酸或甘氨酸<221>位点<222>(26)...(26)<223>Xaa＝天门冬酰胺或精氨酸<221>位点<222>(27)...(27)<223>Xaa＝酪氨酸或苯丙氨酸
<221>位点<222>(28)...(28)<223>Xaa＝天门冬酰胺或谷氨酰胺<221>位点<222>(29)...(29)<223>Xaa＝苯丙氨酸或苏氨酸<221>位点<222>(31)...(31)<223>Xaa＝脯氨酸或谷氨酸<221>位点<222>(32)...(32)<223>Xaa＝精氨酸或甘氨酸<221>位点<222>(33)...(33)<223>Xaa＝赖氨酸或天门冬氨酸<221>位点<222>(34)...(34)<223>Xaa＝脯氨酸或亮氨酸<400>18Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Pro Arg Cys Gly Xaa Pro Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Lys35<210>19<211>14<212>PRT<213>人<400>19Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn1 5 10<210>20<211>17<212>PRT<213>人<400>20Thr Leu Lys Ala Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala
1 5 10 15Asn<210>21<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能够抑制金属蛋白酶活性的肽<221>位点<222>2<223>Xaa＝谷氨酰胺或谷氨酸<221>位点<222>5<223>Xaa＝天门冬氨酸或谷氨酸<221>位点<222>8<223>Xaa＝谷氨酸或丝氨酸<221>位点<222>9<223>Xaa＝天门冬酰胺或丙氨酸<221>位点<222>11<223>Xaa＝异亮氨酸或亮氨酸<221>位点<222>(12)...(12)<223>Xaa＝谷氨酸或赖氨酸<221>位点<222>(13)...(13)<223>Xaa＝苏氨酸或丙氨酸<221>位点<222>(16)...(16)<223>Xaa＝赖氨酸或苏氨酸<221>位点<222>(17)...(17)<223>Xaa＝任何非极性氨基酸
<221>位点<222>(18)...(18)<223>Xaa＝任何碱性氨基酸<221>位点<222>(19)...(19)<223>Xaa＝任何半胱氨酸样氨基酸<221>位点<222>(20)...(20)<223>Xaa＝任何非极性氨基酸<221>位点<222>(21)...(21)<223>Xaa＝任何极性或脂族氨基酸<221>位点<222>(22)...(22)<223>Xaa＝任何非极性氨基酸<221>位点<222>(23)...(23)<223>Xaa＝任何酸性氨基酸<221>位点<222>(24)...(24)<223>Xaa＝任何脂族或极性氨基酸<221>位点<222>(25)...(25)<223>Xaa＝任何脂族、非极性或碱性氨基酸<221>位点<222>(26)...(26)<223>Xaa＝任何极性、酸性、碱性或非极性氨基酸<221>位点<222>(27)...(27)<223>Xaa＝任何极性或芳族氨基酸<221>位点<222>(28)...(28)<223>Xaa＝任何极性、碱性、脂族或非极性氨基酸<221>位点<222>(29)...(29)<223>Xaa＝任何芳族、脂族、极性或酸性氨基酸
<221>位点<222>(30)...(30)<223>Xaa＝任何芳族、非极性或极性氨基酸<221>位点<222>(31)...(31)<223>Xaa＝任何非极性或酸性氨基酸<221>位点<222>(32)...(32)<223>Xaa＝任何碱性、极性或非极性氨基酸<221>位点<222>(33)...(33)<223>Xaa＝任何碱性、极性、脂族、非极性或酸性氨基酸<221>位点<222>(34)...(34)<223>Xaa＝任何极性或脂族氨基酸<221>位点<222>(35)...(35)<223>Xaa＝任何碱性或脂族氨基酸<400>21Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa3权利要求
1.一种含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ IDNO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，或SEQ ID NO17的肽，其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
3.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
4.一种含有治疗有效量的式I的肽和药学上可接受的载体的组合物Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
5.一种含有治疗有效量的式II的肽和药学上可接受的载体的组合物Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)其中Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
6.一种含有治疗有效量的式III的肽和药学上可接受的载体的组合物Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
7.一种含有治疗有效量的式IV的肽和药学上可接受的载体的组合物Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaab-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸；Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸； Xaa4是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天门冬氨酸； Xaa7是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸；Xaa8是缬氨酸或亮氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是苏氨酸； Xaa10是天门冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸；Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸； Xaa12是天门冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是苏氨酸或丙氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸； Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是赖氨酸或天门冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是赖氨酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
8.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
9.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中碱性氨基酸是组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。
10.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
11.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中脂族氨基酸是丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸。
12.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中酸性氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
13.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中极性氨基酸是天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
14.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
15.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中所述肽还可抑制基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-5，基质金属蛋白酶-6，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-8，和基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-10，基质金属蛋白酶-11，基质金属蛋白酶-12，或基质金属蛋白酶-13中任何一种的蛋白酶活性。
16.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
17.根据权利要求4-7任何一项所述的组合物，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
18.一种含有治疗有效量的肽和药学上可接受的载体的组合物，其中所述肽含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEO ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ ID NO13。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-4，基质金属蛋白酶-5，基质金属蛋白酶-6，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-8，和基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-10，基质金属蛋白酶-11，基质金属蛋白酶-12，或基质金属蛋白酶中任何一种的蛋白酶活性。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述肽可刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞生长。
21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
23.一种含有式I的肽的创伤敷料Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa-Xaa8-Xaa9(I)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
24.一种含有式II的肽的创伤敷料Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)其中Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
25.一种含有式III的肽的创伤敷料Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
26.一种含有式IV的肽的创伤敷料Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸； Xaa4是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天门冬氨酸； Xaa7是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸； Xaa8是缬氨酸或亮氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是苏氨酸； Xaa10是天门冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸； Xaa12是天门冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是苏氨酸或丙氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸； Xaa15是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是赖氨酸或天门冬氨酸；Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是赖氨酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
27.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
28.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中碱性氨基酸是组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。
29.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
30.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中脂族氨基酸是丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸。
31.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中酸性氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
32.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中极性氨基酸是天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
33.根据权利要求23-26任何一项所述的创伤敷料，其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
34.一种含肽的创伤敷料，所述肽含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ IDNO12，或SEQ ID NO13，其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
35.根据权利要求23-26或34任何一项所述的创伤敷料，其中所述肽可刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞生长。
36.根据权利要求23-26或34任何一项所述的创伤敷料，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
37.根据权利要求23-26或34任何一项所述的创伤敷料，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
38.根据权利要求23-26或34任何一项所述的创伤敷料，其中所述敷料促进创伤愈合，防止瘢痕形成，改善皮肤张力，减少皱纹，或刺激平滑，健康皮肤的发育。
39.一种用于处理皮肤从而减轻老化作用的洗液，含有式I的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
40.一种用于处理皮肤从而减轻老化作用的洗液，含有式II的肽Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)其中Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
41.一种用于处理皮肤从而减轻老化作用的洗液，含有式III的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
42.一种用于处理皮肤从而减轻老化作用的洗液，含有式IV的肽Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸； Xaa4是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天门冬氨酸； Xaa7是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸； Xaa8是缬氨酸或亮氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是苏氨酸； Xaa10是天门冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸； Xaa12是天门冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是苏氨酸或丙氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸； Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是赖氨酸或天门冬氨酸；Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是赖氨酸；且其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶-2或刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
43.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
44.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中碱性氨基酸是组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。
45.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
46.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中脂族氨基酸是丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基异丁酸。
47.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中酸性氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
48.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中极性氨基酸是天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
49.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
50.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中所述敷料改善皮肤张力，减少皱纹，或刺激平滑，健康皮肤的发育。
51.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中所述肽可刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞生长。
52.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
53.根据权利要求39-42任何一项所述的洗液，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
54.一种含肽的洗液，所述肽含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ ID NO13，其中所述肽可抑制基质金属蛋白酶。
55.根据权利要求54所述的洗液，其中所述肽可刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
56.根据权利要求54所述的洗液，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
57.根据权利要求54所述的洗液，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
58.一种促进健康皮肤发育的方法，包括给予治疗有效量的式I的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；且其中所述肽能够抑制基质金属蛋白酶的活性或促进成纤维细胞或角质形成细胞的生长。
59.一种促进健康皮肤发育的方法，包括给予治疗有效量的式II的肽Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)其中Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽能够抑制基质金属蛋白酶的活性或促进成纤维细胞或角质形成细胞的生长。
60.一种促进健康皮肤发育的方法，包括给予治疗有效量的式III的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族，非极性或碱性氨基酸；Xaa10是极性，酸性，碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性，碱性，脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性，极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性，极性，脂族，非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽能够抑制基质金属蛋白酶的活性或促进成纤维细胞或角质形成细胞的生长。
61.一种促进健康皮肤发育的方法，包括给予治疗有效量的式IV的肽Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸； Xaa4是甘氨酸；Xaae是天门冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天门冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天门冬氨酸； Xaa7是天门冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸； Xaa8是缬氨酸或亮氨酸；Xaai是天门冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是苏氨酸； Xaa10是天门冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸； Xaa12是天门冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是苏氨酸或丙氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸； Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是赖氨酸或天门冬氨酸；Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是赖氨酸；且其中所述肽能够抑制基质金属蛋白酶的活性或促进成纤维细胞或角质形成细胞的生长。
62.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，该方法促进创伤愈合，防止斑痕形成，改善皮肤张力，减少皱纹，或刺激平滑，健康皮肤的发育。
63.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中所述肽含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ ID NO13。
64.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
65.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中碱性氨基酸是组氨酸，赖氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鸟氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。
66.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
67.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中脂族氨基酸是丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基异亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基缬氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸。
68.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中酸性氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
69.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中极性氨基酸是天门冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基赖氨酸，甲硫氨酸亚砜，或高丝氨酸，或非极性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
70.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
71.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中所述肽可刺激成纤维细胞或角质形成细胞的细胞增殖。
72.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中所述肽是成纤维细胞或角质形成细胞的化学引诱物。
73.根据权利要求58-61任何一项所述的方法，其中所述肽可刺激成纤维细胞中胶原的产生。
全文摘要
本发明提供用于促进健康皮肤发育并治疗创伤的基质金属蛋白酶抑制剂。所述抑制剂为肽，肽的序列与基质金属蛋白酶的酶原形式的切割区有关。本发明的肽抑制剂可配制成促进愈合及健康皮肤发育，阻碍瘢痕形成和起皱纹，并改善愈合效果的治疗组合物，洗液，乳膏，皮肤遮盖物和创伤敷料。
文档编号C07K14/00GK1543503SQ02815134
公开日2004年11月3日 申请日期2002年8月15日 优先权日2001年8月16日
发明者S·奎尔克, S·马利克, J·M·维拉纽伊娃, S 奎尔克, 维拉纽伊娃 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司