专利名称：用于创伤护理和/或其它组织愈合应用的支架材料的制作方法
用于创伤护理和/或其它组织愈合应用的支架材料领域
本发明涉及用于创伤护理和/或其它组织愈合应用的支架材料及其制备方法。支架材料包含来自鱼皮的脱细胞细胞外基质。背景
目前将多种人、动物和合成材料描述或用于医学程序以增强、修复或纠正组织缺陷。例如美国公布专利申请号2003/0059460公开一种杂化聚合物材料，其包含可用于活体组织再生的合成和天然聚合物。杂化物包含交联的天然存在的聚合物和生物降解-可吸收的合成聚合物。但是，必须采取一系列复杂的加工步骤以制备该杂化材料。此外，所得杂化材料含有合成以及天然存在的材料。 美国专利号6，541，023描述来自鱼皮的多孔胶原凝胶用作组织工程支架的用途。制备胶原凝胶包括研磨鱼皮。另外，中国专利号1068703描述制备用于敷裹烧伤创伤的鱼皮的方法，包括从鱼体分离鱼皮，将该皮肤置于足以建立2. 5-3的pH值的量的碘酊、乙醇、樟醇、磺胺嘧啶锌和盐酸的防腐液中。但是，这些产物可能难以处理，因为美国专利号6，541，023的产物为凝胶形式，中国专利号1068703的产物贮存于溶液中。此外，源自人皮肤(ALL0DERM 再生组织基质(LifeCell));胎牛真皮(PRIMATRIX 皮肤修复支架(TEI Biosciences));猪膀胱(MATRISTEM 细胞外基质创伤片(Medline Industries, Inc.));和猪小肠黏膜下层(OASIS 创伤基质(HealthpointLtd.))已产生多种用于医疗用途的细胞外基质产物。但是，需要改良的产品和方法以增强创伤愈合和组织修复。本发明满足这种需要。概述
脊椎动物的细胞外基质(ECM)是包围和支持细胞的复杂结构实体。ECM由结构蛋白的复杂混合物组成，其中最丰富的是胶原，及其它特化的蛋白和蛋白聚糖。本文描述的支架材料是来自鱼皮的天然生物ECM组分的非常完整的无细胞支架。该支架还可包含来自鱼皮的天然存在的脂质。皮肤ECM的天然三维结构、组成和功能基本不变，并提供支架以支持细胞移行、粘附、增殖和分化，由此促进组织的修复和/或更换。本发明还涉及该支架材料的制备方法和使用方法。附图
简述
图I显示根据本文所述方法用鱼皮制备的脱细胞ECM产物(支架材料)的示例性样
品;
图2显示以IOOx (2A)和400x (2B)放大的支架材料横截面的光学图像；
图3显示以300x (3A)和600x (3B)放大的支架材料横截面的扫描电镜(SEM)图像。描述
本发明的支架材料由完整鱼皮获得。图I显示示例性样品，其显示支架材料样品的外观。任何物种的鱼，包括硬骨鱼或软骨鱼，都可用作鱼皮来源。例如来源可以是圆型鱼如鳕鱼、黑线鳕和It鱼；比目鱼，如大比目鱼、鲽鱼和鳎鱼；鲑鱼如大马哈鱼和鳟鱼；鲭科如鲔鱼；或者小型鱼如青鱼、凤尾鱼、鲭鱼和沙丁鱼。在某些实施方案中鱼皮由冷水多脂鱼和/或已知含有大量ω-3油的鱼获得。ω-3油高的鱼的实例是大马哈鱼、青鳞鱼、鲔鱼、青鱼、鳕鱼、沙丁鱼、鲭鱼、裸盖鱼(sable fish)、胡瓜鱼、白鲑、南极鳕鱼(hoki fish)和一些鳟鱼品种。在加工之前从鱼去除鱼皮。如果鱼皮来自有鳞品种的鱼,应当将鱼皮去鳞以便除去实质部分的鳞或者至少从鳞除去羟磷灰石。短语“除去实质部分的鳞”或者“基本无鳞”指除去鱼皮上至少95%，优选至少99%，更优选100%的鳞。“基本无鳞的”鱼皮还可指来自无鳞品种鱼的鱼皮。要么在所有加工之前，用单纯的机械压力(通过例如刀、与研磨剂一起振荡、水压、使用与刀相同的机械力的专用去鳞设备或其它压力设备，如用陶瓷或塑料抛光)除去鳞，要么在某种化学处理(如脱细胞)之后除去鳞，然后用机械压力洗掉鳞。如果将鱼皮首先化学和/或酶处理(如用TRITON X-100处理)，机械压力一般需要柔和，因为在脱细胞之后皮肤更容易撕裂受损。可以多于一个的步骤去鳞，例如在脱细胞前部分除去，接着在脱细胞期间和/或之后进一步除去。或者可以只通过化学处理去鳞。在鳞已除去后，将鱼皮在脱细胞前任选冷冻。可通过将皮肤培养在液氮中或者用 其它可将皮肤冷冻至-70°C或更低的专用冷冻装备将鱼皮快速冷冻，以保存支架的胶原结构。或者，可将鱼皮冷冻在通常见于鱼厂的常规类型冷冻库中。冷冻过程可溶解或部分溶解构成完整鱼皮的细胞，帮助促进鱼皮脱细胞。如果鱼皮已冷冻，可将其稍后解冻用于进一步加工。无论鱼皮是否冷冻，在进一步加工之前都可将其用缓冲液洗涤。例如可将鱼皮用缓冲液洗涤1-3次，缓冲液任选含有一种或多种抗氧化剂(如抗坏血酸(比如50 mM抗坏血酸)，维生素A、C、E，和β-胡萝卜素)，抗生素(如链霉素和青霉素)，蛋白酶(如分散酶II)和蛋白酶抑制剂(如抗痛素、抑肽酶、苯甲脒、苯丁抑制素、DFP、EDTA、EGTA、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素、膦酰二肽和PMSF)以促进鱼皮的消毒和稳定化。缓冲液可为至少5. 5的pH，比如6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10. O或更大。在某些实施方案中pH为7. 0-9.0，如7. 5-8. 5。缓冲液还可用作其中可将鱼皮贮存几天至几周或更久的介质。在某些实施方案中将鱼皮贮存于约4V温度的该缓冲液中。在冷冻和/或洗涤和/或贮存于缓冲液中后，将鱼皮用一种或多种脱细胞溶液处理以除去鱼皮的细胞材料，包括抗原材料，而对天然存在的细胞外基质的机械完整性和结构完整性和生物活性有最小限度的损害乃至无损害。术语“细胞外基质”或“ECM”用于本文指存在于鱼皮内的无细胞组织材料，除了执行各种其它重要功能外为皮肤细胞提供结构支持。本文描述的ECM不包括已完全用提取、纯化或分离的ECM组分(如胶原)构成或再形成的基质材料。术语“无细胞的”、“脱细胞的”、“脱细胞的鱼皮”等用于本文指从中已除去基本量细胞和核酸内容物剩下复杂的ECM三维间质结构的鱼皮。“脱细胞剂”是从ECM有效除去基本量细胞和核酸内容物的那些剂。当已从ECM除去至少50%活力和无活力核酸及其它细胞材料时，将ECM称为“脱细胞的”或“基本不含”细胞和核酸内容物(即已除去“基本量”)。在某些实施方案中，除去约 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99. 5%或100%活力和无活力核酸和细胞材料。脱细胞可通过例如测试经处理鱼皮的DNA含量验证。可以例如通过ECM的组织学检查，和/或通过生化测定比如PIC0GREEN 测定、二苯胺测定，或者通过PCR，确定从ECM除去的核酸。脱细胞破坏细胞膜和释放细胞内容物。脱细胞可涉及一种或多种物理处理、一种或多种化学处理、一种或多种酶处理或其任何组合。物理处理的实例是声处理、机械搅动、机械按摩、机械压力和冷冻/解冻。化学脱细胞剂的实例是离子盐(如叠氮钠)、碱、酸、去污剂(如非离子和离子去污剂)、氧化剂(如过氧化氢和过氧酸)、低渗溶液、高渗溶液、螯合剂(如EDTA和EGTA)、有机溶剂(如三(正丁基)_磷酸酯)、抗坏血酸、蛋氨酸、半胱氨酸、马来酸和与DNA结合的聚合物(如聚-L-赖氨酸，聚乙烯亚胺(PEI)，和聚酰胺胺(PAMAM))。非离子去污剂包括4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚(TRITON X-100) (Dow Chemical Co·)。离子去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、TRITON X-200和两性离子去污剂(如CHAPS)。其它合适的脱细胞去污剂包括聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯(80)脱水山梨醇单油酸酯(Tween 20和80)、3_[ (3_氯氨基丙基)-二甲氨基]_1_丙-磺酸酯、辛基-葡糖苷和十二烷基硫酸钠。酶脱细胞剂的实例是蛋白酶、核酸内切酶和核酸外切酶。蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、 金属蛋白酶(如热解素)和谷氨酸蛋白酶。脱细胞一般在至少5. 5的pH进行，比如6.0，6.5，7. O, 7.5，8. O, 8.5，9. O, 9.5，10. O 或更大。在某些实施方案中 pH 为 7. 0-9. 0，如 7. 5-8. 5。脱细胞步骤的实施例是将鱼皮培养在包含I M NaCl, 2%脱氧胆酸，O. 02%叠氮钠和500 ppm链霉素的溶液中。在另一个实施例中，将鱼皮用包含蛋白酶(如2. 5 U/mL分散酶II)及其它组分(如O. 02%叠氮钠)的第一脱细胞溶液培养。倒出第一脱细胞溶液，然后将鱼皮用第二脱细胞溶液处理，比如包含去污剂(如O. 5% TRITON X-100)及其它组分(如O. 02%叠氮钠)的溶液。在另一个实施例，将鱼皮首先用包含去污剂(如O. 5% TRITON X-100)及其它组分(如0.02% EDTA、叠氮钠和/或脱氧胆酸)的脱细胞溶液处理，然后培养在包含去污剂比如SDS的第二脱细胞溶液中。鱼皮可以在或不在振荡下培养。通过倒出任何剩余的脱细胞溶液，用缓冲液(如Hank’s平衡盐溶液)任选洗涤鱼皮，然后用另一个脱细胞步骤再次处理鱼皮，可根据需要重复脱细胞步骤。一旦已除去足量细胞材料，可去除脱细胞溶液(如通过抽吸或通过轻轻地倒出溶液)。在脱细胞后，可将鱼皮任选用水、缓冲溶液和/或盐溶液洗涤。合适洗涤溶液的实例包括Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、Medium 199(M199, SAFC Biosciences, Inc.)和/或L-谷氨酰胺。洗漆步骤一般在至少5. 5的pH进行，比如6.0，6.5，7. O, 7.5，8. O, 8.5，9. O, 9.5，10. O或更大。在某些实施方案中pH为 7. 0-9. 0，如 7. 5-8. 5。可将鱼皮任选漂白以改善终产物的外观。漂白可在脱细胞之前、之后和/或同时进行。例如，可将一种或多种漂白剂掺入一种或多种脱细胞溶液内和/或一种或多种缓冲溶液内。漂白剂的实例包括亚硫酸钠、过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾和过硫酸钠。在某些实施方案中，如果使用强漂白剂如过硫酸盐，漂白和脱细胞可合并为单个步骤，包含将鱼皮培养在漂白剂、增稠剂和过氧化物源中的一种或多种的混合物中。例如，可制备干漂白混合物(见如描述于实施例5的“漂白混合物”)，接着加入水、过氧化氢或其组合至干混合物中以形成漂白溶液，该漂白溶液还足以脱细胞。漂白剂(如亚硫酸钠、过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾和过硫酸钠)应占干混合物约40-60% w/w。可将EDTA和过硫酸盐的组合加入混合物以加速漂白和脱细胞。在某些实施方案中EDTA在干混合物中的浓度为约O. 25-5% w/W。过氧化氢可占混合物约15-25%;过氧化物源可以是过碳酸钠和过碳酸钾。磷酸钠过水合物和碳酸钠或偏硅酸镁和硅酸硅也可用作过氧化物源。干混合物还可包括硅石和水合硅石，例如以1-10% w/w，和任选的一种或多种硬脂酸盐(如硬酯酸铵、硬脂酸钠和/或硬脂酸镁)。此外干混合物可任选包括增稠剂，比如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、藻素(即藻酸盐)、有机树胶(如纤维素、黄原胶)、偏硅酸钠及其组合，以增加漂白/脱细胞溶液的粘度和保护蛋白纤维免受损害。漂白和/或漂白加脱细胞一般在至少5. 5的pH进行，比如6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10. O或更大。在某些实施方案中pH为7. 0-9. 0，如7. 5-8. 5。在漂白和/或漂白加脱细胞后，将鱼皮在上文描述的pH条件下用包含L-谷氨酰胺的溶液任选洗涤。在某些实施方案中，用消化酶处理鱼皮。与漂白类似，消化可在脱细胞之前、之后和/或同时进行。合适的酶包括蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。在某些实施方案中消化酶是丝氨酸蛋 白酶比如胰蛋白酶。消化酶可以是在碱性环境中发挥作用的酶，限制ECM内交联，并软化鱼皮。消化一般在至少 5. 5 的 pH 进行，比如 6. O, 6. 5，7. O, 7. 5，8. O, 8. 5，9. O, 9. 5，10. O或更大。在某些实施方案中pH为7. 0-9. O,如7. 5-8. 5。可将脱细胞的鱼皮任选冷藏。冷藏可包括在冷冻之前将鱼皮浸在冷冻保护剂溶液中。冷冻保护剂溶液一般包含适当的缓冲剂、一种或多种冷冻保护剂和任选溶剂，如有机溶齐U，其与水组合发生最小程度的膨胀和收缩。冷冻保护剂的实例包括蔗糖、棉子糖、右旋糖酐、海藻糖、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、甘油、丙二醇、2-甲基-2，4-pantandial、某些抗冻蛋白和肽，及其组合。或者，如果将脱细胞的鱼皮速冻(闪冻)之后升华以将冷冻步骤期间形成的冰晶减到最少，可将该皮肤任选冷冻在不包括冷冻保护剂的缓冲液中。冷藏一般在至少 5. 5 的 pH 进行，比如 6. O, 6. 5，7. O, 7. 5，8. O, 8. 5，9. O, 9. 5，10. O 或更大。在某些实施方案中pH为7. 0-9. O,如7. 5-8. 5。可将脱细胞的鱼皮包装在无菌容器比如玻璃管瓶或袋内。在一个实施方案中，使用TYVEK 袋。例如可将鱼皮培养在冷冻保护剂溶液中，包装在TYVEK 袋内，然后放入冷冻干燥器中，以与冷冻保护剂相容的速率冷冻。可将脱细胞的鱼皮冻干，即在低温和真空条件下冷冻以便在没有冰重结晶的情况下从各冰晶相连续除去水。在冻干期间，一般首先经过升华除水，然后如果需要则经过解吸除水。另一种在加工后和灭菌前除去过量水的方法是真空加压。在某些实施方案中，在冷冻之前和/或之后将脱细胞的鱼皮灭菌。灭菌方法在本领域众所周知。例如可将脱细胞的鱼皮置于环氧乙烷室中，用合适的环氧乙烷循环来处理。其它灭菌方法包括用臭氧、二氧化碳、气态甲醛或辐射(如Y辐射、X-射线、电子束加工和亚原子粒子)灭菌。作为冷冻、冷冻-干燥和/或水的真空加压的替代或补充，可将脱细胞的鱼皮保存在非水溶液比如醇中。所得产物(支架材料)是具备可促进组织再生、修复和/或更换(如内源性组织的修复、再生和/或生长)的性质的无菌、胶原基基质。术语“支架材料”指包含已被脱细胞和任选漂白、消化、冻干等(如上文讨论)的鱼皮的材料。支架材料可提供完整支架用于支持内皮和/或上皮细胞，可由宿主整合，可生物相容，不显著钙化，并可在环境温度贮存和运输。短语“由宿主整合”在本文指用支架材料处理的患者的细胞和组织可长入支架材料内并且支架材料的确整合/吸收入患者体内。术语“可生物相容”指在其预期使用的体内环境中基本无毒，并且基本不被患者生理系统排斥(即非抗原性)的材料。这可通过材料通过生物相容性测试的能力测量，所述测试陈述于国际标准组织(ISO)标准号10993和/或美国药典(USP) 23和/或美国食品药品管理局(FDA)蓝皮书备忘录号G95-1，题为 〃Use of International Standard IS0-10993, Biological Evaluation of MedicalDevices Part I: Evaluation and Testing(国际标准 IS0-10993 的使用，医疗装置生物评价部分I :评价和测试)"。通常，这些测试测量材料的毒性、传染性、致热原性、刺激可能性、反应性、溶血活性、致癌性和/或免疫原性。生物相容性结构或材料，当引入大部分患者时，将不引起显著的不良、长期或扩大的生物学反应或应答，并区别于手术或将异物植入活体内通常伴随的轻微、暂时性炎症。持续高水平的基质金属蛋白酶(MMP)可促成创伤慢性。本文所述支架材料可吸收 基质金属蛋白酶(MMP)从而促进创伤愈合和从慢性转变为急性创伤。支架材料含有来自鱼皮细胞外基质(ECM)的蛋白质。支架材料中的ECM组分可包括例如结构蛋白；粘附糖蛋白；蛋白聚糖；非蛋白聚糖多糖；和基质细胞(matricelIular)蛋白。结构蛋白的实例包括胶原(ECM中最丰富的蛋白)，比如原纤维胶原(I，II，III，V和XI型)；间断三股螺旋的原纤维缔合(facit)胶原(IX，XII和XIV型)，短链胶原(VIII和X型)，基底膜胶原(IV型)，及其它胶原(VI，VII和XIII型)；弹力蛋白；和层粘连蛋白。粘附糖蛋白的实例包括纤维连接蛋白；细胞粘合素；和血小板反应素。蛋白聚糖的实例包括硫酸肝素；硫酸软骨素；和硫酸角质素。非蛋白聚糖多糖的实例是透明质酸。基质细胞蛋白是一组在结构上不同的细胞外蛋白，通过与细胞表面受体、细胞因子、生长因子、蛋白酶和ECM的相互作用调节细胞功能。实例包括血小板反应素(TSP) I和2 ;细胞粘合素；和SPARC (分泌性蛋白，酸性，富含半胱氨酸)。在某些实施方案中，脱细胞(及其它任选加工步骤)不从鱼皮脂质层除去全部天然存在的脂质。因此，支架材料可包含一种或多种来自鱼皮，特别是来自鱼皮脂质层的脂质。例如支架材料可包括至多约25% w/w脂质(冻干后总支架材料的干重)，比如0.1%，0. 5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%,17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%或24% w/w脂质。可以例如通过有机溶剂提取接着层析来验证支架材料中存在脂质。合适有机溶剂的实例包括丙酮和氯仿。支架材料中的脂质可包括，例如脂肪酰(即脂肪酸，其共轭物和衍生物)；甘油脂质；甘油磷脂(即磷脂)；神经鞘脂；糖脂(saccharolipid);聚酮；甾醇脂质(即甾醇类)；某些脂溶性维生素；异戊烯醇脂类(prenol lipids);和/或聚酮。脂肪酰的实例包括饱和脂肪酸，比如多不饱和脂肪酸；脂肪酯；脂肪酰胺；和类花生酸类。在某些实施方案中脂肪酸包括ω-3脂肪酸，比如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)(高浓度见于鱼油中)。其它见于鱼油的脂肪酸包括花生酸、鳕油酸、花生四烯酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、山嵛酸、荠酸和掏酸。甘油脂质的实例包括单-、二 -和三-取代的甘油，比如单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油(即甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯)。甘油磷脂的实例包括磷脂酰胆碱；磷脂酰乙醇胺；和磷脂酰丝氨酸。神经鞘脂的实例包括鞘磷脂和糖鞘脂。留醇脂质的实例包括胆留醇；类固醇；和开环留类(secosteiOids，各种形式的维生素D)。异戊烯醇脂类的实例包括类异戊二烯；类胡萝卜素；和醌和氢醌，比如维生素E和K。支架材料可含有一种或多种添加的活性剂(即在支架材料加工期间或之后加入的剂)，比如抗生素、防腐剂(antis印tic)、抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂和抗炎剂。活性成分可以是促进创伤护理和/或组织愈合的化合物或组合物比如抗氧化剂或药物。还可以是一种或多种蛋白和/或其它生物制剂。可加入足够为支架材料提供有效抗微生物性质的量的抗生素、防腐剂和抗微生物剂。在某些实施方案中，抗微生物剂是一种或多种抗微生物金属，比如银、金、钼、铜、锌或其组合。例如在加工期间可将银以离子、金属、元素和/或胶体形式加入支架材料。还可将银与其它抗微生物剂组合。可加入足够减轻和/或抑制应用支架材料的创伤或组织区域处的炎症的量的抗炎剂。可使用干燥形式的支架材料。或者，可在使用之前将支架材料再水合。在某些实 施方案中，将一种或多种支架材料层叠在一起以形成更厚的支架材料。一般，支架材料为约O. 1-4. O mm厚(即在横截面)，比如O. 5，I. O, I. 5，2. O,2.5，3.0或3.5 mm厚。厚度可取决于许多因素，包括用作原料的鱼品种、加工、冻干和/或再水合(见实施例14)。当然，当产物包含不止一层支架材料时，厚度成比例地更大。本文所述支架材料可用于多种医疗应用。例如支架材料可用作创伤敷料和/或缝合材料，其中将支架材料应用于创伤或组织区域上或其中一部分。术语“创伤”指导致组织损伤、组织穿透、撕裂或病损的任何损伤。可顺应支架材料治疗的创伤包括可位于任何部位，包括内部、界面、外部、间隙、体外和/或体内的损伤。适合用支架材料覆盖的创伤实例包括切割伤、深裂伤、开放性创伤、组织破裂、褥疮、皮炎、病损、慢性创伤、战场创伤、坏死性创伤、急性、慢性、外伤性、撕裂、磨损、挫伤、坏死性筋膜炎(necrotizing facitis)、中毒性表皮坏死、压伤、静脉功能不全性溃疡、动脉溃疡、糖尿病性或神经性溃疡、压迫性溃疡、混合溃疡、烧伤、毛霉菌病、脉管炎创伤、脓皮病、坏疽，及本领域技术人员已知的其等同物和/或组合。预期在人和动物受试者中治疗创伤。在某些实施方案中，将支架材料用于腹壁重建，例如用于修复疝。例如在修复疝时，外科医生将在疝位置的附近做切口。对于腹股沟疝，切口就在腹部连接大腿的皱褶的上方。为了修复脐疝，切口靠近肚脐。如果疝发生在以前手术的部位，则再打开该手术的切口。以大致相同的方式进行手术，无论在哪里做切口。小心地打开疝囊，将肠或其它组织放回腹内。将变弱的区域用将腹肌组织拉回到一起的合成网状物或缝线修复和加强。本文所述支架材料可用作网状物材料或缝线，或者用来强化网状物材料或缝线。支架材料可用于加强或增强创伤护理或组织愈合产品比如创伤敷料、网状物材料、绷带或缝线。例如支架材料可与创伤敷料、网状物材料或缝线紧靠使用或者互绕。当用作网状物材料或缝线，或者用来强化网状物材料或缝线时，可将支架材料用例如化学交联剂比如戊二醒(gluteraldehyde)或铬处理以增加组分ECM材料的交联。支架材料还可用于代替因牙周病损失的牙銀、形成膀胱悬带(bladder sling),和促进骨盆底重建。如用于本文，单数形式〃a〃、〃an〃和〃the〃包括复数指示物，除非上下文另外明确提示。提供本文公开的出版物只是因为它们的公开先于本申请的提交日期。在此绝不应解释为承认本公开因为在先公开而不具备比此类出版物日期提前的权利。而且，提供的出版物日期可能不同于实际的出版日期，这可能需要独立证实。本文引述的所有出版物、专利、专利申请及其它参考文献由此通过引用全部结合到本文中。虽然本公开已参考其某些实施方案详细描述，本领域技术人员将清楚可在不脱离本公开范围的情况下进行各种改变和采用等同物。此外，下列实施例只是说明性的，不应视为以任何方式限制本公开。 实施例实施例I
皮肤去除
连同尽可能多的表皮脂肪一起，将皮肤从鱼片去除。通过用刀刮擦鱼皮表面在砧板上将鱼皮去鳞。消毒和稳定化
将去鳞皮肤用分别含有50 mM抗坏血酸、500 ppm链霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水在4°C洗涤2次持续I小时。脱细胞
a)将鱼皮在IM NaCl中放置8小时，接着培养在含有O. 02%叠氮钠和500 ppm链霉素的2%脱氧胆酸中 e
b)倒出a)中的溶液。将鱼皮在室温以40RPM置于Hank’s平衡盐溶液中10分钟。重复该步骤，并将鱼皮置于层流通风橱中的容器内，打开，吸除溶液。再重复该程序2次，
c)将鱼皮用含有O.5% SDS的脱细胞溶液处理，将容器在室温置于40 RPM旋转器上I小时β
d)通过抽吸按照b)中描述除去脱细胞溶液。将鱼皮用50mL Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水洗漆。消化
将鱼皮在室温在消化溶液中培养18小时，该溶液由I M Tris-HClA.OSyg/mL胰蛋白酶组成，pH为8. 5。冷冻保护
将鱼皮浸在含有在Hank’s平衡盐溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的预冷冻溶液内。洗涤
将鱼皮用预冷冻溶液洗涤，在室温下置于40 RMP旋转器中120分钟。包装
将鱼皮插入袋内，将袋热封关闭。该袋是来自DuPont的医用级多孔TYVEK 膜袋，适合用环氧乙烷(EtOx)灭菌。冻干
将装有鱼皮的袋插入冷冻干燥器内冷冻干燥。
灭菌
将装有鱼皮的袋插入环氧乙烷室内，用1-5次环氧乙烷循环进行处理使鱼皮灭菌。实施例2 皮肤去除
连同尽可能多的表皮脂肪一起，将皮肤从鱼片去除。通过用刀刮擦鱼皮表面在砧板上将鱼皮去鳞。消毒和稳定化
将去鳞皮肤用分别含有50 mM抗坏血酸、500 ppm链霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水在4°C洗涤2次持续I小时。脱细胞
a)将鱼皮置于含有2.5 U/mL分散酶II (或链霉蛋白酶)和O. 02%叠氮钠的磷酸盐缓冲盐水中，在连续振荡下在4°C培养8小时。然后倒出溶液，在轻微振荡下将样品在O. 5%TRITON X-100和O. 02%叠氮钠的第二溶液中培养24小时β
b)倒出a)中的第二溶液。将鱼皮在室温以40RPM置于Hank’s平衡盐溶液中10分钟。重复该步骤，将鱼皮置于层流通风橱中的容器内，打开，吸除溶液。再重复该程序2次
c)将鱼皮用含有O.5% SDS的脱细胞溶液处理，将容器在室温置于40 RPM旋转器上I小时》
d)通过抽吸按照b)中描述除去c)的脱细胞溶液。将鱼皮用50mL Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水洗涤。消化
将鱼皮在室温在消化溶液中培养18小时，该溶液为I M Tris-HCUO. 05 μ g/mL胰蛋白酶，pH 为 8. 5。冷冻保护
将鱼皮浸在含有在Hank’s平衡盐溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的预冷冻溶液内。洗涤
将鱼皮用预冷冻溶液洗涤，在室温下置于40 RMP旋转器中120分钟。包装
将鱼皮插入TYVEK 膜袋内并热封关闭。冻干
将装有鱼皮的袋插入冷冻干燥器内冷冻干燥。灭菌
将装有鱼皮的袋插入环氧乙烷室内，用1-5次环氧乙烷循环进行处理使鱼皮灭菌。实施例3 皮肤去除
连同尽可能多的表皮脂肪一起，将皮肤从鱼片去除。通过用刀刮擦鱼皮表面在砧板上将鱼皮去鳞。冷冻将鱼皮在标准渔厂速冻冰箱中冷冻。在冷冻过程期间细胞溶解。冷冻抑制微生物生长。解冻
使鱼皮在4°C解冻。消毒和稳定化
将去鳞皮肤用分别含有50 mM抗坏血酸、500 ppm链霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水在4°C洗涤2次持续I小时。脱细胞
a)将鱼皮用含有O.5% SDS的脱细胞溶液处理，将容器在室温置于40 RPM旋转器上I小时， b)通过抽吸除去脱细胞溶液。将鱼皮用50mL Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水洗涤。消化
将鱼皮在室温在I M Tris-HCUO.OSyg/mL胰蛋白酶、pH 8. 5的消化溶液中培养18小时。冷冻保护
将鱼皮浸在含有在Hank’s平衡盐溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的预冷冻溶液内。洗涤
将鱼皮用预冷冻溶液洗涤，在室温置于40 RMP旋转器中120分钟。包装
将鱼皮插入TYVEK 膜袋内并热封关闭。冻干
将装有鱼皮的袋插入冷冻干燥器冷冻干燥。灭菌
将装有鱼皮的袋插入环氧乙烷室内，用1-5次环氧乙烷循环进行处理使鱼皮灭菌。实施例4
按照实施例1-3各自的描述加工鱼皮，只是在洗涤步骤还将漂白剂(亚硫酸钠)以O. 5%浓度加入预冷冻溶液以获得漂白支架基质。实施例5
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权利要求
1.一种支架材料，其包含脱细胞的鱼皮。
2.权利要求I的支架材料，其中支架材料包含来自鱼皮的细胞外基质材料。
3.权利要求2的支架材料，其中支架材料进一步包含来自鱼皮脂质层的脂质。
4.权利要求I的支架材料，其中支架材料采用创伤敷料、绷带、缝合材料和/或网状物材料的形式。
5.权利要求I的支架材料，其中支架材料基本无鳞。
6.权利要求I的支架材料，其中支架材料是生物相容的。
7.权利要求I的支架材料,其中支架材料进一步包含一种或多种加入的活性剂。
8.权利要求6的支架材料，其中加入的活性剂选自抗生素、防腐剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗炎剂、抗氧化剂、药物、蛋白质、肽，及其组合。
9.一种制备支架材料的方法，其包含 (a)获得鱼皮；和 (b)使鱼皮脱细胞。
10.权利要求9的方法，其进一步包含将鱼皮去鳞、洗涤、冷冻、漂白、消化和/或冷藏。
11.权利要求9的方法，其中脱细胞包含一种或多种物理处理、一种或多种化学处理、一种或多种酶处理，或其任何组合。
12.权利要求11的方法，其中化学处理包含用一种或多种脱细胞剂处理鱼皮，脱细胞剂选自离子盐、碱、酸、去污剂、氧化剂、高渗溶液、螯合剂、有机溶剂、蛋氨酸、半胱氨酸、马来酸、与DNA结合的聚合物，及其组合。
13.权利要求11的方法，其中酶处理包含用一种或多种选自蛋白酶、核酸内切酶和核酸外切酶的酶处理鱼皮。
14.一种支架材料，其用权利要求9的方法制备。
15.一种治疗创伤的方法，其包含将权利要求I的支架材料应用于创伤。
全文摘要
描述了用于创伤护理和/或其它组织愈合应用的支架材料及其制备方法。支架材料由来自鱼皮的脱细胞细胞外基质构成。支架材料还可包括来自鱼皮脂质层的脂质。还描述了制备和使用支架材料的方法。
文档编号A61L31/00GK102781485SQ201080055320
公开日2012年11月14日 申请日期2010年10月6日 优先权日2009年10月7日
发明者D.H.吉斯拉多蒂尔, G.F.西古尔荣松, G.古蒙森 申请人:克雷西斯公司