促创伤愈合因子的纯化与应用的制作方法

专利名称：：促创伤愈合因子的纯化与应用的制作方法促创伤愈合因子的纯化与应用本发明涉及一种血浆来源的促创伤愈合因子(factorforsupportingwoundhealing)的纯化和应用的方法。本发明的具体方面包括纯化和在体内和体外保护所述分子免遭降解的方法。
背景技术：
：HGF是一种促创伤愈合因子，它是一种在间充质细胞(例如肺巨噬细胞和成纤维细胞，肝中的枯否细胞，以及白细胞)中表达的蛋白。HGF是一种细胞因子，它在细胞损伤时分泌并杀J见出对某些器官再生和创伤^合是重要的。从化学角度看，HGF是一种糖蛋白，它首先以天然(无活性)的前体形式合成。该前体在受损器官中通过特定活化子被切割成活性HGF。HGF和其他一些因子与肝素结合，这似乎对HGF的激活和它与其受体的结合很重要。结合HGF的受体是c-MET。由于c-MET受体只在受损器官中被下调，所以看来只有这些受损器官中的细胞响应于HGF-受体相互作用。具有肝素结合亲和性的生长因子家族中这类影响创伤愈合过程的因子的实例还包括血小板衍生生长因子(Plateletderivedgrowthfactor,PDGF)，表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)，转化生长因子a(Transforminggrowthfactoralpha,TGF-a)，转^ffc生长因子P(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-p)，胰岛素样生长因子(Insulinlikegrowthfactor,IGF-I)和成纤维细J^生长因子(Fibroblastgrowthfactor,FGF)。抗凝血酶III(AT-III)是一种血浆糖蛋白，它可以抑制凝血级联过程中丝氨酸蛋白酶，因此，在凝血调控中起重要作用。AT-III是因子IXa、Xa、XI、XIIa和凝血酶的抑制剂。因此，AT-III在凝血级联的不同阶段调控凝块的形成。血液中AT-III含量的轻微减少与血栓栓塞风险的增加相关。AT-III浓缩物被用于在获得性或遗传性AT-III缺乏患者中预防和治疗血栓栓塞疾病。另外，已有报道表明AT-III还参与许多其它生物学反应，例如血管发生和炎症反应。但AT-III在这些机制中的作用尚未完全弄清。以肝素作为固定相结合配基，采用亲和色谱纯化AT-III的方法是本领域已知的。Miller誦Andersson等(ThrombosisResearch5,439-452，1974)发表了使用肝素-琼脂糖凝胶纯化人AT-III的方法。包括离子交换和凝胶过滤色镨法的整个过程提供34%的得率。富含组氨酸的糖蛋白(Histidine-richglyc叩rotein，HRGP)是一种单链血浆蛋白，最早于1972分离得到。HRGP确切的生理功能仍旧未知。由于它与肝素、纤维蛋白原和纤维蛋白、纤溶酶原和活化血小板的相互作用，HRGP被认为是凝血和纤溶的调节因子(Koide，T.In:Fibrinolysis:CurrentProspects.Gaffney,PJ(Ed.),JohnLibbey&Co.,London1988，p.55-63)。该多肽链由507个氨基酸残基组成，女包含与其他血浆蛋白(如AT-III)同源的区域(Koide,T.etal.(1986)Biochemistry25，2220-2225)。
发明内容促创伤愈合因子的活化形式在体内很快降解，特别是在已触发凝血和蛋白水解体系(包含蛋白酶)的创伤区域里。在纯化过程中，能够抑制天然的和活化形式的促创伤愈合因子的降解在体外也是至关重要的。其中一种因子，HGF，已知在血液中作为无活性前体被传输，在创伤过程中被特定的活化剂所活化。例如，在几乎所测试的所有纯化方法中都可以检测到少量无活性(变性)形式的HGF,但是，只有在使用本发明的方法时才能检测到活化的和/或非活化的形式。令人吃惊的发现除去蛋白酶和/或蛋白酶前体并且共纯化HGF的两种稳定剂(AT-III和/或HRGP)，得到富集的HGF活化和/或非活化形式，其很容易发挥作用或者可以转化成它的活性形式。由于HGF通常在体内以无活性前体形式循环，因此很显然天然的和/或活性的HGF药物产品可以显著改善许多机体功能障碍的治疗，特别是局部应用可行的区域，例如，在创伤愈合过程中。预期对其它具有肝素结合性质的生长因子也是如此，如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a(TGF-a)、转化生长因子p(TGF-p)、胰岛素样生长因子(IGF-I)和成纤维细胞生长因子(FGF),同时也预期AT-III和HRGP的存在可以改善这些生长因子的纯化和应用。根据用途，可提供带有或不带两种特异性稳定剂AT-III和HRGP的所述活化和/或非活化形式的促创伤愈合因子，所述稳定剂充当促创伤愈合因子天然和活化形式的蛋白降解的抑制剂，因此，提高了产品的功效和半衰期。根据用途，在一些情况下，为患者只提供活化或非活化形式的促创伤愈合因子是有利的，而在另外一些情况下，提供包括所选择的稳定剂AT-III和HRGP在内的其混合物是比较有利的。这取决于要求促创伤愈合因子分子起作用有多快。显然，这些原则对其他一些与HGF相似的具有肝素结合性质的生长因子也有效，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a(TGF-a)、转化生长因子p(TGF-p)、胰島素样生长因子(IGF-I)和成纤维细胞生长因子(FGF)。本发明涉及从含有促创伤愈合因子的来源(例如血液)中制备含有纯化促创伤愈合因子组合物的方法，其中纯化步骤在存在抗凝血酶III(AT-III)、富含组氨酸的糖蛋白(HRGP)或其组合存在的情况下，施。液)的肝细胞生长因子(HepatocyteGrowthFactor,HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a(TGF-a)、转化生长因子p(TGF-P)、胰島素样生长因子(IGF-I)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成，其中所述制备过程包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下实施的纯化步骤。本发明方法可以按以下步骤实施(i)将冷冻血液解冻，最终除去沉淀并进一步处理上清液，(ii)使上清液在阴离子交换色镨所需緩冲液中与阴离子交换色镨材料接触，所述緩冲液的盐浓度与生理条件相当，其pH值约中性，大部分的蛋白质都未被结合(包括所述促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)，但是一些特定的蛋白质和蛋白酶结合在阴离子树月旨上(例如凝血酶原，FX，FIX等)；(m)将所述阴离子交换色谱材料分离出去，得到溶液(包含促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)；(iv)使所述溶液与肝素-亲和色镨材料接触，而大部分的蛋白质(白蛋白，IgG，转铁蛋白，触珠蛋白等)未被结合；(v)分离出所述溶液，用解吸緩冲液处理肝素-亲和色镨材料，所述解吸緩冲液具有足够允许所述促创伤愈合因子从所述肝素-亲和色镨材料解吸的离子强度(任选地，在所述促创伤愈合因子级分解吸前用清洗緩冲液处理肝素琼脂糖材料，所述清洗液具有提高的足以解吸杂质蛋白(例如肝素辅因子II等)但是不解吸所述促创伤愈合因子级分的离子强度)；(vi)收集包含所述促创伤愈合因子、AT-III和HRGP的解吸緩沖液。在第二个可替代方案中，本发明的方法可采用如下步骤进行(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液，(ii)加入无机吸附材料，如硅藻土、硅胶、氧化铝，孵育足够的时间使之与不想要的物质(例如FXII和激肽释放酶原激活剂等)结合；(iii)加入低级脂肪醇，如CrQ醇，以形成科恩级分(Cohnfraction)I;(iv)除去所述无机吸附材料，以及，如果沉淀存在，还除去沉淀；(v)使科恩级分I上清液通过亲和色镨材料来对其进行处理，由此使天然的/活性的促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(天然的/活性的促创伤愈合因子、AT-III和HRGP，此后被称为HAH)结合，而大部分的其它血浆蛋白(如白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)保持未结合并被除去；(vi)从亲和色镨材料上洗脱并收集^M^创伤愈合因子的物质(任选地，在促创伤愈合因子级分解吸前用清洗緩冲液处理亲和树脂，所述清洗液的离子强度高至足以使杂质蛋白(如肝素辅因子II等)解吸，但是尚不能4吏促创伤^合因子级分解吸)。在第三个可替代方案中，本发明的方法可釆用如下步骤进行(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液，(ii)使上清^阴离子交换色镨所需緩冲液中与阴离子交换色镨材料接触，所述緩冲液的盐浓度与生理条件相当，其pH值约中性，大部分的所述蛋白都未结合(包括所述促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)，但是一些特定的蛋白质和蛋白酶(例如凝血酶原，FX，FIX等)结合在阴离子树脂上；(m)将所述阴离子色镨材料分离出去，得到溶液(包含促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)；(iv)加入无机吸附材料，如硅藻土、硅胶、氧化铝，孵育足够的时间使之与不想要的物质(如FXII和激肽释放酶原激活剂等)结合；(v)加入低级脂肪醇，如d-C4醇，形成科恩级分I;(vi)除去无机吸附材料，以及，如果沉淀存在，还除去沉淀；(vii)使科恩级分I上清液通过亲和色镨材料来对其进行处理，由此使活性的促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)结合，而大部分其它血浆蛋白(如白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)保持未结合并被除去；(viii)从亲和色谱材料上洗脱并收集含促创伤愈合因子的物质(任选地，在促创伤愈合因子级分解吸前用清洗緩冲液处理亲和树脂，所述清洗液的离子强度高至足以使杂质蛋白解吸，但是尚不能使促创伤愈合因子级分解吸)。在第四个可替代方案中，本发明的方法可采用如下步骤进行(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液，(ii)使上清液通过亲和色镨材料来对其进行处理，由此使活性的促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)结合，而大部分其它血浆蛋白(如白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)保持未结合并被除去；(iii)从亲和色镨材料上洗脱并收集^l创伤愈合因子的物质并对其进行收集(任选地，在促创伤愈合因子级分解吸前用清洗緩冲液处理亲和树脂，所述清洗液的离子强度高至足以使杂质蛋白(如肝素辅因子II等)解吸，但是尚不能使促创伤愈合因子级分解吸)。在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括病毒灭活，其特别地在步骤(Vi)后进行。在此方法中的病毒灭活优选是用能够使病毒灭活的化学物进行处理。这样的病毒灭活在EP-A-131740中有详细描述，即所谓的溶剂/去污剂方法。EP-A-131740的内容通过参考并入本文。在病毒灭活步骤之后，可实施阴离子交换色镨法。也可实施阳离子交换色镨法，特别是在阴离子交换色谞法之后进行。在本发明方法的另一个实施方案中，实施磷酸纤维素色语法。因为仅仅进行此色镨法就足够了，所以磷酸纤维素色谱法可能是有利的。然而，磷酸纤维素色谱法与阴离子和/或阳离子交换色镨法结合使用也可能是有利的。通常，包含HGF的级分在允许其吸附于磷酸纤维素材料的緩冲液中上样于磷酸纤维素基质上。通常使用离子强度20.05M氯化钠或其等同物的緩冲液实现HGF的洗脱。根据本发明，浓缩和/或渗滤(diafiltrate)在各个替代方法中收集的级分得到浓缩物。该浓缩物可任选地通过接触阳离子交换填料进行进一步处理。用离子强度足够洗脱主要包含AT-III(>90%)的级分Al的緩冲液处理所述阳离子交换材料，随后用更高的足以洗脱被收集的所述促创伤愈合因子和HRGP之离子强度的緩沖液处理所述材料。浓缩或渗滤包含所述促创伤愈合因子和HRGP的级分得到级分A2。在本发明方法的第二个可替代方案中，其中向所述浓缩物添加沉淀緩冲液，过滤并用緩冲液处理所述沉淀以回收所述促创伤愈合因子和AT-III。可通过采用下述至少一个步骤使用阳离子交换树脂对所得天然促创伤愈合因子浓缩物进行进一步纯化，其中所述天然促创伤愈合因子和HRGP与所述树脂结合(i)用緩冲液将所述促创伤愈合因子/HRGP级分从阳离子交换树月旨上洗脱下来，所述緩冲液具有室温下10-450mS/cm的电导率，更优选20-200mS/cm，最优选30-100mS/cm，(ii)色镨过程中pH保持在6-9，尤其是6.5-8或6.75-7.25，(iii)所述树脂的带电基团用约10到约100个单体单元组成的弱疏水聚合物碳链连接到树脂上。更详细地说，采用使HRGP沉淀的盐析步骤纯化所得促创伤愈合因子浓缩物的第二个可替代纯化方法的条件包括(i)使用根据霍夫迈斯特序列(Hofmeisterseries)的盐，优选地选自硫酸钠、砩酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵及其组合；(ii)所述盐浓度选自0.3-3M，特别地选自0.5-2M或0.75-1.5M的范围内；(iii)所述溶液的pH选自4-10，特别地选自6-9或7-8的范围；(iv)通过过滤或离心除去所得沉淀。为了提供可以商业化的促创伤愈合因子级分，处理所得天然促创伤愈合因子浓缩物以减少病原体，其中包括至少下述一种方法(i)用溶剂去垢剂溶液进行病毒灭活；(ii)用光照(例如UVC)或辐射处理进行病毒灭活；(iii)用热处理进行病毒灭活；(vi)用病毒滤器除去病毒。本发明的主题还有可根据本发明方法获得的组合物，其包含活化和/或非活化形式的倡/fi，J伤愈:合因子，活性形式的促创伤1^合因子或其组合。'，本发明的一个实施方案中，所述组合物含有所述活化形式和/或非活外的稳定性。在另一个实施方案中，本发明的组合物含有所述活化形式和/或非活化形式的促创伤愈合因子，并且HRGP也已包含在内以增加天然促创伤愈合因子在体内和体外的稳定性。特别地，所述促创伤愈合因子是完全活化的，或者是非活化的。向含有所述促创伤愈:合因子和HRGP的级分中添加选自糖类和M酸中的稳定剂可以是有利的。通常，所述稳定剂可以是多元醇(polyole)、精氨酸、海藻糖、赖氨酸、甘露醇或其组合。本发明的主题还包括包含本发明组合物的药物组合物。本发明的药物组合物可以以活化和/或非活化形式的所述促创伤愈合因子或其组合存在，其优选是液体或冻干形式并且通常局部施用，其混合于凝胶、喷雾剂等中，剂量方案大致是1-10纳克促创伤愈合因子/平方厘米创伤/天。还可以使用下述一种或多种方法施用(取决于用途)所述组合物静脉内、肌内、皮下、^L^、鞘内或者经直肠。实验方法AT-III的定量测定测定AT-III作为肝素辅因子活性的生物活性(IU/ml)，其是通过监测在肝素和AT-III存在下凝血酶对发色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HC1(Chromogenix，Sweden)的切割进行的。参见Frantzenhandelandetal.(Scand.J.Haematol.31，427-436，1983)和VanVoorhuizenetal.(Thromb.Haemostas.52(3),350-353，1984).总蛋白通过测量280nm(A28())下的吸光度测定总蛋白浓度，使用系数6.4IU/mg计算AT-III溶液的浓度(mg/ml)。AT-III的比活性定义为以IU/ml计的肝素辅因子活性与A280之间的比值。富含组氨酸的糖蛋白的定量测定使用火箭电泳技术对HRGP进行定量测定，其中"火箭"的高度正比于抗原浓度(Laurell,C-B，(1966)Analyt.Biochem.Vol.15,p.45;Laurell，C國B(1972)J.Clin.Lab.Invset.Vol.29，suppl.124，P.21)。HRGP兔抗体(Behringwerke)加入到1%的琼脂糖A凝胶中(AmerchamPharmaciaBiotech)。将HRGP样品(5jd)上样于所述凝胶，电泳过夜(150V,1V/cm)。将所得的抗原-抗体复合物染色，并与标准品(人血清)进行比较。等电聚焦根据Phast手册分离技术文件No.100(附带图片)，在PhastSystem(AmershamPharmaciaBiotech)上使用预制胶，pi3-9,进行等电聚HGF的鉴定进行Westernblot分析以确定具有该细胞因子特征性的多种功能的完整HGF的可获得性。因此，在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE。将通过电泳转移到硝酸纤维素片上的蛋白质与市售抗人HGFIgG(R&DSystems,Inc.)和市售经缀合的二抗(R&DSystems,Inc.)—起孵育，所述二抗对于前一抗体具有特异性。通过显色反应显示所述抗原(蛋白质)。HGF的定量测定使用设计用于测定细胞培养上清液、血清及血浆中HGF水平的市售固相ELISA(R&DSystems,Inc.)测定天然HGF的相对质量值。HGF特异性单克隆抗体被预包被在微孔板(microplate)上。将标准品和样品滴加至孔中，任何存在的HGF被固定化的抗体结合。洗掉所有未结合物质后，将HGF特异性酶联多克隆抗体加入到孔中。随后洗去所有未结合的抗体-酶试剂，将底物溶液加入到孔中，显色，其与最初步骤中HGF结合的量成正比。终止显色后，使用微孔板读数器在450nm下测定每孔的光密度。HGF的生物学活性通过使用市售的创伤愈合、迁移和增殖测定来测定生物活性。参见B.Raffertyetal(J.Immunol.Methods258(2001)1-11)。实施例实施例1根据本发明，在AT-III和HRPG稳定下纯化天然(活性)HGF。歩骤l将来源于健康供体的汇集的新鲜冷冻血浆(1,200kg)在O'C解冻，通过离心移出所得的冷沉淀(包含例如因子VIII和纤连蛋白)。所述沉淀通常用于FVIII的进一步纯化。步骤2使所得的冷上清(来自步骤1)通过阴离子交换柱(70升DEAE-SepharoseFF，AmershamPharmaciaBiotech)进行处理以结合微生素K依赖蛋白(因子IX，因子X，因子II,蛋白C，蛋白S等)。用含0.14M氯化钠和5mM磷酸钠pH7.0的緩冲液清洗所述柱。未结合的蛋白级分(约1,270kg)进一步进入步骤3中进行处理，而对所述结合于柱中的蛋白进一步处理以纯化FIX、凝血酶等。步骤3通过加入乙醇至8%(v/v)的终浓度进一步处理来自步骤2的未结合蛋白级分中以得到科恩级分I沉淀，其包含例如纤维蛋白酶原和脂蛋白(Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68，459-475)。加入乙醇前，在溶液中加入5.5kg磋藻土材料(HyflowSupereel)。通过离心除去沉淀和珪藻土。步骤4将科恩级分I上清液(大约1,400kg)pH值调至7.8，然后通过亲和色镨柱(120升肝素画SepharoseFF,AmershamPharmaciaBiotech)进行处理，其中天然(活性)HGF、AT-III和HRGP(HAH)结合，而大部分的其它血浆蛋白(白蛋白，IgG等)穿过所述柱。用600kg緩冲液(0.4M氯化钠和0.01M裤酸钠，pH7.8)对所述柱进行清洗以除去无活性形式的蛋白，再用500kg緩^液(2.3M氯化钠和0.01M的磷酸钠，pH7.8)洗脱HAH级分。浓缩所得HAH洗脱液并使用超滤膜(Biomax-10,Millipore)和0.05M、pH7.5的裤酸钠对其进行渗滤。所得经渗滤的HAH浓缩物被称作UFl。实施例2根据本发明，在AT-III和HRPG稳定下纯化天然(活化和/或非活化)HGF。步骤l将来源于健康供体的汇集的新鲜冷冻血浆U，200kg)在0'C解冻，通过离心移出所得的冷沉淀(包含因子VIII和纤维连接蛋白)。所述沉淀通常用于FVIII的进一步纯化。歩骤2通过加入乙醇至8%(v/v)的终浓度处理来自步骤1的冷上清得到科恩级分I沉淀，其包含例如纤维蛋白酶原和脂蛋白(Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68，459-475)。加入乙醇前，在溶液中加入5.5kg硅藻土材料(HyflowSupereel),搅拌1-2小时。通过离心除去沉淀和珪藻土歩骤3将科恩级分I上清液(大约1,400kg)pH值调至7.8，然后通过亲和色镨柱(120升Heparin-SepharoseFF，AmershamPharmaciaBiotech)进行处理，其中天然(活性)HGF、AT-III和HRGP(HAH)结合，而大部分其它血浆蛋白(白蛋白，IgG等)穿过所述柱。用600kg緩冲液(0.4M氯化钠和0.01M裤酸钠，pH7.8)对所述柱进行清洗以除去无活性形式的蛋白，再用500kg緩斗液(2.3M氯化钠和0.01M磷酸钠，pH7.8)洗脱HAH级分。浓缩所述HAH洗脱液并使用超滤膜(Biomax-lO,Millipore)和0.05M，pH7.5的裤酸钠对其进行渗滤。所得经渗滤的HAH浓缩物被称作UF1。实施例3天然HGF的进一步纯化，以除去AT-III此方法在室温下(+22'C)进行，实施例1或2中所得的UF1浓缩物(人28。=23.6;图1，泳道l)用蒸馏水1+3稀释。使稀释后的溶液(2050g，电导率2.6mS/cm)通过色镨柱(PharmaciaBiotechBioprocessColumn,直径15cm)进行处理，所述柱装填Fractogel⑧EMDSO3-650(M)阳离子交换色谱介质(1.71)，介质用pH7.5，电导率2.6mS/cm的10mM杵檬酸钠溶液平衡。流速为91/h。在蛋白溶液上样之后，用7倍体积的平衡緩冲液清洗色镨柱。未被吸附到所述柱的物质与所述清洗液混合(14.6kg，称作"级分A1，，；图1，泳道2)。用1.9kg緩冲液(1MNacl/10mM柠檬酸钠，pH7.5,电导率106mS/cm)洗脱更强吸附的蛋白。对洗脱液(1.9kg)进行浓缩并且用pH7.0的0.11\1柠檬酸钠/1%蔗糖进行渗滤。所得"A2，，含有活性HGF和HRGP(表1和图1,泳道3)。表1.根据本发明的AT-III和HGF/HRGP级分的分离<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例5为了研究AT-III和/或HRGP对HGF最佳回收率的重要性，进行了下列实验A.如实施例2(步骤1到3)中所实施的流经肝素-琼脂糖色谱柱的级分用于进行进一步制备。然后，在不含HGF、活性AT-III和HRGP的此级分中加入HGF，但不加入AT-III和HRGP。在经溶剂去垢剂(solventdetergent,SD)处理(Octoxynol，TnBP)后，过滤(4吏用0.45jim孔径的滤器)所述溶液，然后上样于Q-SepharoseXL柱(阴离子交换树脂)。用pH7.0，20mMTris/HCl溶液(女也用于除去SD试剂)清洗柱后，用含0.2M氯化钠的pH7.0,20mMTris/HCl緩沖液洗脱结合蛋白。此洗脱液上样于FractogelEMDS03-柱。在清洗步骤后，用10mM柠檬酸钠pH5.5和1M氯化钠进行洗脱。B.纯化步骤与A中所描述的相同，只是在加入了HGF的溶液中加入纯4t的AT-III。结果对从A和B操作中获得的不同级分进行的评价表明，来自操作B的洗脱液的两个色镨过程的步骤得率明显高于AT-III不存在时色谱过程的得率，特别是FractogelEMDSOr色镨过程。HGF步骤的得率至少是AT-III不存在情况下的两倍。值得注意的是，AT-III不存在时，在洗脱液之外的级分中也检测到HGF，然而在操作B的清洗级分中和柱穿过液中检测不到HGF的存在，而其在洗脱液中得到了浓缩。总之，这些结果证明，AT-III的存在明显提高了HGF的得率。特别是对于此处使用的阴离子和阳离子交换色镨。实施例6根据实施例5，对实施例2中的肝素-琼脂糖柱洗脱液和UF1(即包含HGF、AT-III和HRGP)进行SD处理，过滤(0.45jim)并上样于磷酸纤维素柱，所述柱用1mM的磷酸緩沖液pH6.0进行清洗。用含1M氯化钠的磷酸緩冲液进行HGF的洗脱。通过该色镨过程，除去了SD试剂，并实现了HGF的进一步纯化，相比于粗制品，HGF的方法步骤得率大于50%。权利要求1.一种从含有促创伤愈合因子的来源如血液中制备含有纯化的促创伤愈合因子之组合物的方法，所述促创伤愈合因子选自:肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-I)和成纤维细胞生长因子(FGF)，其中所述制备方法包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下实施的纯化步骤。2.权利要求l的方法，其包括如下步骤(i)将冷冻血液解冻，最终除去沉淀并进一步处理上清液；(ii)使上清液在阴离子交换色镨所需緩冲溶液中与阴离子交换色镨材料接触，所述緩冲液中的盐浓度与生理条件相当，其pH值约为中性；(m)将所述阴离子交换色镨材料分离出去，得到溶液；(iv)使所述溶液与肝素-亲和色镨材料接触；(v)分离出所述溶液，用解吸緩冲液处理肝素-亲和色谙材料，所述緩冲液具有足以允许所述促创伤愈合因子从所述肝素-亲和色镨材料上解吸下来的离子强度；(vi)收集包含所述促创伤愈合因子、AT-III和HRGP的所述解吸緩沖液。3.权利要求l的方法，其包括如下步骤(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液；(ii)加入无机吸附材料，如硅藻土、硅胶、氧化铝，孵育足够的时间使之与不想要的物质结合；(iii)加入低级脂肪醇，如d-Q醇，以形成科恩级分I;(iv)除去无机吸附材料，以及，如果沉淀存在，还除去沉淀；(v)使科恩级分I上清液通过亲和色谱材料来对其进行处理，由此使所述促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)结合，而其它血浆蛋白未结合并被除去；(vi)从亲和色i普材料上洗脱并收集所述促创伤愈合因子。4.权利要求l的方法，其包括如下步骤(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液；(ii)使上清液在阴离子交换色镨所需緩冲液中与阴离子交换色镨材料接触，所述緩冲液盐的浓度与生理条件相当，其pH值约中性，大部分的蛋白质(包括所述促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)未结合，但是一些特定蛋白和蛋白酶结合在阴离子树脂上(例如凝血酶原，FX，FIX等)；(iii)将所述阴离子色镨材料分离出去，得到溶液(包含促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)；(iv)加入无机吸附材料，如硅藻土、硅胶、氧化铝，孵育足够的时间使之与不想要的物质结合，如FXII和激肽释放酶原激活剂等；(v)加入低级脂肪醇，如d-C4醇，以形成科恩级分I;(vi)除去无机吸附材料，以及，如果沉淀存在，还除去沉淀；(vii)使科恩级分I上清液通过亲和色镨材料来对其进行处理，由此使促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)结合，而大部分其它血浆蛋白(如白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)未结合并被除去；(viii)从亲和色谱材料上洗脱并收集含有所述促创伤愈合因子的物质(任选地，在促创伤愈合因子级分解吸前用清M冲液处理亲和树脂，所述清洗液具有提高的离子强度，足以使杂质蛋白解吸，但是尚不能使所述^^创伤愈合因子级分解吸)。5.权利要求l的方法，其包括如下步骤(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液；(ii)使上清液通过亲和色谱材料来对其进行处理，由此使促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)发生结合，而大部分其它血浆蛋白(如白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)保持未结合并被除去；(m)从亲和色镨材料上洗脱并收集含所述促创伤愈合因子的物质(任选地，在促创伤愈合因子级分解吸前用清洗緩冲液处理亲和树脂，所述清洗緩沖液具有提高的离子强度，足以使杂质蛋白(如肝素辅因子II等)解吸，但是尚不能使所述促创伤愈合因子级分解吸)。6.根据权利要求2至5的方法，其中浓缩和/或渗滤所收集的级分得到浓缩物。7.根据权利要求2至6中任一项的方法，其中病毒灭活特别地在步骤(vi)之后实施。8.根据权利要求2至7中任一项的方法，其中在病毒灭活步骤之后实施阴离子交换色镨。9.根据权利要求2至8中任一项的方法，其中阳离子交换色镨特别地在阴离子交换色谱之后实施。10.根据权利要求2至9中任一项的方法，其中实施磷酸纤维素色谱。11.根据权利要求2至10中任一项的方法，其中实施纳膜过滤。12.根据权利要求2至11中任一项的方法，其中权利要求2或3中步骤(vi)、权利要求4中步骤(viii)或权利要求5中步骤(iii)所得的级分采用病毒灭活化学剂进行病毒灭活。13.根据权利要求12的方法，其中经病毒灭活化学剂处理的级分接受磷酸纤维素色诿。14.根据权利要求12的方法，其中经病毒灭活化学剂处理的级分先接受阴离子交换色谱再接受阳离子交换色镨。15.根据权利要求8或14的方法，其中所述阳离子交换材料先用离子强度足够洗脱主要包含AT-III(>卯％)的级分A1之緩冲液进行处理，随后用离子强度更高以洗脱大部分所述促创伤愈合因子和HRGP的緩冲液进行处理，并对其进行收集。16.根据权利要求15的方法，其中浓缩或渗滤含有所述促创伤愈合因子和HRGP的级分以得到级分A2。17.根据前述任一项权利要求的方法，其中将沉淀緩冲液添加到所述浓缩物，进行过滤，用緩冲液处理所述沉淀以回收所述促创伤愈合因子和AT-III。18.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于处理所得促创伤愈合因子浓缩物以减少病原体，其包括以下方法中的至少一种(i)用溶剂去垢剂溶液进行病毒灭活；(ii)用光照(例如UVC)或辐射处理进行病毒灭活；(iii)用热处理进行病毒灭活；(vi)用病毒滤器除去病毒。19.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于，使用阳离子交换树脂进一步纯化所得促创伤愈合因子浓缩物，其中所述促创伤愈合因子和HRGP结合到所述树脂，其包括下述至少一个步骤(i)用緩冲液将所述促创伤愈合因子/HRGP级分从阳离子交换树脂上洗脱下来，所述緩冲液具有室温下10-450mS/cm的电导率，更优选20-200mS/cm，最优选30-100mS/cm，(ii)色镨过程中pH保持在6-9，更优选6.5-8，最优选6.75-7.25，(iii)所述树脂的带电基团用约10到约100个单体单元组成的弱疏水聚合物>^链连接到树脂上。20.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于，使用盐析步骤进一步纯化所得促创伤愈合因子浓缩物，通过该步骤沉淀HRGP,其特征在于(i)使用根据霍夫迈斯特序列的盐，优选地选自硫酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵及其組合；(ii)所述盐浓度选自0.3-3M的范围内，特别地选自0.5-2M或0.75-1.5M;(iii)所述溶液的pH选自4-10的范围，特别地选自6-9或7-8的范围；(iv)通过过滤或离心除去所得沉淀。21.可通过前述任一项权利要求的方法得到的组合物，其包含活化和/或非活化形式的促创伤愈合因子或其组合。22.根据权利要求21的组合物，其特征在于包含活化和/或非活化形定性。23.根据权利要求21和/或22的组合物，其特征在于包含活化和/或非活化形式的促创伤愈合因子，并且已包含HRPG以增加天然促创伤愈合因子的体内和体外稳定性。24.根据权利要求21至23中任一项的组合物，其中另外存在选自多元醇、糖类和/或氨基酸的稳定剂。25.—种药物组合物，其包含权利要求21至24中任一项的组合物。26.权利要求25的药物组合物，其中所述活化和/或非活化形式的促创伤愈合因子以液体或冻千形式存在，以^或喷雾剂形式施用。27.—种药物制剂，其中权利要求26的组合物是剿欧、软骨或喷雾剂的形式。28.通it^利要求1到20的方法获得的富集了HRGP的级分。29.可通过以下方法获得的才艮据权利要求28的级分，其中经肝素亲和和病毒灭活处理后，所得混合物再用磷酸纤维素材料处理。全文摘要本发明涉及一种从含有促创伤愈合因子的来源(如血液)中制备含有纯化的促创伤愈合因子之组合物的方法，所述促创伤愈合因子选自肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-I)和成纤维细胞生长因子(FGF)，其中所述制备方法包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下实施的纯化步骤。文档编号C07K1/36GK101374855SQ200780002912公开日2009年2月25日申请日期2007年1月25日优先权日2006年1月25日发明者安娜·米耶德斯坦,安德烈亚·内塞尔-斯瓦埃,斯特凡·温厄申请人:奥克塔法马股份有限公司