用于愈合创伤的方法和药物组合物的制作方法
【专利摘要】一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的治疗有效量的胰岛素和至少一种与所述胰岛素协同作用的其它试剂，以及适合于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括对损伤的皮肤或皮肤创伤施用治疗有效量的胰岛素和至少一种与所述胰岛素协同作用的其它试剂以诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
【专利说明】用于愈合创伤的方法和药物组合物
[0001] 本申请是申请号为“200910217138.6”，发明名称为“用于愈合创伤的方法和药物组合物”的发明专利申请的分案申请。
_2] 发明领域和背景
[0003]本发明涉及一种用于诱导和/或加速细胞增殖和/或细胞分化并因此而加速创伤(wounds)的愈合过程的方法和药物组合物。更具体而言，本发明涉及经调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也称为PKC的表达和/或活化，例如由膜运输和活化引起的，用于诱导和/或加速细胞增殖和/或细胞分化和/或细胞迁移从而加速创伤的愈合过程的用途。根据本发明的教导，这种表达的调节可以通过下述作用实现:(i)用PKC表达构建体转化创伤细胞；(ii)用顺式作用元件转化创伤细胞，该元件将被插入到创伤细胞内源PKC基因上游邻近位置；(iii)给予胰岛素以诱导创伤细胞中PKC的表达和/或活化；(iv)用胰岛素表达构建体转化创伤细胞，其产生的表达的和分泌的胰岛素可作为PKC的表达和/或活化的上调剂；(V)用顺式作用元件转化创伤细胞，该元件将被插入到创伤细胞内源胰岛素基因上游邻近位置，被表达和分泌的胰岛素可作为PKC的表达和/或活化的上调剂；(vi)向创伤中植入胰岛素分泌细胞；(Vii)用反式作用因子，例如roxi转化创伤细胞，以诱导内源胰岛素产生和分泌，所述胰岛素可作为PKC的表达和/或活化的上调剂；以及(Viii)给创伤施用PKC调节剂。
[0004]本发明正如任何上述方法所实现的那样，也可离体实施，以产生皮肤移植物。
[0005]创伤治疗最主要的目的是使创伤闭合。张开的皮肤创伤代表了一类主要的创伤，包括烧伤，神经性溃疡，褥疮性溃疡，静脉淤滞性溃疡，和糖尿病性溃疡。
[0006]张开的皮肤创伤通常经过这样的过程愈合，包括六个主要要素:(i)发炎；(ii)成纤维细胞增殖；(iii)血管`增殖；(iv)结缔组织合成；(V)形成上皮；和(Vi)创伤收缩。当这些要素，无论是单独的还是作为整体，不能正确发挥作用的时候，则破坏了创伤的愈合。有多种因素都可以影响创伤愈合，包括营养不良，感染，药理学试剂(例如放线菌素和类固醇)，高龄和糖尿病[参见Hunt and Goodson, Current SurgicalDiagnosis&Treatment(Way ；Appleton&Lange), pp.86-98(1988)]。
[0007]就糖尿病而言，糖尿病的特征就在于胰岛素信号传导(signaling)受到损伤，血浆葡萄糖升高，以及在几种特定组织上发生慢性的并发症的易感性。在所有糖尿病的慢性并发症中，导致足部溃烂的受损的创伤愈合是研究最少的。然而糖尿病患者的皮肤溃疡花费了大量人力和财力(29，30)。而且，足部溃烂以及而后的下肢截断是最常见的糖尿病患者住院的原因(30-33)。在糖尿病中，创伤愈合过程受到破坏，愈合的创伤的特征在于伤口强度减小。组织修复的缺陷与几种因素有关，包括神经病，血管病和感染。但是，尚不明了其它机制，通过该机制，与胰岛素信号传导异常相关的糖尿病状态破坏创伤的愈合并改变皮肤生理。
[0008]还有一个普遍存在的问题是身体的各个部分的外科手术之后的创伤愈合，手术成功但是创伤切口不愈合。
[0009]皮肤是分层的鳞状的上皮，其中正在进行生长和分化的细胞被严格隔开。在生理状态，增殖只限于附着于基底膜上的基底细胞。分化是一种空间过程，其中基底细胞失去与基底膜的附着，停止DNA合成并经历一系列形态学的和生物化学的变化。最终的成熟步骤是产生角质层，其形成皮肤的保护屏障(1，2)。在基底细胞开始分化的时候观察到的最早的变化与基底细胞从基底膜分离和迁移的能力有关(3)。创伤的愈合过程也有类似的变化，其中细胞迁移到创伤部位，增殖能力也增加。这些过程是皮肤层的重建和诱导表皮层正确分化所必需的。
[0010]小鼠和人角质化细胞培养系统的开发大大方便了对表皮细胞生长和分化调节机制的分析(2，4)。在体外，角质化细胞可以保持为具有高生长速度的基底增殖细胞。而且，遵循表皮在体内的成熟模式可以在体外诱导分化。早期事件包括半桥粒组分的丧失(3，
5)和α6β 4整联蛋白的选择性丧失以及细胞与基质蛋白的附着的选择性丧失。这表明整联蛋白表达的变化是角质化细胞分化中的早期事件。早期的半桥粒接触(hemidesmosomalcontact)的丧失导致角质化细胞向基底层上迁移，并且与培养的角质化细胞中以及皮肤中角蛋白I(Kl)的诱导有关(1，3，6)。向颗粒层表型的进一步分化与β?和β4整联蛋白的表达的下调，与所有基质蛋白的附着潜力的丧失有关，然后就是角质化包膜的形成和细胞死亡。分化细胞最终从培养皿上脱落成为成熟鳞屑(2，7)。这种体外分化过程是严格遵循体内表皮成熟模式进行的。
[0011]最近对于角质化细胞生物学的研究突出了蛋白激酶C(Protein Kinase C)途径的贡献，其调节皮肤增殖和分化。丝氨酸-苏氨酸激酶的蛋白激酶C(PKC)家族在多种生物现象中都起着重要的调节作用(8,9)。PKC家族由至少12个单独的同种型(isoform)构成，其属于3个不同的类别:(i)传统同种型(α，β?，β2，Y)，其被磷脂酶C在胞内释放的Ca2+，佛波酯和二酰甘油激活；(ii)新同种型(δ，ε，η, Θ)，其也可以被佛波酯和二酰甘油激活，但不能被Ca2+激活；(iii)家族的非典型性(ζ，λ, t )成员，其不能被Ca2+，佛波酯或二酰甘油激活。
[0012]当被激活的时候，大部分但不是所有同种型被认为会从细胞质迁移到质膜上。同种型的类型和分布模式在不同的组织中各不相同，也会随表型而变化。由于PKC在多种激素作用的细胞终点中的重要性，已有多项研究阐明了其结构和功能。在体内和培养物中已识别了皮肤中的五种PKC同种型-a`，δ，ε，η和ζ。近来的研究表明PKC信号传导途径是分化反应的主要胞内调节剂(10，11)。而且，PKC的药理学活化剂是体内和体外角质化细胞分化的强有力的诱导剂(4，12)，PKC抑制剂能防止分化标志物的表达(10)。
[0013]在构思本发明时，猜测PKC同种型的过表达和/或活化可能会有助于加速创伤愈合过程。由于难以有效地用传统方法向原代细胞中引入外源基因，因而对各个PKC同种型在皮肤细胞增殖和/或分化中的作用的研究受到了限制。生命期短，存在分化可能以及不能分离到稳定的转化体都使得外源基因不能有效转导入原代皮肤细胞。
[0014]现有技术描述了胰岛素作为创伤愈合的治疗剂的潜在应用。美国专利5，591，709，5，461，030和5，145，679描述了将胰岛素局部施用于创伤以促进创伤愈合。但是，这些专利所描述的都是将胰岛素和葡萄糖组合使用，因为胰岛素的功能是增加葡萄糖的吸收，因而促进创伤愈合。
[0015]美国专利申请09 / 748，466和国际专利申请PCT / US98 / 21794描述了局部施用于皮肤以促进皮肤健康或治疗较浅的皮肤损伤的含有胰岛素的组合物。但是，这些专利申请并没有教导使用胰岛素治疗慢性的，II度(Grade II)或较深的创伤。
[0016]国际专利申请PCT / USOl / 10245描述了将氰基丙烯酸酯聚合物密封剂与胰岛素或银组合使用以使创伤愈合。但是，在此申请中既没有教导也没有暗示胰岛素和另一种生物活性试剂组合使用可以调节PKC的表达和/或活化。
[0017]国际专利申请PCT / US85 / 00695描述了局部施用胰岛素以治疗糖尿病。但是，该专利申请并没有教导使用胰岛素治疗与糖尿病无关的创伤。
[0018]国际专利申请PCT / US92 / 03086描述了可以含有胰岛素的治疗用微乳制剂。但是，其公开的内容没有教导使用胰岛素制剂使创伤愈合。
[0019]美国专利4，673，649和4，940，660描述了用于人角质化细胞和表皮细胞体外无性系生长的组合物，其中含有表皮生长因子和胰岛素。这些专利教导了将胰岛素用于培养的皮肤细胞的发育，所述细胞可用于移植。但是，这些专利并未教导将胰岛素在体内用于创伤。
[0020]上述引用的现有技术参考文献并未教导或暗示将胰岛素用于调节PKC的表达和/或活化，从而加速创伤的愈合过程。而且，现有技术并未教导或暗示使用核酸构建体或基因转化技术向创伤提供胰岛素，从而加速创伤的愈合过程。
[0021]目前普遍意识到需要，并且为了便利之目的也需要能加速创伤愈合相关过程的新方法。此外，还普遍意识到需要，并且为了便利之目的也需要能将重组基因插入到皮肤细胞中的有效方法，其将加速细胞增殖和/或分化过程和创伤愈合。
[0022]发明概沭
[0023]当实施本发明的时候，发明人发现将胰岛素单独施用到创伤处会产生不良的副作用例如过度血管生成，发炎，上皮细胞增生和疤痕形成(见下文实施例部分的实施例23)。本发明人进一步发现将胰岛素和一种或多种能在定居于创伤部位的细胞(cellscolonizing the wound area)中调节PKC的表达和/或活性的试剂组合使用可有效避免胰岛素引起的副作用，并且同时显著加速创伤愈合过程。
[0024]本发明提供了高效治疗创伤并且没有不良副作用的新方法和组合物，包括向创伤部位提供有效量的胰岛素和/或其它能在创伤部位的细胞中调节PKC的表达和/或活性并与胰岛素有协同作用的试剂以加速创伤愈合的过程。
[0025]因此，根据本发明的一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括给损伤的皮肤或皮肤创伤施用治疗有效量的调节PKC产生和/或PKC活化的试剂的步骤。
[0026]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的至少一种调节PKC产生和/或活性的试剂；和药学可接受的载体。
[0027]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括给损伤的皮肤或皮肤创伤施用治疗有效量的胰岛素和至少一种与胰岛素有协同作用的其它试剂的步骤，以诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0028]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的胰岛素，至少一种能与胰岛素协同作用的其它试剂，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0029]根据本发明的另一个方面提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括给损伤的皮肤或皮肤创伤施用单次剂量的治疗有效量的胰岛素的步骤，从而诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0030]根据本发明的另一个方面提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，所选择的能诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的单一剂量单位的胰岛素，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0031]根据本发明的另一个方面提供了一种诱导或加速陈旧皮肤创伤(old skinwound)的愈合过程的方法，所述方法包括给陈旧皮肤创伤施用单次剂量的治疗有效量的胰岛素的步骤，从而诱导或加速陈旧皮肤创伤的愈合过程。
[0032]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括向损伤的皮肤或皮肤创伤植入治疗有效量的胰岛素分泌细胞的步骤，从而诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0033]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的胰岛素分泌细胞，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0034]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括转化损伤的皮肤或皮肤创伤的细胞以产生和分泌胰岛素的步骤，从而诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0035]根据本发明的另`一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，设计用于转化损伤的皮肤或皮肤创伤处细胞以产生和分泌胰岛素的核酸构建体，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0036]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括转化损伤的皮肤或皮肤创伤处细胞以产生蛋白激酶C的步骤，从而诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0037]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，设计用于转化损伤的皮肤或皮肤创伤处细胞以产生蛋白激酶C的核酸构建体，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0038]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括给损伤的皮肤或皮肤创伤施用治疗有效量的PKC活化剂的步骤，从而诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0039]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的PKC活化剂，以诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程，以及药学可接受的载体。
[0040]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括给损伤的皮肤或皮肤创伤施用治疗有效量的共聚物-1的步骤。
[0041]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的共聚物-1，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0042]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的共聚物-1，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0043]根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的方法，所述方法包括调节定居于损伤的皮肤或皮肤创伤处真皮细胞中的至少一种PKC同种型的表达和/或活性；给所述真皮细胞施用治疗有效量的至少一种选自激素，生长因子，脂肪细胞激素，PKC δ RACK和GW9662的其它试剂以及调节所述PKC同种型的表达和/或活性，从而诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程。
[0044]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的调节至少一种PKC同种型的表达或活性的物质，和至少一种选自激素，生长因子，脂肪细胞激素，PKC δ RACK和GW9662的其它试剂，以及药学可接受的载体。
[0045]根据下述的发明的优选实施方案的其它特征，所述创伤选自溃疡，糖尿病相关的创伤，烧伤，晒伤，老化皮肤创伤，角膜溃烂创伤，炎性胃肠道疾病创伤，肠炎性疾病创伤，克罗恩氏病创伤，溃疡性结肠炎，痔疮，大疱性表面松解症创伤，皮肤起疱创伤，牛皮癣创伤，saborehic皮炎创伤，动物皮肤创伤，动物糖尿病创伤，视网膜病创伤，口腔创伤(粘膜炎)，阴道粘膜炎创伤，牙龈病创伤，裂伤(laceration)，手术切口创伤和手术后粘连创伤(adhesis wound)。
[0046]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述溃疡是糖尿病性溃疡，褥疮，静脉性溃疡，胃溃疡和HIV相关溃疡。`
[0047]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素是重组的。
[0048]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素是天然来源的。
[0049]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述其它试剂是血小板衍生的生长因子。
[0050]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述其它试剂是PKC- α抑制剂。
[0051]根据所述的优选实施方案的其它特征，给药是单次施用。
[0052]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述陈旧皮肤创伤是至少2天龄(2daysold)的。
[0053]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素浓度为0.ΙμΜ到10 μ Μ。根据所述的优选实施方案的其它特征，胰岛素的剂量单位是在0.01-0.2ml的药物组合物中的0.001 到 5nM。
[0054]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素的剂量为在0.01-0.2ml的药物组合物中的0.01到0.5nM。
[0055]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述药物组合物选自水溶液，凝胶，乳剂，糊剂，洗剂，喷雾，悬液，粉末，分散剂，油膏剂和软膏剂。
[0056]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述药物组合物含有固体支持物。[0057]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞被转化以产生和分泌胰岛素。
[0058]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞被重组roxi基因转化，从而使得所述细胞产生和分泌天然的胰岛素。
[0059]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞被顺式作用元件序列转化，该序列整合到所述细胞的内源胰岛素基因的上游，从而所述细胞产生和分泌天然胰岛素。
[0060]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素分泌细胞能够形成分泌颗粒。
[0061]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素分泌细胞是内分泌细胞。
[0062]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素分泌细胞是人源的。
[0063]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素分泌细胞是组织相容性人化动物来源的。
[0064]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素分泌细胞分泌人胰岛素。
[0065]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述胰岛素分泌细胞是自体细胞。
[0066]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞选自成纤维细胞，上皮细胞和角质化细胞。
[0067]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞被转化以产生蛋白激酶C转录激活剂，从而使得所述细胞产生天然的蛋白激酶C。
[0068]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞被顺式作用元件序列转化，该序列整合到所述细胞的内源蛋白激酶C的上游，从而使得所述细胞产生天然的蛋白激酶C。
[0069]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述细胞被重组蛋白激酶C基因转化，从而使得所述细胞产生重组蛋白激酶C。
[0070]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述蛋白激酶C选自PKC-β 1，PKC-β 2，PKC- y，PKC- θ，PKC- λ，和 PKC-1。
[0071]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述蛋白激酶C选自PKC- a，PKC- δ，PKC- ε，PKC- η 和 PKC- ζ。
[0072]根据所述的优选实施方案的其它特征，在适于局部施用的药物组合物中含有共聚物-1。
[0073]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述PKC同种型选自PKC-α，PKC-β，PKC- δ，和 PKC- ζ。
[0074]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述激素是胰岛素。
[0075]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述生长因子选自IL-6，KFG和TNFa。
[0076]根据所述的优选实施方案的其它特征，所述脂肪细胞激素是adipsin或脂联素(adiponectin)。
[0077]本发明成功解决了现有的已知技术的缺点，提供了用于对抗损伤的皮肤或皮肤创伤的新的治疗方法。
[0078]附图简沭
[0079]本发明仅通过举例方式并参考所附的附图进行描述。现在具体参考附图的细节，应当指出所示出的细节仅仅是举例方式，用于对本发明的优选实施方案进行举例说明，而且是为了提供对本发明的原理和概念最有用的和最容易理解的描述。从这一点来说，除了对本发明有基本理解所必需的内容不会再对本发明进行更详细的结构性细节描述，对于附图的描述可使所属领域技术人员明了本发明的各种形式如何实施。
[0080]在附图中:
[0081]图1证明了使用重组腺病毒载体可有效过表达PKC同种型:左边:四天龄的原代角质化细胞用β-gal腺病毒感染I小时。感染后48小时，固定细胞，通过诱导蓝色反应定量确定β_半乳糖苷酶蛋白的活化并与未感染的角质化细胞相比。右边:四天龄的原代角质化细胞用重组同种型特异性PKC腺病毒感染I小时。二十四小时后，提取感染培养物(Ad)和未感染对照培养物(C)的蛋白进行Western blot分析,用下述实施例部分所述的同种型特异性抗-PKC抗体分析样品。 [0082]图2显示了苔藓虫素I (bryostatinl)对PKC的激活诱导过表达的PKC同种型的迁移。四天龄的原代角质化细胞用同种型特异性的重组PKC腺病毒感染I小时。感染后二十四小时，细胞不进行处理(C)或用苔藓虫素I(B)刺激30分钟，然后分级。将蛋白样品进行Western blot,用同种型特异性抗-PKC抗体分析。
[0083]图3显示了过表达的PKC同种型的天然形式具有活性。四天龄的原代角质化细胞用同种型特异性重组PKC腺病毒感染I小时。感染后18个小时，将未感染的对照细胞(C)和PKC同种型过表达细胞(OE)的细胞裂解物用同种型特异性抗PKC抗体进行免疫沉淀反应。将免疫沉淀物用于进行PKC活性检测，如下述实施例部分所述。
[0084]图4证明了过表达的特异性PKC同种型诱导原代角质化细胞中的明显的形态学改变。原代角质化细胞不进行处理(C)或者用重组PKCa，δ，η，或ζ腺病毒感染。二十四小时后，用亮场显微镜对培养物进行观察并拍照(x20)。
[0085]图5显示了过表达的PKC同种型在被感染的原代角质化细胞中的清楚定位。将原代角质化细胞接种在层粘连蛋白5(laminin5)涂覆的玻璃载玻片上。培养物不进行处理或者用不同的重组PKC腺病毒感染。感染后二十四小时，固定细胞，洗涤并风干。用同种型特异性抗PKC抗体然后用FITC结合的二抗对培养物进行免疫荧光分析。用共聚焦显微镜对细胞进行扫描，对典型视野进行拍照。
[0086]图6证明了 PKC同种型特异性调节α6β4整联蛋白的表达。五天龄的原代小鼠皮肤角质化细胞不进行处理或者用PKCS，PKCa ,PKCn或PKC(重组腺病毒感染。感染后四十八小时，用膜细胞组分进行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素滤膜上，用抗a 6和抗β 4抗体进行免疫印迹并用ECL进行分析。
[0087]图7显示了过表达的PKC η和PKC δ诱导角质化细胞的增殖。五天的原代小鼠皮肤角质化细胞不进行处理或者用PKCS，PKCa，PKCn或PKC(重组腺病毒感染。感染后四十八小时，进行I小时的3H-胸苷掺入以分析细胞增殖，如实验步骤中所述。结果表示为cpm /培养皿，与半乳糖苷酶感染的角质化细胞相比较。各个值表示为3次独立实验中三次重复测定值的平均值土标准差。
[0088]图8证明了 PKC同种型的过表达对a 6 β 4整联蛋白的半桥粒定位的作用。原代角质化细胞接种在层粘连蛋白5涂覆的玻璃载玻片上，将角质化细胞培养物在低Ca2+的MEM中保持48小时。然后培养物不进行处理(A)，或者被PKC a，PKC δ，PKC η或PKC ζ重组腺病毒感染(分别是B-E)。感染后二十四小时，用4%多聚甲醛固定角质化细胞，然后用0.2%Triton-X-1OO温和提取，用PBS洗涤并风干，如实验步骤中所述。用同种型特异性抗α 6抗体然后用FITC结合的二抗对培养物进行免疫荧光分析，如实验步骤中所述。[0089]图9A-B显示了过表达的PKC δ和PKC ζ在体外诱导角质化细胞的分离(detachment)。(A)原代角质化细胞不进行处理(C)或者被重组PKC α，δ，η或ζ腺病毒感染。感染后24小时和48小时分析细胞附着，提取细胞并且再次将它们接种到基质涂覆的培养皿上。细胞数目表示为附着细胞的蛋白浓度(mg /个培养皿)。(B)原代角质化细胞不进行处理(C)或者被重组PKCa，δ，η或ζ腺病毒感染。感染后24小时收集培养介质中的脱离的漂浮细胞，对细胞的分离进行分析。细胞数目表示为分离细胞的蛋白浓度(mg /个培养皿)。
[0090]图10证明了在正在积极增殖的角质化细胞中表达PKC η。原代角质化细胞接种(plate)在层粘连蛋白5涂覆的玻璃载玻片上。接种后四十八小时，将角质化细胞与BrdU溶液培育I小时，然后用抗PKC n (红色)和抗BrdU (绿色)抗体进行免疫荧光分析,如下述的实施例部分所述。用共聚焦显微镜对细胞进行扫描，对典型视野进行拍照。
[0091]图11证明了 PKC η诱导，而PKC η突变体减少角质化细胞增殖。原代皮肤角质化细胞被重组PKCn腺病毒或PKCn腺病毒的显性失活突变体(dnpkcn或pkc DNn)感染I小时。感染后四十八小时，进行1小时的3H-胸苷掺入以分析细胞增殖，如下述实施例部分所述。结果表示为cpm /个培养皿。对照是未感染的细胞。
[0092]图12A-B证明了 PKC η和DNPKC η的过表达特异调节PKC的定位和细胞形态。原代皮肤角质化细胞被重组PKC η腺病毒或PKC η腺病毒的显性失活突变体(PKC DNn)感染I小时。感染后四十八小时，固定角质化细胞并且㈧进行亮场照相(x20)以及⑶用PKCn特异性抗体然后用FITC结合的二抗进行免疫荧光分析，如实验步骤中所述。对照为未感染的细胞。
[0093]图13Α-Β显示了在增殖的角质化细胞中PKC η表达的抑制诱导角质化细胞的分化。原代皮肤角质化细胞在低Ca2+的培养基中保持增殖或者在0.12mM Ca2+的条件下分化24小时。然后，用重组PKC η腺病毒或PKC η腺病毒的显性失活突变体(PKC DNn)感染角质化细胞I小时。感染后二十四小时，将角质化细胞保持在低Ca2+的培养基中或者转至含有0.12mM Ca2+的分化培养基中再保持24小时。感染后四十八小时，提取角质化细胞并用SDS-PAGE凝胶分析。用Western blott ing分析PKC η (A)和角蛋白I(B)的表达。
[0094]图14证明了在小鼠的切割创伤中，体内PKC n的局部表达增加肉芽组织的形成并加速创伤愈合。在裸鼠背部造成7mm的整块皮肤的切口。在发生创伤后I天和4天局部施用对照i3_gal，PKCn和PKCa腺病毒悬液。将整块皮肤创伤固定在4%多聚甲醛中，用H&E染色以及亮场显微镜对皮肤切片进行组织学分析。E是表皮，D是真皮。
[0095]图15证明了在增殖的角质化细胞中胰岛素，而不是IGFl特异地诱导PKC δ的迁移。分离原代角质化细胞并接种，如下述实施例部分所述。在低Ca2+的培养基(0.05mM)中保持增殖的角质化细胞5天，直至它们达到80%汇合。将细胞用10_7M胰岛素(Ins)或10_8MIGFl(IGF)刺激15分钟。如上所述溶解细胞，用刺激过的或者未刺激过的对照(Cont)细胞的20 μ g膜或细胞溶质提取物进行SDS-PAGE并转移。用针对每一个PKC同种型的特异性多克隆抗体对印迹进行探测。
[0096]图16显示了是胰岛素而不是IGFl可诱导PKC δ的活性。为了确定PKC δ的活性，将五天的角质化细胞培养物用10_7Μ胰岛素(Ins)或KT8MIGFl (IGF)刺激指定的时间(1，15，或30分钟)。用特异性抗PKC δ抗体从膜(蓝色条，mem)和细胞溶质(紫色条，cyto)组分中将PKC δ免疫沉淀出来。用体外激酶检测分析PKC δ免疫沉淀物的PKC活性，如实验步骤中所述。每一条表示3次独立实验中3个测定值的平均值土SE。各个值表示为pmolATP /培养皿/分钟。
[0097]图17A-B显示了胰岛素和IGFl对于角质化细胞增殖具有加和效果。增殖的角质化细胞在低Ca2+的培养基(0.05mM)中保持5天直至它们达到80%汇合。㈧五天的角质化细胞培养物用指定浓度的胰岛素或IGFl刺激24小时。(B)同时，将角质化细胞用10_7M胰岛素(Ins)和剂量增加的IGFl(IGF)刺激。在每个浓度，右条(条纹条)表示将两个激素一起加入观察到的增殖。左条证明了 10_7M胰岛素(红色条)和浓度增加的IGFl (灰色条)单独的效果。如实验步骤中所述检测胸苷的掺入。结果代表了六个实验的结果。每一条都是3次测定值的平均值土SE，表示为高于对照的未刺激的角质化细胞的百分数。
[0098]图18A-B证明了重组PKC腺病毒构建体的过表达。用含有野生型PKC δ (WTPKC δ )，野生型PKC a (WTPKC α )，或显性失活PKC δ突变体(DNPKC δ )的重组腺病毒构建体感染角质化细胞培养物。(A)感染后将细胞培养24小时，收集，对20 μ g蛋白质提取物用特异性抗PKCa或抗PKC δ抗体进行Western blotting分析。印迹结果代表了 5次独立实验的结果。(B)感染后二十四个小时，收集细胞，用体外激酶检测分析PKC α或PKCS免疫沉淀物。
[0099]图19显示了 PKC过表达对于胰岛素或IGFl诱导的增殖的作用。未感染的(浅蓝条)，或过表达WTPKC δ (深蓝条)或DNPKC δ (斜线蓝条)的细胞用IO-7M胰岛素(Ins)，IO-8M IGFl (IGF)或二者(Ins+IGF)处理24小时。如实验步骤中所述检测胸苷的掺入。每一条表示用单独的培养物进行的3次实验的3个测定值的平均值土SE。各个值表示为基于作为对照的每个实验中同一培养物的未刺激的角质化细胞的百分数。
[0100]图20显示了 PKC δ活性的抑制特异性消除胰岛素诱导的角质化细胞的增殖。如下述实施例部分所述培养原代角质化细胞。未感染的细胞或DNPKCS感染的角质化细胞用下述浓度的生长因子刺激24小时:10_7Μ胰岛素(Ins)，IO-8M IGFl (IGF)，IOng / ml EGF，IOng / ml PDGF, Ing / ml KGF或5ng / ml ECGF。如下述实施例部分所述检测胸苷的掺入。每一条都表示用单独的培养物进行的3次实验的3个测定值的平均值土SE。各个值表示为基于作为对照的每个实验中同一培养物的未刺激的角质化细胞的百分数。
[0101]图21显示了过表达的PKC δ特异调节胰岛素诱导的角质化细胞增殖。原代角质化细胞如图1所述那样培养。未感染的细胞或用过表达的WTPKCS感染的角质化细胞用下述浓度的生长因子刺激24小时:10_7Μ胰岛素(Ins)，IO-8M IGFl (IGF)，IOng / ml EGF，IOng / ml PDGF, Ing / ml KGF或5ng / ml ECGF。如下述实施例部分所述检测胸苷的掺入。每一条都表示用单独的培养物进行的3次实验的3个测定值的平均值土SE。各个值表示为基于作为对照的每个实验中同一培养物的未刺激的角质化细胞的百分数。
[0102]图22A-B证实了 PKC δ和PKC ζ在体内皮肤创伤愈合过程中具有重要作用。使用新开发的同种型特异性PKC无效小鼠的体内小鼠模型，对PKCa，PKC δ和PKCC无效小鼠和它们的野生型的同窝出生小鼠进行创伤愈合研究。麻醉小鼠并在小鼠背上通过穿刺活检造成直径4mm的皮肤。在进行一周的跟踪后取下小鼠皮肤，用破裂室方法对皮肤薄片进行创伤强度测试以确定皮肤创伤的愈合。其值表达为破裂压力，其代表在监测室内直至发生破裂的最大压力。结果为12-20只小鼠的不同组的测定值。实验重复至少3次。[0103]图23确定了原代皮肤角质化细胞中STAT3和PKC δ之间的特异的相互作用。原代角质化细胞不进行处理(上)或者用同种型特异性重组PKC腺病毒感染I小时(下)。提取细胞用同种型特异性PKC抗体进行免疫沉淀(IP)。用抗PKC或抗STAT3抗体对免疫沉淀物进行Western blot分析。
[0104]图24证明了 PKC δ的活化对于胰岛素诱导的STAT3的转录活化具有重要作用。将原代角质化细胞接种在玻璃载玻片上，在低Ca++(0.05mmol / I)的培养基中保持5天直至它们达到80%汇合。细胞不进行处理(Cont,上)或者用5μΜ Rottlerin预处理7分钟(R，下)，然后用10_7Μ胰岛素处理5分钟(Ins)。用甲醇固定细胞，洗涤并风干。用抗磷酸-Tyr-705-STAT3抗体然后用FITC结合的二抗免疫荧光以分析培养物。用共聚焦显微镜扫描细胞。 [0105]图25证明了过表达DN PKC δ抑制PKC δ和STAT3的过表达诱导的角质化细胞的增殖。原代角质化细胞用含有β -Gal (作为对照)，PKC δ，WT STAT3，DN STAT3的重组腺病毒构建体感染I小时或用DN PKC δ，然后用STAT3进行双重感染。感染后24小时，进行I小时的3H-胸苷掺入以分析细胞增殖。结果表不为DPM / mg蛋白质。每一条都是用同一培养物的平板(plate)进行的三次测定的平均值。
[0106]图26证明了胰岛素施用的浓度和频率对于体内创伤愈合的作用。在8-10周龄的C57BL小鼠背部切出创伤切口，用PBS (对照)处理或者以不同浓度和频率进行胰岛素处理(也就是七天里每天重复施用相对于单独施用一次)。致创后七天将小鼠处死，检测处理的创伤部位。结果表示为mm2创伤部位，每一条都是六次重复的平均值土标准差(P〈0.005)。
[0107]图27证明了胰岛素施用的浓度和频率对于体内创伤愈合的组织学效果。在8-10周龄的C57BL小鼠背部切出创伤切口，以不同浓度和频率进行胰岛素处理(也就是七天里每天重复施用相对于单独施用一次)。致创后七天制备组织学创伤切片，分析表皮和真皮的闭合(创伤收缩)。表皮的闭合用Keratinl4(K14)抗体染色(左)检测，如果创伤的整个裂口都是染色阳性，则视为阳性。如果真皮创伤的两边在光学显微镜下在XlOO的放大倍数下在一个视野中都能看见(右)，则真皮的闭合视为阳性。结果表示为创伤闭合相对于对照的百分数，每一条都是六次重复的平均值。
[0108]图28证明了胰岛素和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF-BB)组合使用对于体内创伤愈合的协同作用。在8-10周龄的C57BL小鼠背部切出创伤切口，用胰岛素，I3DGF-BB,或组合使用胰岛素和TOGF-BB进行单次施用。致创后七天处死小鼠，取活组织进行表皮和真皮闭合(创伤收缩)的组织学分析。表皮的闭合用Keratinl4(K14)抗体染色(左)检测，如果创伤的整个裂口都是染色阳性，则视为阳性。如果真皮创伤的两边在光学显微镜下在XlOO的放大倍数下在一个视野中都能看见(右)，则真皮的闭合视为阳性。结果表示为条形图，为创伤闭合相对于对照的百分数，每一条都是六次重复的平均值。
[0109]图29A-D是示出胰岛素和PKCa抑制剂组合使用对体内创伤愈合的形态学作用的照片。在8-10周龄的C57BL小鼠背部切出创伤切口，不进行处理(对照)或用胰岛素(HO / 01)和PKC α抑制剂(HO / 02)组合处理。致创后7天除下皮肤活组织进行形态学观察。图29A-B显示了对照创伤，图29C-D显示了处理的创伤。
[0110]图30是示出胰岛素和PKCa抑制剂组合使用对真皮闭合(创伤收缩)的作用的组织显微照片。在8-10周龄的C57BL小鼠背部切出创伤切口，不进行处理(对照)或用胰岛素(HO / 01)和PKCa抑制剂(HO / 02)组合起来每天处理。致创后七天处死处理的小鼠。制作组织学创伤切片并在光学显微镜下观察。如果真皮创伤的两边在XlOO的放大倍数下在一个视野中都能看见，则真皮的闭合视为阳性。未处理的对照切片(左)的张开的创伤区域太大不能容纳于一个XlOO放大的视野中，而处理的创伤切片(右)表现出真皮闭合阳性。黄色斑点线标出了真皮的边缘。
[0111]图31是示出胰岛素和PKCd抑制剂组合使用对表皮闭合的作用的组织显微照片。在8-10周龄的C57BL小鼠背部切出创伤切口，不进行处理或用胰岛素(HO / 01)和PKC α抑制剂(HO / 02)组合起来每天处理。致创后七天处死处理的小鼠。制备创伤的组织切片，用角蛋白14(指示基底角质化细胞)染色，在光学显微镜下观察。未处理的对照切片(左)中的张开的创伤区域(箭头标出)太大不能容纳于一个xlOO放大的视野中，而处理的创伤切片(右)整个裂口表现出表皮闭合。
[0112]图32是示出胰岛素和PKC α抑制剂组合使用对表皮细胞空间分化的作用的组织显微照片。致创小鼠(C57BL，8-10周龄)用胰岛素(HO / 01)和PKC α抑制剂(HO / 02)组合起来每天局部施用进行处理。致创后七天处死处理的小鼠。制备创伤的组织切片，用突出显示细胞空间分化的初始阶段的keratinl(Kl)抗体染色。未处理的对照切片(左)表现出大的未分化的创伤区域(由箭头标出)，而处理的创伤切片(右)中则观察到大量的表皮重建。
[0113]图33证明了胰岛素和PKCa抑制剂组合使用对体内创伤愈合的定量作用。致创小鼠(C57BL，8-10周龄)用胰岛素(HO / 01)和PKC α抑制剂(HO / 02)组合起来每天局部施用进行处理。致创后七天处死处理的小鼠。制备创伤的组织切片，进行真皮收缩，表皮闭合和空间分化的分析，如上述图30-32所述。条形图显示出了通过组织学分析得出的每一个处理组中完全愈合的创伤的发生率(百分数)。
[0114]图34A-G是真皮`细胞中PKCa的表达和/或活性的抑制和另一种PKC同种型的表达和/或活性的调节，或者给真皮细胞施用激素对于体外皮肤创伤的闭合的组合效果的示例照片。将培养的原代皮肤成纤维细胞用显性失活(DN)的激酶失活的PKCa感染。二十四小时后实施刮擦，培养物不进行处理(图34A)，或者用野生型(WT)PKC δ (图34Β)，PKC η (图34C)，WT PKC ζ (图34D)或WT PKC ε (图34Ε)感染。另外，PKC α抑制的培养物用adipsin (2 yg / ml ;图34F)或胰岛素(6.7xlO_7M ;图34G)处理。处理后24小时拍照。
[0115]图35A-H是真皮细胞中PKC α的表达和/或活性的抑制和另一种PKC同种型的表达和/或活性的调节，或者给真皮细胞施用生长因子对于体外皮肤创伤的闭合的组合效果的示例照片。将培养的原代皮肤成纤维细胞用显性失活(DN)的激酶失活的PKCa感染。二十四小时后实施刮擦，培养物不进行处理(图35Α)，或者用野生型(WT)PKC ε (图35D)，WTPKC ζ (图35Ε)或WT PKC η (图35F)感染。或者，PKC α抑制的培养物用IL-6 (每个培养血I μ g ;图 35B)，KGF (每个培养皿 I μ g ;图 35C)，PKC δ RACK (IO^7M ；图 35H)或 TNF α (12 μ g /ml ;图35G)处理。处理后24小时拍照。
[0116]图36A-B是真皮细胞中PKC ζ的表达和/或活性的抑制，和给真皮细胞施用生长因子对于体外皮肤创伤的闭合的组合效果的示例照片。将培养的原代皮肤成纤维细胞用显性失活(DN)的激酶失活的PKCC (DN ζ)感染。二十四小时后实施刮擦，培养物不进行处理(图36A)，或者用KGF (每个培养皿I μ g ;图36B)处理。处理后24小时拍照。
[0117]图37A-D是真皮细胞中PKC ζ的表达和/或活性的抑制，和给真皮细胞施用生长因子或激素对于体外皮肤创伤的闭合的组合效果的示例照片。将培养的原代皮肤角质化细胞用显性失活(DN)的激酶失活的PKCC (DN ζ)感染。二十四小时后实施刮擦，培养物不进行处理(图37Α)，或者用IL-6 (每个培养皿I μ g ;图37B)，TNF α (12 μ g / ml ;图37C)或adiponectin (每个培养皿I μ g ;图37D)处理。处理后24小时拍照。
[0118]图38A-E是真皮细胞中ΡΚ(:β的表达和/或活性的抑制，和给真皮细胞施用生长因子，胰岛素或GW9662对于体外皮肤创伤的闭合的组合效果的示例照片。将培养的原代皮肤成纤维细胞用显性失活(DN)的激酶失活形式的PKCi3 (DNβ)感染。二十四小时后实施刮擦，培养物不进行处理(图38Α)，或者用KFG (每个培养皿I μ g ;图38B)，IL-6 (每个培养皿I μ g ;图38C)，胰岛素(6.7x1 O^7M ；图38D)或GW9662 (每个培养皿I μ g ;图38E)处理。处理后24小时拍照。
[0119]图39A-E是真皮细胞中PKC δ的表达和/或活性的抑制和另一种PKC同种型的表达和/或活性的调节，或者给真皮细胞施用激素对于体外皮肤创伤的闭合的组合效果的示例照片。将培养的原代皮肤角质化细胞用野生型(WT)的激酶形式的PKCS (DN δ)感染。二十四小时后实施刮擦，培养物不进行处理(图39Α)，或者用WT PKC ζ (ΡΚΟζ ;图39Β)，WT PKC ε (PKC ε ;图39C)或DN PKCa (PKCa ;图39D)感染。或者，PKCS提高的培养物用adipsin (2 μ g / ml ;图39E)处理。处理后48小时拍照。
[0120]图40A-F是施用共聚物-1，胰岛素，PKC α伪底物，或其组合对于体外皮肤创伤闭合的效果的示例照片。培养的原代皮肤角质化细胞不进行处理(图40Α)，或者仅用胰岛素(6.7x1 O^7M ；图40Β)，仅用共聚物-1 (55 μ g /培养皿；图40C)，胰岛素和PKC α伪底物的混合物(分别为6.7χ10_7Μ和IO7M ；图40D)，共聚物-1和胰岛素的混合物(分别为55 μ g /培养皿和6.7x1 O^7M ；图40E)，或共聚物_1，胰岛素和PKC α伪底物的混合物(分别为55 μ g /培养皿，6.7xl(T7M和IO7M ;图40F)处理。处理后48小时拍照。
[0121]图41A-D是共聚物-1，胰岛素`，PKCa伪底物，或其组合对于体内创伤愈合的效果的示例照片。致创小鼠不进行处理(图41Α)或在4天里每天局部施用共聚物-1(55 μ g /ml ;图41B)，共聚物-1和胰岛素的混合物(分别为55 μ g /皿I和41C)，或共聚物-1，胰岛素和PKC α伪底物的混合物(分别为55 μ g / ml，I μ M和I μ M ;图41D)。致创后4天拍照。
[0122]图42Α-Η是接近创伤裂口的胸腺对于创伤愈合过程的效果的示例的组织显微照片。图42Α-Β显示了正常的成年啮齿动物的胸腺的200倍(χ200)放大图。图42C显示了 7天龄创伤的40倍(χ40)放大图，在离创伤裂口非常接近的地方观察到胸腺(红色正方形，放大200倍，图42D)。创伤重新形成上皮，形成肉芽组织，真皮正在进行收缩。图42E-F显示了放大40倍(图42Ε)和200倍(图42F)的STZ糖尿病小鼠的9天龄创伤，在创伤裂口附近没有观察到胸腺，没有观察到重新形成上皮，肉芽组织，或真皮收缩。图42G显示了放大40倍的STZ糖尿病小鼠的9天龄创伤。将创伤用胰岛素和PKC α伪底物的混合物处理。在创伤裂口附近观察到胸腺(红色正方形，放大20倍，图42H)。创伤重新形成上皮，形成肉芽组织，真皮正在进行收缩。
[0123]图43是胰岛素和PKCa抑制剂组合使用对创伤和损伤皮肤愈合的作用的示例照片。在Large Whites&Landrace家养猪的背部形成纵向创伤切口，在15天中每天用PBS (对照)或I μΜ胰岛素和IyMPKCa伪底物(HO / 03 / 03)的混合物处理。致创后30天对创伤拍照。与缓冲液对照相比，HO / 03 / 03处理的创伤完全愈合，没有疤痕形成，显著增加了皮肤的美感。
[0124]优选实施方案
[0125]本发明是用于调节丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也称为PKC的表达和/或活化，以诱导和/或加速细胞增殖和/或细胞分化，从而加速创伤的愈合过程的方法和药物组合物。根据本发明的教导，这种表达的调节可以通过下述作用实现:α)用PKC表达构建体转化创伤细胞；(?)用顺式作用元件转化创伤细胞，该元件将被插入到创伤细胞内源PKC基因上游邻近位置；(iii)施用胰岛素和其它能与胰岛素协同作用的试剂以调节创伤细胞中PKC的表达和/或活化；(iv)用胰岛素表达构建体转化创伤细胞，其产生的表达的和分泌的胰岛素可作为PKC的表达和/或活化的上调剂；(V)用顺式作用元件转化创伤细胞，该元件将被插入到创伤细胞内源胰岛素基因上游邻近位置，其产生的表达的和分泌的胰岛素可作为PKC的表达和/或活化的上调剂；(Vi)向创伤中植入胰岛素分泌细胞；(Vii)用反式作用因子，例如roxi转化创伤细胞，以诱导内源胰岛素的产生和分泌，胰岛素可作为PKC的表达和/或活化的上调剂；以及(Viii)给创伤施用PKC调节剂。
[0126]参考附图以及说明 书可更好地理解本发明所述方法和药物组合物的原理和操作。
[0127]在详细描述本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不限于下述说明书中或实施例部分例示的具体的组分组成或排列。本发明能够以其它实施方案或者以不同的方式实施。而且，应当理解本文所使用的措辞和术语仅是为了描述使用，而不应当视为是限制。
[0128]成年人皮肤包括两层:角质化的成层的表皮层和在下面的厚层的富含胶原的真皮层结缔组织，提供支持和营养。皮肤作为保护屏障抵御外界。因此任何皮肤的损伤或破裂都必须被快速有效地修复。如上述【背景技术】部分所述，修复的第一个阶段是通过形成血液凝块堵住最初的创伤来实现的。然后炎性细胞，成纤维细胞和毛细血管侵入血液凝块形成肉芽组织。后续阶段包括创伤的上皮重建，其中基底角质化细胞必须失去与半桥粒的连接，角质化细胞迁移到肉芽组织上，覆盖住创伤。角质化细胞迁移以后，角质化细胞加速增殖，其容许代替在损伤中损失的细胞。在创伤被单层的角质化细胞覆盖之后，形成新成层的表皮，重建新的基底膜(20-23)。已证明几种生长因子参与该过程，包括生长因子的EGF家族，KGF, PDGF和TGF β I (22-24)。在这些生长因子中，EGF和KGF与表皮角质化细胞的增殖和迁移的调节密切相关(25，26)。对于了解创伤愈合生物学而言很重要的是了解触发创伤中的细胞迁移、增殖、并在创伤裂口上铺放新的基质的信号。
[0129]为了便于理解下面公开的发明，如下述定义多个术语。
[0130]术语“创伤(wound)”泛指通过多种方式(例如长时间卧床休息造成的褥疮，外伤导致的创伤，切口，溃疡，烧伤等)中的任意一种导致的皮肤和皮下组织的损伤，其特征各不相同。创伤根据创伤的深度典型地可分为四个等级中的一种:a) I级:创伤只限于上皮；(?) II级:创伤延伸到真皮；(iii) III级:创伤延伸到皮下组织；(iv) IV级(或全厚度创伤):暴露出骨头的创伤(例如骨头突出的压力点(bony pressure point)例如较大的转节或骶骨)。[0131]术语“部分厚度创伤”指包括1-1II级的创伤；部分厚度创伤的实例包括烧伤，褥疮，静脉淤滞溃疡，和糖尿病溃疡。
[0132]术语“深度创伤”包括111级和IV级创伤。
[0133]术语创伤“愈合”指例如通过形成疤痕修复创伤的过程。
[0134]短语“诱导或加速皮肤创伤的愈合过程”指诱导创伤收缩的肉芽组织形成和/或诱导上皮形成(也就是在上皮生成新细胞)。创伤愈合可方便地通过减小的创伤面积检测。
[0135]本发明考虑了治疗所有的创伤类型，包括深度创伤和慢性创伤。
[0136]术语“慢性创伤”指在三十天内没有愈合的创伤。
[0137]短语“转化细胞”指通过引入外源核酸暂时或永久地改变细胞的核酸，所述外源核酸整合到细胞基因组中，从遗传上改变所述细胞，或者保持未整合状态。
[0138]本文所用的术语“顺式作用元件”是指作为DNA结合蛋白的附着位点的基因区域(例如增强子，操纵子(operator)和启动子)，从而影响同一个染色体上一个或多个基因的活性。
[0139]本文所用的短语“反式作用因子”是指与顺式作用元件结合并调节其有关基因表达的活性的因子。例如，PDXl是与胰岛素基因启动子结合并调节其活性的反式作用因子。
[0140]本文所用的短语“转录活化剂”是指能增加基因表达的因子。反式作用因子是直接转录活化剂的实例。
[0141]本文所用的术语“活化剂”是指增强活性的分子。
[0142]本文所用的短语“被调节的表达和/或活化”是指增强的或抑制的表达和/或活化。
[0143]PKC是一条主要的信号传导途径，其可以调节角质化细胞的增殖和分化。PKC同种型α，δ，ε，η和ζ在皮肤中表达(4，10)。在构思本发明时，设想PKC表达和/或活化的调节可以诱导细胞增殖和/或细胞分化，从而加速创伤的愈合过程。当实施本发明的时候大量实验证明了这个理论，表明PKC表达和/或活化的调节确实诱导细胞增殖和细胞分化并加速创伤的愈合过程。在进一步的具体描述中，采用了多种不同的方法调节PKC的表达和/或活化，从而加速了创伤的愈合过程。基于这些实验发现，设计了其它方法。当实施本发明的时候发现了一个引人注目的新现象-胰岛素可作为PKC表达和/或活化的调节剂。因此，胰岛素可作为调节PKC表达和/或活化的治疗剂以加速创伤的愈合过程。
[0144]不同的PKC同种型的特征以及它们对于细胞增殖和/或分化的效果对于皮肤创伤愈合生物学是非常重要的。使用PKC腺病毒构建体能够鉴别各种PKC同种型对于体外和体内创伤愈合过程的特定作用。所有同种型都能够特定地影响角质化细胞生长和分化的不同方面。两个同种型，PKCS和PKC(能够特定地调节整联蛋白的调控(参见下述实施例6)，与基底膜的附着(参见下述实施例9)和半桥粒的形成(参见下述实施例8)。发现两种同种型，PKC δ和PKC η调节表皮角质化细胞的增殖潜力(参见下述实施例7和11)。另外，PKC η的显性失活同种型(DNPKC II)特别能够在积极增殖的角质化细胞中诱导分化(参见下述实施例12)。最后，还在体内系统中证实了不同PKC同种型对于皮肤创伤愈合过程的作用。使用其中不同PKC同种型的表达被破坏的PKC无效的小鼠，本文显示了皮肤角质化细胞的附着和迁移过程所必需的PKCS和PKCC对于动物模型中体内创伤愈合过程也是很重要的。(参见实施例19)。PKC无效的皮肤的整个皮肤的全厚度活组织检查表明PKC δ和PKC(而不是PKCa对于创伤的正确愈合是必需的。而且，下述实施例22显示了 PKCa抑制剂有效促进体内创伤愈合，因而表明PKCa同种型可能对创伤愈合具有拮抗作用。
[0145]PKCn具有独特的组织分布。它主要在上皮组织中表达(27，28)。原位杂交研究和免疫组织化学研究证明PKC η在正在分化的和分化的(differentiating anddifferentiative)层中高度表达(27)。本文的结果表明根据细胞生理学PKC η可作为皮肤增殖和分化的功能性调节剂。当角质化细胞在低Ca2+条件下维持在增殖状态的时候，PKC n诱导增殖的速度为对照角质化细胞的五到七倍。但是，当通过增加Ca2+浓度诱导细胞分化的时候，与对照细胞相比分化以更快和更高的速度被诱导(参见实施例12)。这可以解释PKCn显著诱导创伤愈合以及肉芽组织形成的能力，因为增殖能力和分化层形成都实现了。有趣的是，体内创伤愈合结果和PKCil在胚胎组织中的表达，其通常在成年期不以高水平表达PKC η，表明PKC n在其它组织的增殖和组织结构中可能具有作用。这包括神经以及真皮和肌肉组织，它们可在创伤的肉芽组织中有效愈合。而且，通过使用显性失活(dominantnegative)突变体在积极增殖的细胞中特别调节角质化细胞的分化和诱导正常分化的能力使得特别可以操纵分化并控制创伤愈合过程中的过度增殖失调。
[0146]本文举例说明了在裸鼠背部产生的创伤上，PKCn的愈合能力是体内施加的。下述实施例14表明在局部感染后四天，对创伤施用PKCn表达构建体导致肉芽组织的形成。
[0147]总的来说，本文的结果证明了调节不同PKC同种型的表达和/或活化(膜迁移)是对抗创伤的有效工具。相应地，可以通过增加同种型PKC δ，PKC η和PKC ζ的表达和/或活性，或者通过抑制同种型PKC α的表达和/或活性促进创伤愈合。
[0148]因此，根据本发明的一个方面，提供了一种诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的方法，所述方法通过给皮肤创伤施用治疗有效量的至少一种调节PKC表达和/或活化的试剂来实现。根据本发明的该方面，用于实施该方法的药物组合物因此包括作为活性成分的治疗有效量的至少一种用于调节PKC表达和/或活化的试剂；和药学可接受的载体。
[0149]本文所用的短语“皮肤创伤”是指任何类型的上皮创伤，包括但不限于溃疡，例如糖尿病性溃疡，褥疮，静脉溃疡，胃溃疡和HIV相关溃疡，糖尿病相关的创伤，烧伤，晒伤，老化皮肤创伤，角膜溃疡创伤，炎性胃肠道疾病创伤，肠炎性疾病创伤，克罗恩氏病创伤，溃疡性结肠炎，痔疮，大疱性表面松解症创伤，皮肤起疱创伤，牛皮癣创伤，动物皮肤创伤，动物糖尿病创伤，视网膜病创伤，口腔创伤(粘膜炎)，阴道粘膜炎创伤，牙龈病创伤，裂伤，手术切口创伤和手术后粘连创伤(adhesis wound)。
[0150]本文所用的短语“皮肤损伤”是指任何类型的皮肤损伤或状况例如，皱纹(例如紫外线照射导致的皱纹)，皮肤纹，裂缝，肿块，大毛孔(例如与附件结构如汗腺管，皮脂腺，或毛囊相关的)，或不平或粗糙，皮肤失去弹性(功能性皮肤弹性蛋白丧失和/或失活)，下垂(包括眼部和下颌浮肿)，皮肤硬度(firmness)丧失，皮肤紧实度丧失，皮肤变形后的回复能力丧失，变色(包括黑眼圈)，斑疱，肤色灰黄，色素过量皮肤区域例如老年斑和雀斑，角质物，异常的分化，过度角质化，弹性组织变性，胶原蛋白的破坏，以及皮肤角质，真皮，表皮层，皮肤血管系统(例 如毛细血管扩张或多叉血管)，以及皮下组织，特别是靠近皮肤的皮下组织中的其它组织变化。
[0151]皮肤不被认为是典型的胰岛素反应性组织。因此胰岛素在皮肤中的效果主要归于它激活紧密相关的IGFR的能力。已表明在角质化细胞中，胰岛素和IGFl可以刺激受体，激活类似的下游效应子(34)。但是，本发明证明了虽然这两个生长因子都能以剂量依赖的方式诱导角质化细胞增殖，但是每种激素都是以不同的信号传导途径发挥作用。最初指出的胰岛素和IGFl对角质化细胞增殖的不同的调节由以下发现证实:这些激素以每种激素的最大增殖诱导浓度一起加入的时候对于角质化细胞增殖具有加和作用(参见实施例15)。为了鉴别胰岛素和IGFl信号传导途径在角质化细胞增殖的调控上的不同点，检测了已知的可以调节角质化细胞增殖并且作为胰岛素信号传导下游效应子的元件。这些研究表明在角质化细胞的增殖中胰岛素信号传导特别受到PKCS的调节(参见实施例17)。在PKC蛋白家族中PKC δ是一种独特的同种型，特别参与各种细胞类型的生长和成熟(35)。但是，虽然PKC δ被证明特别受到几种生长因子包括EGF，血小板衍生生长因子和神经递质的刺激的调节，但是它的生理学作用已表明是参与了细胞生长包括细胞凋亡、分化和细胞循环延迟或停止的生长因子抑制(36-41)。近来表明在培养的小鼠角质化细胞中在升高Ca2+浓度之后12-24小时内，α6β 4整联蛋白复合体的选择性丧失与Kl的诱导互相关联(6)。α6β4蛋白表达的丧失是转录和翻译后事件，包括对α6和β 4链的处理的增加，导致的。在初步的研究中在PKC的活化和α6β 4整联蛋白的处理和调节之间建立起了联系。这些结果与有关PKCS以及PKCC对于α6β 4表达的丧失和诱导角质化细胞的分离的半桥粒形成的作用的以前的结果是一致的。然而，本发明发现了 PKCS的另一个作用，就是作为胰岛素诱导的角质化细胞增殖的靶。下述实施例表明只有胰岛素的刺激，而不是多种生长因子，包括但不限于EGF，KGF, PDGF, ECGF和IGF1，能够使PKC δ，而不是皮肤中表达的任何其它PKC同种型迁移并使其活化。当EGF，KGF, PDGF, ECGF和IGFl的促有丝分裂刺激没有被PKC δ的显性失活突变体阻断的时候，PKC δ对胰岛素刺激的重要性进一步得到证实，在角质化细胞增殖的调节中胰岛素似乎是这种PKC同种型的主要活化剂(参见实施例17)。但是，当角质化细胞被WT PKC δ角质化细胞感染的时候，EGF和KGF的促有丝分裂刺激增加。这表明PKCS的活化对于通过上游信号传导途径对其它生长因子的增殖性刺激也是必需的。而且，鉴定了下游元件，其在胰岛素诱导的PKCS活化和角质化细胞增殖中起调节作用，而且鉴定了 STAT3，一种参与此过程的转录活化剂。STAT (信号传导和转录激活子)蛋白是一个转录因子家族，包括多种细胞因子和生长因子。在七个已知的STAT家族成员中，STAT3是独特的。靶定破坏STAT3而`不是其它STAT家族成员导致早期胚胎致死。特别地，当在皮肤中有条件地去除STAT3的时候，皮肤的重建被严重破坏。一旦被激活，STAT蛋白形成同源二聚体或异源二聚体，迁移到细胞核中，与靶基因的DNA反应元件结合以诱导转录。发现在角质化细胞中，PKC δ而不是皮肤中表达的其它PKC同种型(PKCa，ζ，η和ε )与STAT3组成型相关(参见实施例18)。而且，胰岛素通过对PKCS的特异性激活调节STAT3的磷酸化，活化和核迁移。通过药物抑制剂，卡马拉素或者过表达显性失活PKCS突变体导致的对PKCS活性的抑制会阻断胰岛素诱导的STAT3活化和核移位。最终，显性失活PKCS突变体的过表达会抑制STAT3的过表达诱导的角质化细胞增殖(参见实施例18)。这些结果表明在皮肤角质化细胞增殖中胰岛素诱导的PKC δ活性对于STAT3的转录激活的作用。由于STAT3对于皮肤重建非常重要，是多种细胞因子和生长因子的下游效应子，全部这些结果表明PKCS的活化是通过多种皮肤生长因子介导角质化细胞增殖的主要下游元件。特别地，PKCS是糖尿病病人的缺陷性创伤愈合的发病机理的主要候选物。PKCS和创伤愈合之间的联系也在体内得到了确证。使用新构建的PKCS无效小鼠，本文表明了缺少PKCS会延迟小鼠皮肤的创伤愈合(参见实施例19)。在几种其它系统中也确定了 PKC δ和胰岛素信号传导之间的联系。例如，最近表明在肌肉培养物中，PKCS调节胰岛素诱导的葡萄糖转运(42，43)。类似地，在过表达胰岛素受体的细胞中，表明胰岛素刺激与PKCS的活化有关(44-46)。但是，虽然在这些研究中胰岛素介导的PKCS的活化与胰岛素的代谢效果有关，这是第一个将PKCS与胰岛素介导的细胞增殖联系起来的报道。鉴别了 PKCS在角质化细胞的增殖和早期分化阶段的控制中起的双重作用，其中在所述早期分化阶段中，细胞丧失了与下面的基底膜之间的附着。这表明胰岛素诱导的PKCS作为调节皮肤的增殖与分化之间的生理平衡的主要候选者。
[0152]因此，根据本发明的教导，通过使创伤细胞接触胰岛素来调节PKC表达和/或活化。这可以通过多种方式实现，如下述的进一步例示。
[0153]一种方式是直接将胰岛素给予创伤。如下述实施例21和22所述，以0.1-10 μ M的浓度对创伤局部施用胰岛素有效促进表皮和真皮闭合以及随后的创伤愈合。然而，令人惊讶的和出乎意料的是，胰岛素和TOGF-BB生长因子，或者和PKC α抑制剂组合施用比单独施用胰岛素对创伤愈合过程产生了显著的和协同性的促进。
[0154]因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的方法。所述方法通过给皮肤创伤施用治疗有效量的胰岛素和至少一种与胰岛素协同作用的其它试剂来实现，以诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程。优选地，所述试剂是PKC α抑制剂。进一步优选地，所述试剂是生长因子例如roGF，EGF, TGF β，KGF, ECGF或IGFl，最优选地所述试剂是I3DGF-BB。
[0155]胰岛素的直接给药，或者单独给药或者与另一种试剂组合给药，可以通过单次或重复应用来实现。在实施本发明的时候，发明人惊讶地发现以?μΜ的浓度单次施用胰岛素对于创伤愈合比以类似浓度进行七次 的每天重复给药显著更有效(参见下述实施例20)。
[0156]因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的方法，包括给皮肤创伤施用单一剂量单位的治疗有效量的胰岛素。优选所述单一剂量单位包括0.001到5ηΜ，优选0.01到0.5ηΜ胰岛素的，例如，水溶液，凝胶，霜剂，糊剂，洗剂，喷雾，悬液，粉末，分散剂，油膏剂或软膏剂制剂，其量足以覆盖Icm面积的皮肤创伤，例如 0.01-0.2ml。
[0157]将胰岛素施用在创伤上的时间安排可能很重要，如下述实施例部分中的实施例20中所述。例如对4天的创伤单次施用胰岛素产生有效的创伤愈合。因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导或加速陈旧皮肤创伤的愈合过程的方法，包括给皮肤创伤施用单一剂量的治疗有效量的胰岛素。
[0158]本文所用的短语“陈旧皮肤创伤”是指至少一天的，至少两天的，至少三天的，优选至少四天的皮肤创伤。
[0159]根据本发明的另一个方面，用于诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的胰岛素，至少一种与胰岛素协同作用的其它试剂，以及设计用于药物组合物的局部应用的药学可接受的载体。优选地，所述试剂是PKCa抑制剂或生长因子例如roGF，EGF, TGF β，KGF, ECGF或IGF1，最优选是TOGF-BB。药学可接受的载体可以是但不限于凝胶，霜剂(cream)，糊剂，洗剂，喷雾，悬液，粉末，分散剂，油膏剂(salve)和软膏剂，下文将进一步详细描述。还可以使用固体支持物以对创伤延长释放胰岛素。应当理解所述胰岛素可以是天然的或者优选是重组的，可以是人源的或是任何其它合适来源的。
[0160]根据本发明的另一个方面，用于诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的药物组合物可以包括所选择的能够诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的单一剂量单位的胰岛素，以及设计用于药物组合物的局部施用的药学可接受的载体。优选地，所述单一剂量单位的胰岛素是在0.01-0.2ml制剂的剂量单位中的0.001到5nM，优选0.01到0.5nM。
[0161]在本发明的另一个实施方案中，将表达和分泌胰岛素的细胞植入创伤，以诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程。这种能产生胰岛素的细胞可以是天然产生胰岛素的细胞，或者可以是被转化以产生和分泌胰岛素的细胞。所述细胞可以用例如重组roxi基因(参见 GeneBank Accession N0.AH005712, AF035260, AF035259)转化，该基因是产生和分泌胰岛素的反式作用因子。或者，所述细胞可以通过基因敲入的方式用顺式作用元件序列转化，例如整合到所述细胞的内源胰岛素基因上游的强的组成型或诱导型启动子，以转化细胞以过度产生和分泌天然胰岛素。这是可以实现的，因为胰岛素基因的上游区域已经被克隆(参见Accession N0.E00011，NM000207)。另外，所述细胞可以用重组胰岛素基因(例如Accession N0.J02547)转化，因此使得所述细胞产生和分泌重组胰岛素。
[0162]因此根据本发明的该方面，用于诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的药物组合物包括，作为活性成分的，胰岛素分泌细胞，以及设计用于药物组合物的局部施用的药学可接受的载体。有利的是，施用给创伤的胰岛素分泌细胞能形成分泌颗粒，因而分泌所产生的胰岛素。所述胰岛素分泌细胞可以是内分泌细胞。其可以是人源的或组织相容性人化的动物来源的。最优选地，所述胰岛素分泌细胞或者是转化的，或者是自体来源的。由所述胰岛素分泌细胞分泌的胰岛素优选是人胰岛素或者具有人胰岛素的氨基酸序列。所述胰岛素分泌细胞可以是成纤维细胞，上皮细胞或角质化细胞，前提是如上所述进行转化以使这些细胞产生和分泌胰岛素。
[0163]在另一个实施方案中，皮肤创伤的细胞被转化以产生和分泌胰岛素，以诱导或加速皮肤创伤的愈合过程。
[0164]因此根据本发明的该方面，用于诱导或加速皮肤创伤的愈合过程的药物组合物包括，作为活性成分的，设计用于转化皮肤创伤细胞以产生和分泌胰岛素的核酸构建体，以及设计用于药物组合物的局部施用的药学可接受的载体。
[0165]上述的任何一种转化方法，例如用编码胰岛素的构建体转化，用含有将通过基因敲入的方式插入到内源胰岛素基因下游的顺式作用元件的构建体转化，以及用编码反式作用因子的构建体转化以激活内源胰岛素的产生和分泌，都可以用于本发明的实施方案中。
[0166]由于生命期短，可能发生分化以及无法分离稳定的转化子，很难用传统方法将外源基因有效引入原代细胞，从而阻碍了以前对于不同PKC同种型对于皮肤的效果的研究。为了克服这些障碍，使用病毒载体引入感兴趣的基因。对病毒基因组进行修饰得到复制缺陷型病毒形式的病毒载体。最广泛使用的病毒载体是逆转录病毒和腺病毒，它们可用于实验目的和基因治疗目的(13)。特别地，与逆转录载体相比，在不复制型细胞中腺病毒感染的高效率，病毒的高滴度和转导蛋白(transduced protein)的高表达使得该系统可非常有利地用于原代培养物。由于腺病毒不整合到宿主基因组中，稳定的病毒滴度可以成为复制缺陷型，因此该病毒构建体在人和动物模型中引起恶性肿瘤的危险最小(14)。至今为止，在皮肤中，已经成功使用腺病毒构建体在离体和体内方法中进行高效感染(15，16)。在本研究中使用由1.Saito和他的同事们开发的一种腺病毒载体(17)。粘粒盒(pAxCAwt)具有几乎是全长的腺病毒5基因组，但是不含有E1A，ElB和E3区域，使得该病毒为复制缺陷型。它含有复合的CAG启动子，由巨细胞病毒立即早期增强子，小鸡β-肌动蛋白启动子，和兔β_球蛋白多聚腺苷酸化信号组成，可强烈诱导插入的DNA的表达(13，17)。感兴趣的基因插入到粘粒盒中，然后与腺病毒DNA末端蛋白复合体(TPC) —起共转染到人胚胎肾293细胞中。在表达ElA和ElB区域的293细胞中，在粘粒盒和腺病毒DNA-TPC之间发生重组，以传统方法的一百倍效率产生所需的重组病毒。这种高效率主要是由于使用腺病毒DNA-TPC代替了蛋白质(proteinesed)DNA。而且,较长同源区域的存在增加了同源重组的效率。由于存在多个EcoT221位点，避免了复制型病毒的再生。应当注意，角质化细胞是用不同的PKC重组腺病毒感染的，证明24小时后有效过表达PKC同种型(参见实施例1)。
[0167]因此，根据本发明，另一种调节PKC表达和/或活化的方法是通过在皮肤创伤细胞中诱导PKC过表达。这可以通过用顺式作用元件序列转化细胞来实现，所述顺式作用元件序列通过同源重组整合到细胞内源蛋白激酶C的上游从而使所述细胞产生天然蛋白激酶C。另外，这也可以通过用重组蛋白激酶C基因转化细胞实现，例如但不限于PKC-β I基因(Accession N0.X06318，NM002738)，PKC-β 2 基因(Accession N0.X07109), PKC-Y 基因(Accession N0.L28035), PKC- Θ 基因(Accession N0.L07032) , PKC- λ 基因(AccessionN0.D28577)，PKC-1 基因(Accession N0.L18964), PKC- α 基因(Accession N0.X52479)，PKC- δ 基因(Accession N0.L07860, L07861), PKC-ε 基因(Accession N0.X72974)，PKC- η 基因(Accession N0.Z15108)和 PKC-ζ 基因(Accession N0.Z15108, X72973,NM002744)， 从而使所述细胞产生重组蛋白激酶C。
[0168]根据本发明的该方面，用于诱导或加速皮肤创伤的愈合过程的药物组合物包括，作为活性成分的，设计用于转化皮肤创伤细胞以产生蛋白激酶C的核酸构建体，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
[0169]根据本发明，另一种调节PKC表达和/或活化的方法是用PKC活化剂，例如但不限于Ca2+，胰岛素或苔藓虫素I来实现的，以诱导或加速皮肤创伤的愈合过程。
[0170]因此根据本发明的此方面，用于诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的PKC活化剂，以诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程，以及药学可接受的载体。
[0171]根据本发明，另一种调节PKC表达和/或活化的方法是下调PKC同种型的表达和/或活性。
[0172]PKC同种型的活性的下调可以使用PKC伪底物同种型抑制剂，例如PKCa ,ΡΚΟζ或PKCn伪底物抑制剂(CalbioChem，California USA)，或者另一种PKC同种型抑制剂例如药用肽 LY379196(Elly Lilly，USA)。
[0173]或者，PKC同种型的活性的下调可以用显性失活(DN) PKC腺病毒构建体来实现，如下述实施例部分所述。
[0174]PKC同种型的表达的下调可以使用小干扰RNA(siRNA)分子。RNA干扰是一个两步过程。第一步，定义为起始步骤，可能是通过Dicer, dsRNA特异性核糖核酸酶的RNase III家族的成员的作用，以依赖于ATP的方式处理(切割)dsRNA(直接引入或通过转基因或病毒)，将输入的dsRNA消化为21-23个核苷酸(nt)的小干扰RNA (siRNA)。后续切割将会将RNA降解为19-21bp的双链(siRNA)，每个都有2’-核苷酸3’突出端[Hutvagner and ZamoreCurr.0pin.Genetics and Developments:225-232(2002)；和 Bernstein Nature409:363-366(2001)]。
[0175]在效应步骤中，siRNA双链与核酸酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。RISC的激活需要siRNA双链以ATP依赖的方式解旋。然后活性RISC通过碱基对的相互作用靶定同源转录物，从siRNA的3’末端将mRNA切割成12个核苷酸的片段[Hutvagner and Zamore Curr.0pin.Genetics and Developments:225-232(2002)；Hammond et al.(2001)Nat.Rev.Gen.2:110-119(2001)；和 Sharp Genes.Dev.15:485-90 (2001)]。虽然切割的机制还有待阐明，研究表明每个RISC含有一个单个的siRNA 和 RNAase[Hutvagner and Zamore Curr.0pin.Genetics and Developments:225-232(2002)]。
[0176]由RNAi的显著效力，表明RNAi途径中具有扩增步骤。可以通过拷贝输入的dsRNA，这会产生更多的siRNA，或者通过复制形成的siRNA来扩增。另外或此外，可以通过RISC的多转换事件(multiple turnover events)实现扩增[Hammond et al.Nat.Rev.Gen.2:110-119(2001), Sharp Genes.Dev.15:485-90 (2001) ；Hutvagner and Zamore Curr.0pin.Genetics and Developments:225-232 (2002) ] ? 要获得更多关于 RNAi 的信息，参见下述综述 Tuschl ChemBiochem.2:239-245(2001) ；Cullen Nat.1mmunol.3:597-599(2002);和Brant I Biochem.Biophys.Act.1575:15-25 (2002)。 [0177]可以如下所述合成适用于本发明的RNAi分子。首先，在PKC同种型mRNA序列的AUG起始密码子的下游寻找AA 二核苷酸序列。每个AA和3’附近19个核苷酸的出现计录为潜在的siRNA靶位点。由于在调控蛋白结合位点中更富含不翻译区(UTR)，优选siRNA靶位点选自开放阅读框架。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物会干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem.2:239-245]。应当理解，针对不翻译区的siRNA也是有效的，由GAPDH证明，其中针对5’ UTR的siRNA介导细胞GAPDH mRNA减少大约90%，完全破坏了蛋白水平(www.ambion.com / techlib / tn / 91 / 912.html)。
[0178]其次，用任何序列比对软件，例如NCBI服务器上的BLAST软件(ymi ncb1.nlm.nih.gov / BLAST / )将潜在的靶位点与合适的基因组数据库(例如人，小鼠，大鼠等)相比较。筛选出与其它编码序列具有显著同源性的推定的靶位点。
[0179]选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是具有低的G / C含量的那些，这是因为这种序列已证明与那些G / C含量高于55%的序列相比能更有效地介导基因沉默。优选沿着靶基因的长度选择几个靶位点进行评价。为了更好地评价所选的siRNA，优选同时使用负对照。负对照siRNA优选与所述siRNA具有同样的核苷酸成分，但是与基因组没有显著的同源性。因此，优选使用siRNA的混杂核苷酸序列，前提是它不会与任何其它基因具有任何显著的同源性。根据本发明，合适的siRNA可以是，例如，能抑制PKCa表达的siRNA，例如SEQ ID NO:1_6的任何核酸序列。
[0180]另一种能下调PKC同种型的试剂是能特异性切割PKC同种型的mRNA转录物或DNA序列的DNA酶分子。DNA酶是能切割单链和双链靶序列的单链多核苷酸(Breaker，R.R.and Joyce, G.Chemistry and Biologyl995 ；2:655 ；Santoro, S.ff.&Joyce, G.F.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1997 ；943:4262)。已提出了 DNA 酶的通用模型(“10-23” 模型)。“10-23”DNA酶具有一个15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，侧翼是两个各自具有七个到九个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域。这种类型的DNA酶可以在嘌呤:嘧啶结合处有效切割其底物 RNA (Santoro, S.ff.&Joyce，G.F.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA199 ；DNA 酶的综述参见 Khachigian，LM[Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002)])。
[0181]构建和扩增合成的、基因工程的能识别单链的和双链的靶切割位点的DNA酶的例子已在Joyce等的U.S.Pat.N0.6，326，174中公开。最近观察到类似设计的针对人尿激酶受体的DNA酶抑制尿激酶受体的表达，并成功抑制体内结肠癌细胞转移(Itoh et al, 20002,Abstract409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.0rg)。在另一种应用中，互补于bcr-abl致癌基因的DNA酶成功抑制白血病细胞中致癌基因的表达，在CML和ALL中减少自体骨髓移植的复发率。
[0182]PKC同种型的下调还可以使用能特异与编码所述PKC同种型的mRNA转录物杂交的反义多核苷酸来实现。
[0183]可用于有效下调PKC同种型的反义分子的设计要考虑反义技术的两个重要方面。第一个方面是寡核苷酸向合适细胞的细胞质中的递送，第二个方面是能以抑制其翻译的方式在细胞中特异结合指定mRNA的寡核苷酸的设计。
[0184]现有技术给出了许多递送策略，可用于将寡核苷酸有效递送到多种细胞类型中[参见,例如 Luft J Mol Med76:75-6(1998) ；Kronenwett et al.Blood91:852-62(1998)；Rajur et al.Bioconjug Chem8:935-40 (1997) ；Lavigne et al.Biochem Biophys ResCommun237:566-71(1997)和 Aoki et al.(1997)Biochem Biophys Res Commun231:540-5(1997)]。
[0185]此外，根据能解释靶mRNA和寡核苷酸中结构变化的能量的热力学循环，鉴别与它们的靶mRNA具有最高的预测的结合亲和力的序列的算法也是可获得的[参见，例如，Walton et al.Biotechnol Bioeng65:1_9 (1999)]。
`[0186]这些算法已成功用于实现细胞中的反义方法。例如，Walton et al.开发的算法使得科学家成功设计出了兔β_球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-a (TNFa)转录物的反义寡核苷酸。同一个研究小组最近报道了针对三个模型靶mRNA (人乳酸脱氢酶A和B和大鼠gpl30)合理选择的寡核苷酸在细胞培养物中的反义活性，其是用证明在几乎所有情况下都有效的动态PCR方法评估的，包括用磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化学对两种细胞类型中的三个不同靶的检测。
[0187]此外，还已公开了几种用体外系统设计和预测特定寡核苷酸的效率的方法(Matveeva et al., Nature Biotechnologyl6:1374-1375(1998))。
[0188]几个临床实验已证明反义寡核苷酸是安全性，可行性和活性。例如，适用于治疗癌症的反义寡核苷酸已经成功使用[Holmund etal., Curr Opin Mol Therl:372-85 (1999)],而用祀定c-myb基因，p53和Bcl_2的反义寡核苷酸治疗血液肿瘤也进入了临床实验，已显示被病人耐受[Gerffitz Curr Opin Mol Therl:297-306 (1999)]。
[0189]最近，已报道了在小鼠模型中反义介导的人乙酰肝素酶(h印aranase)基因表达的抑制可抑制人癌细胞的胸膜扩散[Uno et al.，Cancer Res61:7855-60 (2001)]。
[0190]因此，目前的共识就是最近反义【技术领域】中的进展，如上所述，导致产生了高度精确的反义设计算法和多种寡核苷酸递送系统，使得普通技术人员能够设计和实施适用于下调已知序列的表达的反义方法而不需要过度的试验和错误实验。
[0191]另一种能下调PKC同种型的试剂是能特异切割编码PKC同种型的mRNA转录物的核糖酶(ribozyme)分子。核糖酶越来越多地用于基因表达的序列特异性抑制，通过切割编石马感兴趣蛋白的 mRNA [Welch et al., Curr Opin Biotechnol.9:486-96 (1998)]。能够设计用于切割任何特异靶RNA的核糖酶，这使得核糖酶成为基础研究和治疗应用中的很有价值的工具。在治疗领域，核糖酶用于在感染性疾病中靶定病毒RNA，在癌症中靶定优势的致癌基因以及在遗传疾病中靶定特异的体细胞变异[Welch et al.，Clin Diagn Virol.10:163-71(1998)]。最值得注意的是，有几种用于HIV患者的核糖酶基因治疗方案已经在进行I期实验。最近，核糖酶用于进行转基因动物研究，基因靶的验证和途径的阐明。有几种核糖酶正在进行不同阶段的临床实验。ANGIOZYME是第一个化学合成的用在人临床实验研究中的核糖酶。ANGIOZYME特异性抑制VEGF_r (血管内皮生长因子受体)，一种血管生成途径中的关键成分的形成。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.与其它公司证明了动物模型中抗血管生成治疗的重要性。HEPTAZYME，一种设计用于选择性破坏C型肝炎病毒(HCV)RNA的核糖酶，已发现在细胞培养物的检测中有效减少C型肝炎病毒RNA(RibozymePharmaceuticals, Incorporated-ffEB 主页)。
[0192]优选地，用于诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的药物组合物进一步包括至少一种选自由以下成员构成的组的其它试剂:激素，生长因子，脂肪细胞激素(adipokine)，？此3狀0(和619662。合适的激素包括，但不限于胰岛素。合适的生长因子可以是但不限于白介素-6(IL_6)，角质化细胞生长因子(KFG)或肿瘤坏死因子a (TNFa)0合适的脂肪细胞激素可以是但不限于adipsin或脂联素(adiponectin)。
[0193]在实 施本发明的时候，发明人惊讶地和出乎意料地发现共聚物-1 (glatiremaracetate)能够在体外和体内显著促进创伤愈合(参见下述实施例部分的实施例26)。以前已知共聚物-1是一种免疫调节剂，用于治疗多发性硬化和中枢神经系统疾病(美国专利号 6，620，847，6，362，161，6，342，476，6，054，430，6，046，898，5，981，589 和 5，800，808 ；美国申请序列号10 / 615865，10 / 666857和10 / 014477)，现有技术没有描述或提示共聚物-1可用于加速创伤愈合过程。
[0194]因此根据本发明的另一个方面提供了一种用于诱导或加速皮肤创伤或损伤的愈合过程的方法，所述方法包括给皮肤创伤或损伤施用治疗有效量的共聚物-1，优选浓度范围为I到500μ g / ml。因此根据本发明的该方面用于实施该方法的药物组合物包括，作为活性成分的，治疗有效量的共聚物-1和药学可接受的载体。
[0195]本发明的治疗/药学活性成分可以以其本身，或者与合适的载体和/或赋形剂混合成药物组合物施用给创伤。适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的能获得预期治疗效果的活性成分的那些组合物。
[0196]这里所用的“药物组合物”指本文所述的一种或多种活性成分，蛋白质，化学品，核酸或细胞，或其生理学可接受的盐或药物前体，与其它化学组分例如传统药物，生理学合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是便于将化合物或细胞给予生物体。本发明的药物组合物可以用本领域公知的方法制备，例如通过传统的混合，溶解，制粒，包糖衣，粉碎，乳化，制成胶囊，包埋或冻干过程制备。[0197]在下文中，短语“生理学合适的载体”和“药学可接受的载体”可互换使用，均指不会对生物体引起显著刺激以及不会破坏给药的结合物(conjugate)的生物活性和性质的载体或稀释剂。
[0198]本文中术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步方便所述活性成分的加工和给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙，磷酸钙，不同的糖和不同类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油和聚乙二醇。
[0199]活性成分的配制和给药技术可见“Remington，s PharmaceuticalSciences, ”Mack Publishing C0.，Eas ton, PA 的最后一版，在此引入作为参考。 [0200]尽管活性成分可经不同的途径给药，如前所述，为本发明的目的，局部给药方式是优选的，助以局部载体。局部载体通常适用于活性成分的局部给药，包括本领域公知的任何这种材料。为将所述组合物制成所需形式可选择局部载体，例如流体或非流体载体，洗剂，霜剂，糊剂，凝胶，粉末，软膏剂，溶剂，流体稀释剂，滴剂等，并且可以包括天然存在的或合成来源的物质。明显所选的载体必须不能对局部制剂的活性试剂或其它成分产生不良影响，对于局部制剂中的所有成分应是稳定的。可用于本文的合适的局部载体的实例包括水，酒精和其它无毒的有机溶剂，甘油，矿物油，硅氧烷，凡士林，羊毛脂，脂肪酸，植物油，对羟基苯甲酸酯，蜡等。本文中优选制剂是无色，无味的软膏，流体，洗液，霜和凝胶。
[0201]软膏(ointment)是半固体制剂，典型地是以矿脂或其它石油衍生物为基质。本领域技术人员知道，待使用的特定的软膏基质能够提供最佳的活性成分递送，优选能够提供其它需要的特性以及例如软化作用等。与其它载体或媒介物一样，软膏基质应是惰性的，稳定的，无刺激性的不致敏的。如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th Ed.(Easton, Pa.:Mack Publishing C0., 1995)的 1399-1404 页中指出的，软膏基质可分为四类:油质基质；可乳化基质；乳液基质；和水溶性基质。油质软膏基质包括，例如植物油，获自动物的脂肪，以及从石油获得的半固体碳氢化合物。可乳化软膏基质，也称为可吸收软膏基质，含少量或不含水，包括，例如羟基硬脂酸甘油硫酸酯，无水羊毛脂和亲水矿脂(petrolatum) 0乳液软膏基质是油包水(W / 0)或水包油(O / W)乳液，包括，例如十六烷醇，单硬脂酸甘油酯，羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏基质是用不同分子量的聚乙二醇制备的；此外，进一步的信息参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy。
[0202]洗液是用于皮肤表面并且不用摩擦的制剂，通常是流体或半流体制剂，其中固体颗粒，包括活性试剂，存在于水或酒精基质中。洗液通常是固体悬液，可含有水包油类型的流体油状乳液。洗液是本文中优选用于治疗身体大面积的制剂，这是由于更具流动性的组合物容易施用。通常洗液中的不溶物质必需磨碎。洗液典型地包括悬浮试剂以更好地分散，以及用于使所述活性试剂局部化和保持与皮肤接触的化合物，例如甲基纤维素，羧甲基纤维素钠等。
[0203]含有选定的活性成分的霜剂(creams)，如本领域公知的，是粘性流体或半固体的乳液，是水包油或油包水的。霜剂基质是可水洗的，含有油相，乳化剂和水相。油相，有时也称为“内部”相，通常包括矿脂和脂肪醇例如十六烷醇或十八烷醇；水相通常，但不是必需的，体积超过油相，通常含有湿润剂。霜剂中的乳化剂，在Remington，上文中有解释，通常是非离子的，阴离子的，阳离子的或两性的表面活性剂。
[0204]凝胶制剂优选应用于头皮。在局部活性成分制剂领域工作的技术人员知道，凝胶是半固体，悬液类型的系统。单相凝胶含有基本上均匀分布于载体流体中的有机大分子，典型地是水性的，但是优选还含有酒精以及任选的，油。
[0205]核酸载体包括但不限于脂质体，包括靶定的脂质体，核酸络合剂，病毒包被等。但是也可以使用裸露核酸转化。
[0206]本发明的局部制剂中可以包含本领域技术人员公知的各种添加剂。例如，可以用溶剂溶解某些活性成分物质。其它任选的添加剂包括皮肤渗透增强剂，遮光剂，抗氧化剂，胶凝剂，增稠剂，和稳定剂等。
[0207]如上所述的，根据本发明，用于治疗创伤的局部制剂可以含有传统用于治疗这种创伤的其它药学活性试剂或成分。包括免疫抑制剂，例如环孢霉素，抗代谢物，例如氨甲喋呤，皮质类固醇，维生素D和维生素D类似物，维生素A或其类似物，例如依曲替酯(etretinate),焦油，煤焦油,抗痒和促角质化(keratoplastic)试剂,例如杜松油，角质层分离试剂，例如水杨酸，软化剂，润滑剂，防腐剂和消毒剂，例如杀菌剂蒽三酚(也称为蒽啉)，光敏剂，例如补骨脂素和甲氧补骨脂素和UV辐射。还可以加入其它试剂，例如抗微生物试剂，抗真菌试剂，抗生素和抗炎性试剂。还可以同时进行氧处理(高氧压)。
[0208]本发明的局部组合物还可以用传统的皮肤贴片或用品递送到皮肤上，其中所述活性成分组合物包含于层状结构中，其中层状结构作为药物递送装置固定于皮肤上。在这样一种结构中，所述活性成分组合物含于一层，或“储库(reservoir) ”中，其上面是表面垫层(upper backing layer)。所述层状结构可含有单个储库，或者它可以含有多个储库。在一个实施方案中，所述储库含有聚合物基质的药学可接受的接触粘附物质，以在活性成分递送期间将该系统固定于皮肤上。合适的皮肤接触粘附物质的实例包括但不限于聚乙烯，聚硅氧烷，聚异丁烯，聚丙烯酸酯和聚氨酯等。特定的聚合物胶粘剂的选择取决于特定的活性成分，媒介物等，也就是，所述胶粘剂必须与含有活性成分的组合物中的所有组分是相容的。另外，含有活性成分的储库和皮肤接触胶粘剂应当是独立的和不同的层，胶粘剂在储库之下，在这种情况下，储库可以是如上所述的聚合物基质，或者可以是液体或水凝胶储库，或者可以是其它一些形式。`
[0209]这些层状物中的垫层是作为该装置的表面层，作为层状结构的主要结构元件，并给予该装置以相当多的弹性。选择作为垫层的材料应当是对所述活性成分和含有所述活性成分的组合物中的任何其它组分都基本不能渗透的，从而防止任何组分通过该装置的表面层丧失。所述垫层可以是闭合的或是不闭合的，这取决于是否希望皮肤在活性成分递送过程中水化。垫层优选由优选柔韧的弹性材料的薄片或膜组成。适用于垫层的聚合物的实例包括聚乙纟布，聚丙纟布和聚酷。
[0210]在储存过程中和使用前，所述层状结构还包括释放衬垫。立即使用前从所述装置上除去该层以使其基底面，或者是活性成分储库或者是独立的接触粘附层暴露，使得所述系统能够固定于皮肤上。所述释放衬垫应当用活性成分/载体不可透过的材料制成。
[0211]该装置可以用本领域公知的传统技术制造，例如将胶粘剂，活性成分和载体的流体混合物浇模于垫层上，然后使释放衬垫成层。类似地，可以将胶粘剂混合物浇模于释放衬垫上，然后使垫层成层。或者，可以在没有活性成分或赋形剂的情况下制备活性成分储库，然后通过“浸吸(soaking) ”在活性成分/载体混合物中来载入。
[0212]与本发明中的局部制剂一样，包含于这些层状系统的活性成分储库中的活性成分组合物可以含有多种组分。在一些情况下，所述活性成分可以以“纯(neat) ”的方式递送，即不含其它的流体。但是在大部分情况下，所述活性成分溶解，分散或悬浮于合适的药学可接受的载体，典型地是溶剂或凝胶中。其它可能含有的组分包括防腐剂，稳定剂和表面活性剂等。
[0213]本文所述的药物组合物还可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种糖，淀粉，纤维素衍生物，明胶和聚合物
例如聚乙二醇。
[0214]剂量取决于病痛的类型，严重程度和表现形式，以及患者对于所使用的活性成分和剂型的反应，特定缀合物的效力和所使用的给药余途径。所属领域普通技术人员能容易地确定最佳的剂量，剂量给药方法和重复率。正确的配方，给药途径和剂量可以由各个医师根据患者情况选择(参见例如，Fingl, et al., 1975, in “The Pharmacological Basis ofTherapeutics，，，Ch.1p.1)。
[0215]因此，依赖于要治疗的状况的严重程度和反应性，剂量可以是单次或是重复给药，治疗持续几天到几周，或者直至治愈或皮肤创伤减小。
[0216]在本发明的某些方面中使用体内或离体(细胞)基因治疗技术，其涉及细胞转化和基因敲入类型的转化。本文所用的基因治疗指将感兴趣的遗传物质(例如DNA或RNA)转入宿主中以治疗或防止遗传性的或获得性的疾病或状况或表型。所述感兴趣的遗传物质编码希望在体内产生的产品(例如蛋白质，多肽，肽，功能性RNA，反义RNA)。例如，所述感兴趣的遗传物质可以编码具有治疗价值的激素，受体，酶，多肽或肽。其综述一般可参见“GeneTherapy，，(Advanced in Pharmacology40, Academic Press, 1997)原文。
[0217]基因治疗的两种基本方法是(I)离体；和(ii)体内基因治疗。在离体基因治疗中从患者中取出细胞或者从另一种来源衍生出细胞，培养并在体外治疗。通常，将功能性的替换基因通过合适的基因递送载体/方法(转染，转导，同源重组等)和，如果需要时，表达系统引入细胞，然后在培养物中使修饰的细胞扩增并使其返回宿主/患者中。这些遗传上重新植入的细胞已显示在原位表达转染的遗传物质。
[0218]在体内基因治疗中，靶细胞不从受试者中取出，而是将要转移的遗传物质原位，也就是在接受体中引入接受生物体的细胞中。在另一个实施方案中，如果宿主基因是有缺陷的，所述基因在原位被修复(Culver, 1998.(Abstract)Antisense DNA&RNA basedtherapeutics, Februaryl998, Coronado, CA)。这些遗传上改变的细胞已显示在原位表达转染的遗传物质。
[0219]所述基因表达载体能够将异源核酸递送/转移到宿主细胞中。所述表达载体可以包括能以细胞选择性的方式控制所述核酸的靶定，表达和转录的元件，如本领域公知的。应当注意到通常所述基因的5’UTR和/或3’UTR可被表达载体的5’UTR和/或3’UTR取代。因此，本文所述的表达载体可以，如果需要的话，不包括要转移的实际基因的5’ UTR和/或3’ UTR，只包括特定的氨基酸编码区域。
[0220]所述表达载体可以包括用于控制所述异源物质的转录的启动子，所述启动子可以是组成型的或是诱导型的以允许选择性转录。任选地可以包括获得必要的转录水平所需的增强子。增强子通常是任何不翻译的DNA序列，临近编码序列起作用(以顺式)以改变启动子所支配的基本转录水平。所述表达载体还可以含有如下文所述的选择基因。[0221]载体可以以本领域公知的多种方法中的任何一种引入细胞或组织。这些方法在 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringsHarborLaboratory, New Yorkl989,1992), Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley and Sons, Baltimore, Marylandl989), Chang et al.Somatic GeneTherapy, CRC Press,Ann Arbor, MI1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, AnnArbor MI(995), Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths, Boston MA1988)和 Gilboa et al.(Biotechniques4(6):504-512,1986)中有描述，包括，例如稳定或暂时性的转染，脂质体转染(Iipofection)，电穿孔和用重组病毒载体感染。此外，参见美国专利4，866，042中的涉及中枢神经系统的载体以及美国专利5，464，764和5，487，992中的正负选择方法。
[0222]通过感染引入核酸与其它所列出的方法相比具有几个优点。由于感染特性因而能够获得更高的效率。而且病毒是非常特化的，典型地可以感染并在特定的细胞类型中增殖。因而，它们天然的特异性可以用于使载体在体内或在组织中或细胞的混合培养物中靶定特异的细胞类型。病毒载体还可以用特异的受体或配体修饰以通过受体介导的事件改变靶的特异性。
[0223]用于引入和表达重组序列的DNA病毒载体的特定实例是腺病毒衍生的载体Adenop53TK。该载体表达疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因，以提供正向或负向选择，和所期望的重组序列的表达盒。该载体可用于感染具有腺病毒受体的细胞，包括大部分上皮来源和其它来源的组织。该载体和其它具有类似的所期望的功能的载体可用于处理混合群体的细胞，包括，例如细胞的体外或离体培养物，组织或人受试者。
[0224]还可以包含限制在特定细胞类型中表达的特征。这种特征包括，例如，对所希望的细胞类型特异的启动子和调控元件。
[0225]此外，重组病毒载体可用于所希望的核酸的体内表达，这是由于它们可提供例如横向感染和靶定特异性的优点。横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，是单个感染细胞产生许多子代病毒颗粒，释放出并感染相邻的细胞的过程。结果是大片区域迅速被感染，其中大部分最初并没有被原始`的病毒颗粒感染。这与垂直类型的感染相反，其中感染试剂只通过下一代子代传播。也可以制造不能横向传播的病毒载体。如果目的是将特定基因引入有限数目的靶细胞的话，该特征可能是有用的。
[0226]如上所述，病毒是非常特化的感染试剂，在许多情况下可以避开宿主的防御机制。典型地，病毒感染并在特定类型的细胞中增殖。病毒载体的靶定特异性是利用了它的天然的特异性，特异性靶定预定细胞类型，因而将重组基因引入感染细胞中。本发明的方法和组合物中使用的载体取决于所希望靶定的细胞类型，本领域技术人员均知道。
[0227]可以构建逆转录病毒载体作为感染颗粒或只是进行起始一轮的感染。在第一种情况中，对病毒基因组进行修饰使其保持所有必需基因，调控序列和包装信号以合成新的病毒蛋白和RNA。这些分子一旦合成，宿主细胞会将所述RNA包装成新的病毒颗粒，其能进行下一轮的感染。还可以通过基因工程使所述载体的基因组编码和表达所希望的重组基因。在无感染性的病毒载体中，载体基因组通常进行突变以破坏将RNA包装成病毒颗粒所必需的病毒包装信号。没有这样的信号，任何形成的颗粒都不含有基因组，因此不能进行下一轮感染。载体的特定类型取决于预期的应用。实际的载体也是已知的，在本领域中可容易获得，或者可由本领域技术人员通过熟知的方法构建。
[0228]重组载体可以几种方式给药。如果使用病毒载体，例如，给药过程可以利用它们的靶特异性，因而不用在疾病部位局部给药。但是，局部给药可以更快更有效地治疗。
[0229]包括敲入程序所用的同源重组在内的体内和离体细胞转化过程如下述文献中所
述，例如，
[0230]
【权利要求】
1.一种用于诱导或加速损伤的皮肤或皮肤创伤的愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括，作为活性成分的胰岛素分泌细胞，以及设计用于所述药物组合物局部施用的药学可接受的载体。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述创伤选自溃疡，糖尿病相关的创伤，烧伤，晒伤，老化皮肤创伤，角膜溃烂创伤，炎性胃肠道疾病创伤，肠炎性疾病创伤，克罗恩氏病创伤，溃疡性结肠炎，痔疮，大疱性表面松解症创伤，皮肤起疱创伤，牛皮癣创伤，动物皮肤创伤，动物糖尿病创伤，视网膜病创伤，口腔创伤(粘膜炎)，阴道粘膜炎创伤，牙龈病创伤，裂伤，手术切口创伤和手术后粘连创伤。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述溃疡选自糖尿病性溃疡，褥疮，静脉溃疡，胃溃疡和HIV相关溃疡。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述细胞被转化以产生和分泌胰岛素。
5.权利要求1的药物组合物，其中所述细胞被重组roxi基因转化，从而所述细胞产生和分泌天然胰岛素。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述细胞被顺式作用元件序列转化，该序列整合到所述细胞的内源胰岛素基因的上游，从而所述细胞产生和分泌天然胰岛素。
7.权利要求1的药物组合物，其中所述细胞被重组胰岛素基因转化，从而所述细胞产生和分泌重组胰岛素。
8.权利要求1的药 物组合物，其中所述胰岛素分泌细胞能够形成分泌颗粒。
9.权利要求1的药物组合物，其中所述胰岛素分泌细胞是内分泌细胞。
10.权利要求1的药物组合物，其中所述胰岛素分泌细胞是人源的。
【文档编号】A61KGK103751211SQ201310452225
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2004年7月15日 优先权日:2003年7月15日
【发明者】T.藤兰鲍姆, S.森普森, T.库罗基, A.阿尔特, S.沈 申请人:巴尔-伊兰大学