本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0041]本发明提供的一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，其制备方法包括以下步骤:
[0042]Sla、脱细胞羊膜的获取；
[0043]于无菌洁净室内，将新鲜的人胎盘羊膜用无菌生理盐水洗净洗去其表面的血迹，去除血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用无菌PBS缓冲液冲洗干净，然后用2.0g/L胰酶37°C恒温水浴酶解消化30分钟，去除羊膜表面的上皮细胞，用PBS充分冲洗干净，将羊膜平铺在无菌的玻璃平板上，玻璃平板下面配有灯光便于观察，用细胞刮子刮除残留的上皮细胞、海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液等，PBS清洗后，将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的温度下密封保存待用。
[0044]S2a、脂肪干细胞的获取；
[0045]从人体腹部采集脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成I?2mm3大小组织块，用PH值为7.2_7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，在生物安全柜中，将脂肪组织块分装在50ml离心管中，以1000-1500r/min的转速离心5?lOmin，用移液管吸取离心后的中间层脂肪组织，加入等体积无菌生理盐水或PBS清洗，再以1000-2000rpm转速离心lOmin，吸取上层脂肪置于新离心管中，加入质量百分浓度为0.03 % -0.06 %的I型胶原酶中，混匀盖好盖，于37 °C培养箱中震荡消化20min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，然后将细胞悬液经过75μπι孔径的细胞过滤器过滤，去除未消化组织，收集滤液，即得到单细胞悬液，以1000-2000rpm离心1min，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS重新洗涤细胞一次，再次离心，沉淀即为原代脂肪干细胞。
[0046]S3a、对原代脂肪干细胞进行传代培养，获取第三代脂肪干细胞；
[0047]取步骤S2a中获取的原代脂肪干细胞，以5X 14个/cm2的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，在37°C、5 %的CO2培养箱中，每隔2-3天更换新鲜的无血清培养基，待细胞融合度达到70 %-80 %后，采用I X TrypLESeIect(胰蛋白酶无酸红，来源于美国Invitrogen公司)于37°C消化3分钟，加入等体积的PBS稀释，反复吹打，将细胞清洗干净，然后将清洗后的细胞移入50mL离心管中，以1000-2000rpm转速离心5min，弃上清液，将细胞重悬于新的无血清培养基，按照1:4的传代比例，传代接种于新培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增培养第一代脂肪干细胞，扩增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70 % -80 %后，如此重复上述的细胞消化传代过程，待第三代细胞融合度达到70 %-80 %后，停止传代培养，用于羊膜贴片的制作。
[0048]S4a、羊膜贴片的制备；
[0049]S41a、脱细胞羊膜的杀菌处理；
[0050]取出步骤Sla获得的脱细胞羊膜在无菌净化间装入无菌铝箔膜包装袋中，抽真空封口，钴60辐照灭菌4小时，辐照剂量4kGy。
[0051 ] S42a、接种第三代脂肪干细胞；
[0052]将步骤S41a中获取的脱细胞羊膜裁剪成略大于培养皿底部面积，然后将其平铺于玻璃培养皿底部，多余部分内折，使脱细胞羊膜的接种面处于平整状态，并赶出脱细胞羊膜底部的气泡；
[0053]取步骤S3a中获得的第三代脂肪干细胞，调整其密度为3X 104/cm2接种于平铺杀菌后的脱细胞羊膜上进行培养至细胞贴壁，再添加含有10 %?20 %血清的DMEM或DF12培养基进行培养，待细胞长满脱细胞羊膜后待移植应用即可。
[0054]为进一步验证本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片具有显著的有益效果，设置以下实验进行验证。
[0055]—、构建SD大鼠皮肤深Π度烫伤模型的构建
[0056]实验组:采用本发明实施例1制备的羊膜贴片进行治疗的大鼠；
[0057]对照组:采用现有技术中的组织工程化皮肤贴片进行治疗的大鼠；
[0058]实验组和对照组大鼠均来源于江苏大学动物实验中心，其体态及健康指标基本相同。
[0059]分别对实验组和对照组大鼠进行以下操作:
[0060]将体重200g的大鼠背部应用8%的Na2S进行脱毛处理，次日采用烫伤装置80°C损伤8s，制造一个直径为1.5cm的圆形创面。首先对创面进行常规清创处理，去除污物及脱落上皮，去除水泡并消毒;其次，将贴片根据损伤部位面积和形状进行修剪，将贴片与创面贴紧并覆盖整个创面，贴片大于创缘约2?3cm。
[0061]3天后打开实验组大鼠创面上的纱布，观察创面，发现创面渗出物较少，更换新的贴片，再隔3d，打开纱布，发现损伤部位开始出现上皮化，无感染，再次更换新的羊膜贴片，直到第9天，打开纱布，创面基本愈合，愈合后创面随访，愈合创面瘢痕增生少，色素沉着少。
[0062]而3天后打开对照组大鼠创面上的纱布，创面渗出物相对较多，更换新的贴片，再隔3天，打开纱布，发现渗出物减少;再次更换新的贴片，直至第9天，打开纱布，创面开始出现局部上皮化，再次更换新的贴片，直至第15天，创面基本愈合，愈合创面色素沉着，显褐色。
[0063]二、治疗病例
[0064]王某某，男，38岁，深11度烧伤，胳膊部分面积为130cm2左右，该治疗经患者王某某签字同意。
[0065]治疗时，局部创面常规清创处理，去除污物及脱落上皮，去除水泡并消毒。将本发明制成的羊膜贴片根据损伤部位面积和形状进行修剪，然后将贴片与创面贴紧并覆盖整个创面，贴片大于创缘约2?3(^。5(1后打开纱布，观察创面，发现创面渗出较少，更换新的贴片，换药时，疼痛明显轻于未贴羊膜的烧伤病人。再隔3d，打开纱布，发现损伤部位开始出现上皮化，无感染，再次更换新的羊膜贴片，直到第1d，打开纱布，创面基本愈合，愈合后创面随访，愈合创面瘢痕增生少，色素沉着少。
[0066]以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的【具体实施方式】，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1.一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞； 将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜于培养基中培养至所述脂肪干细胞完全覆盖所述脱细胞羊膜。2.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，在所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜之前，还包括对脱细胞羊膜进行杀菌的步骤: 取脱细胞羊膜于无菌环境下装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，钴60辐照灭菌3?5小时，辐照剂量为3?5kGy。3.根据权利要求2所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，将所述所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜时，所述脱细胞羊膜处于平整状态。4.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的接种密度为(0.5?5) X 104/cm2。5.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述培养基中含有质量分数为10%?20%血清。6.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脱细胞羊膜的获取过程包括以下步骤: 取胎盘羊膜，去除血块和绒毛膜，用1.0-3.0g/L胰酶于恒温水浴中酶解消化去除羊膜表面的上皮细胞，清洗后，去除羊膜的海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液，再次清洗，即获得所述脱细胞羊膜。7.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程包括以下步骤: 取脂肪组织，去除血管和纤维，剪碎，洗涤后，离心，吸取中间层脂肪组织，清洗后再次离心，取上层脂肪组织于质量分数为0.03%?0.06%的I型胶原酶中消化15?30分钟，加入PBS或生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，经细胞过滤器过滤，收集滤液，并将滤液以1000?2000转/分的转速离心，获得细胞沉淀，洗涤细胞沉淀后对其再次离心，收集沉淀，即原代脂肪干细胞。8.根据权利要求7所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程，还包括对所述原代脂肪干细胞进行传代培养的过程，具体步骤为: 将所述脂肪干细胞以(3?8) X 14个/cm2的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，每隔2?3天更换新的培养基;待细胞融合度达到70?80%后，消化、洗涤并稀释细胞，然后离心弃上清液，用所述无血清培养基重悬细胞后，按1: (3?6)进行传代培养，每隔2?3天换液，待细胞融合度达到70?80 %后，重复细胞消化传代的步骤，收集第2?4代脂肪干细胞。9.一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片制备方法所获得的。
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，包括以下步骤：分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜上于培养基中培养至细胞完全覆盖所述脱细胞羊膜。通过利用脂肪干细胞的分化潜能，以及脱细胞羊膜对脂肪干细胞的刺激诱导作用，促使脂肪干细胞分化成上皮细胞；而脱细胞羊膜的抗原性较低，又能够为细胞提供充足的营养物质，以保持细胞活性及细胞正常的生长，从而使得脂肪干细胞的存活率及转化率较高，提高皮肤修复效果，达到快速修复皮肤创伤的目的。
【IPC分类】A61L27/38, A61L27/60, A61L27/36
【公开号】CN105688287
【申请号】CN201610052286
【发明人】曾宪卓, 张哲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月26日