后的组织样品室温12000rpm，15min离心。
[0073] (3)准备新的无 RNA酶的I. 5mL EP管，向离心管中加入200 μ L氯仿，离心结束后 弃沉淀将离心后的上清液转移至事先加好氯仿的离心管中，做好相应标记，轻轻反复颠倒 数次，静置 5min，4°C，12000g，15min 离心。
[0074] (4)离心完成后吸取最上层水相小心转移至新无 RNA酶离心管中，注意不要吸到 中间界面，加入500 μ L异丙醇，充分混匀，室温静置IOmin后4°C，12000g，15min离心。
[0075] (5)离心完成后，可以观察到管底有白色RNA沉淀，用无 RNA酶的枪头尽量吸走上 清，加入ImL 75%乙醇，轻轻地颠倒使沉淀悬浮，4°C，8000g，5min离心。
[0076] (6)离心完成后弃上清，如果残留液体太多，可以将EP管放入离心机中空甩两 min，吸掉残余液体后放入通风橱中使乙醇风干。
[0077] (7)根据离心后的RNA沉淀量加入适量体积DEPC水，将EP管放入55°C水浴锅中 5min，使RNA快速溶解。
[0078] (8)取1 μ L RNA测定RNA浓度及纯度，260/280比值介于L 8-2. 0之间表明RNA 纯度良好，在EP管上标注清楚浓度及纯度于-80°C保存备用。
[0079] 2.免疫印迹
[0080] 免疫印迹基本原理为抗原抗体反应。蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到固 相支持物上（本实验采用硝酸纤维素膜），与特异的一抗反应，再与荧光二抗反应显色，可 以得到特异蛋白分子的免疫印迹图。该方法具有从混杂抗原中检测出特定的抗原的特点。
[0081] 将待测蛋白样品加入到反应缓冲液（50mMTris-HCl，ph7.4,50mMNaCl)电泳及免 疫反应，流程如下：A、制胶（8%浓缩胶，10%~12%分离胶）；B、蛋白样品加入上样缓冲液， 煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压：D、转膜，200V，lh~2h ;E、5%脱脂 牛奶，封闭30min ;F、一抗反应，4°C，过夜；G、PBS洗膜三次；H、二抗反应，避光孵育Ih ;1、 PBS 洗膜三次；J、Odyssey 系统（LI-COR Biosciences)扫描。
[0082] 实施例5MLN4924可以有效抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化病变
[0083] 本实施例中，对C57BL/6小鼠气管滴注博来霉素进行肺纤维化疾病模型造模。在 滴注后第二天进行每天一次腹腔注射MLN4924的干预治疗，第28天处死小鼠，收集肺组织， 进行苏木精-伊红（HE)和Masson三色染色（如附图1A)，观察肺部形态改变，进行病理评 分（如附图1B)，取左肺经酸解法检测肺组织羟脯氨酸（HYP)含量（如附图1C)，并取肺组 织研磨利用荧光实时定量PCR检测胶原表达量。实验结果表明，与对照组相比，用MLN4924 进行干预可以明显改善博来霉素引起的小鼠肺泡炎、肺纤维化。
[0084] 实施例6小分子抑制剂MLN4924对EMT (上皮间质转化）过程没有显著影响
[0085] 上皮间质转化过程是肺纤维化发生过程中的重要一环。它发生在炎症过程之 后，是成绩纤维细胞的来源之一，在肺组织修复中起重要作用。但是过度的上皮间质转化 过程也意味着肺组织的过度修复并进而引起肺纤维化。用TGFP刺激A549细胞系引起 上皮间质转化过程，再加入小分子抑制剂MLN4924,发现上皮间质转化过程的标志性蛋白 E-cadherin和Vimentin的表达量并无明显变化（如附图2)，证明小分子抑制剂MLN4924 对上皮间质转化过程没有显著影响。这一结果也提示小分子抑制剂MLN4924可能是在肺纤 维化发生的早期，即炎症阶段发挥功能。
[0086] 实施例7MLN4924抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化早期急性肺损伤
[0087] 本实施例中，利用气管滴注LPS建立小鼠急性肺损伤模型，滴注LPS后进行每日一 次腹腔注射MN4924干预治疗，在不同时间点对实验小鼠放血处死，收集标本，进行肺部苏 木精-伊红（HE)染色（如附图3A)，检测肺部湿干比（W/D)(如附图3B)，同时行支气管肺 泡灌洗，检测肺泡灌洗液（BALF)中总蛋白含量（如附图3C)，肺部细胞因子表达量（如附图 3D，E，F)，有核细胞细胞总数，中性粒细胞数目，巨噬细胞数目（如附图3G，H，I)。用LPS (脂 多糖）刺激巨噬细胞后再加入MLN4924,可见细胞中一氧化氮产生量、iNOS及IL-Ιβ、 TNFa、MCP_1等细胞因子和趋化因子的表达量都有明显下降（如附图4)。各项生理指标和 实验结果表明，MLN4924可以有效减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤。
[0088] 实施例8MLN4924不通过诱导中性粒细胞的凋亡来抑制肺纤维化早期的肺部炎症
[0089] 炎症细胞如中性粒细胞的凋亡是缓解炎症的一种方式。提取小鼠的原代中性粒细 胞，加入不同浓度的MLN4924后，用PI和Annexin V双染细胞，然后用流式细胞术检测中性 粒细胞凋亡的比例。结果显示，在MLN4924可以显著发挥抑炎功能的浓度（0.5μΜ)下，并 不会引起中性粒细胞的明显凋亡（如附图5Α)。此外，加入MLN4924未明显影响细胞凋亡的 指示蛋白Mcl-I的表达量（如附图5Β)。这些结果表明，小分子抑制剂MLN4924并不是通过 诱导中性粒细胞的凋亡来抑制肺纤维化早期的炎症过程。
[0090] 实施例9小分子抑制剂MLN4924促进肺泡上皮细胞产生趋化因子
[0091] 用IL-I β刺激Α549细胞系，并加入MLN4924,检测趋化因子IL-8、CXCL5和KC的 表达量变化。结果显示，这三种趋化因子的表达量都受到MLN4924的明显抑制（如附图6)。 趋化因子的重要功能之一就是招募炎症细胞。该结果暗示MLN4924可能是通过抑制肺泡上 皮细胞产生趋化因子招募炎症细胞来达到抑制炎症的效果。
[0092] 实施例10MLN4924抑制小鼠急性肺损伤的分子机制
[0093] NF-κ B和MAPK信号通路是炎症发生过程中的两条重要通路。通过用LPS或 IL-I β刺激Α549和RAW264. 7细胞系激活炎症信号通路后，加入MLN4924,并对细胞样品进 行免疫印迹实验后发现，0. 5 μ M的MLN4924可以显著抑制炎症反应中NF- K B和MAPK信号 通路的激活（如附图7)，由此抑制炎症的发生。这解释了 MLN4924通过抑制早期炎症过程 来抑制博来霉素诱导的肺纤维化的分子机制。
【主权项】
1. 小分子抑制剂MLN4924在制备抑制博来霉素诱导的肺纤维化的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述博来霉素诱导的肺纤维化包括博来霉 素诱导的肺纤维化病变、肺纤维化早期急性肺损伤。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制早期炎症发生来抑制博 来霉素诱导的肺纤维化。4. 小分子抑制剂MLN4924在制备抑制炎症反应中NF- κ B和MAPK信号通路的激活的药 物中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述小分子抑制剂MLN4924在炎症反应中可 抑制上皮细胞中IL-8、CXCL5、KC趋化因子的表达。
【专利摘要】本发明公开了小分子抑制剂MLN4924在制备抑制博来霉素诱导的肺纤维化的药物中的应用。本发明还公开了小分子抑制剂MLN4924在制备抑制博来霉素诱导的肺纤维化早期炎症过程的药物中的应用。本发明还公开了小分子抑制剂MLN4924在制备抑制炎症反应中NF-κB和MAPK信号通路的激活的药物中的应用。
【IPC分类】A61P11/00, A61P29/00, A61K31/519
【公开号】CN105708839
【申请号】CN201410728140
【发明人】王平, 邓琦, 张娇娇
【申请人】华东师范大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年12月3日