一种黑参加工工艺及其在增强免疫力和抗肿瘤领域的应用
【专利摘要】一种黑参加工工艺及其在增强免疫力和抗肿瘤领域的应用，加工工艺包括如下步骤：清洗、发酵、控制水分、加热、阴干。本发明采用西洋参作为原料制备黑参，发酵过程中植物乳杆菌和短乳杆菌产生乳酸、乙酸和酶，可将西洋参所含人参皂苷进行酶解和弱酸水解，同时一部分植物乳杆菌和短乳杆菌留在西洋参内部，加热过程中又有一次加热条件下的水解过程，可将部分人参皂苷转化为人参稀有皂苷。体外细胞学试验和动物学试验表明，用本发明工艺生产得到的黑参具有良好的抗肿瘤效果和增强免疫力的作用。
【专利说明】
一种黑参加工工艺及其在増强免疫力和抗肿瘤领域的应用
技术领域：
[0001] 本发明涉及一种黑参加工工艺及其在增强免疫力和抗肿瘤领域的应用。
【背景技术】：
[0002] 西洋参，拉丁学名Panax quinquefolius，是五加科人参属多年生草木植物，我们 平时又称之为花旗参、洋参、西洋人参、American ginseng等。西洋参原产于加拿大最大的 省魁北克与美国的威斯康辛州，在中国的山东威海市文登区、吉林长白山和北京怀柔与等 地也有种植。通常把加拿大产的叫西洋参，美国产的叫花旗参，从有效成分和功用上讲基本 上没有差别。我国的西洋参种植技术并不落后。1981年山东省威海市文登区张家产镇口子 李村王继振先生和王文水先生率先开始对西洋参种植技术进行探索和研究，经过多次试验 后选中含磷风化改良土壤，不仅通气性能好、杂菌少，而且含有速效氮磷钾，只要补充一定 量的基肥，出参量并不低于森林土。近40年来经过王继振、王文水等有关专家、科研部门和 群众的共同努力，形成了文登西洋参独有的生产经验和独特的地区产品，曾创造出小面积 亩产鲜参1000公斤的高产典型，文登西洋参无论是在品质还是产量均处于全国领先水平。
[0003] 西洋参具有滋阴补气、宁神益智、清热生津和降火消暑的多种功效。古书有"西洋 参性凉而补，凡欲用人参而不受人参之温者皆可用之"的记载，故补而不燥是西洋参的特别 之处。现代科学研究表明，西洋参主要有以下作用：1、强化心肌细胞功能及增强心脏活动能 力；2、兴奋中枢神经，安定身心并缓解疲劳;3、可增强记忆能力，对老人痴呆症有治疗效果； 4、对血压有一定调节作用，可以起到较好的降血压的功效；5、抑制动脉硬化并促进红血球 生长，增加血色素的含量;6、调节胰岛分泌，对糖尿病有治疗效果;7、有调节副肾上腺素分 泌作用，可促进新陈代谢;8、抑制癌肿瘤细胞生长，增加人体免疫功能;9、助消化，对慢性胃 病和消化能力不足有改善作用。
[0004] 正因如此，西洋参的加工制品有很多，大多数都是在鲜西洋参的基础上，进行晒 干、烘干、冻干、切片或打粉等。但是这只是对西洋参物理形态的改变，对其有效成分没有任 何影响。随着西洋参深加工工艺的研发的深入，现在西洋参衍生产品的主要方向有黑参、白 参和红参，黑参相对于白参和红参来说，加工后有更多的人参稀有阜苷生成，此种成分使参 在增强免疫力和抗肿瘤的效果显著提高。西洋参中人参皂苷的含量可以达到人参的2-3倍， 如果西洋参通过合适的加工技术将其加工为人参稀有皂苷含量较高的制品，能大幅度的改 善其药效和应用领域，这将对西洋参产业的发展具有重大的意义。但是现有技术中对于黑 参的加工并没有很好的方法，产量也较低，得到的人参稀有皂苷的含量也不尽如人意。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺点，采用西洋参作为原料制备黑 参，通过对制作工艺的优化，结合使用优化后的培养基进行杆菌培养，制得了一种人参皂苷 非常高的黑参，对于增强免疫力和抗肿瘤领域有非常好的效果，解决了现有技术中存在的 问题。
[0006] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 一种黑参加工工艺，包括如下步骤：
[0008] S1、清洗:将新鲜的西洋参或润透的西洋参干品用水清洗干净后备用；
[0009] S2、发酵:将Sl得到的洗净后的西洋参浸没到接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培 养液中，然后进行恒温厌氧发酵，温度设定为34°c-36°c，发酵时间设定为48h-120h得发酵 西洋参；
[0010] S3、控制水分:将S2得到的发酵西洋参从培养液中取出清洗，然后干燥至含水量为 30%-50% ；
[0011] S4、加热:将步骤S3干燥处理得到的发酵西洋参置于密闭容器中，加热温度控制在 95°C_105°C，并维持lh-10h，然后降至室温；
[0012] S5、阴干:将S4得到的产物进行阴干，即得最终产品。
[0013] 优选的，在S2中所用的培养液，包括以下重量含量的组分：蛋白胨8g-12g/L、葡萄 糖25g-35g/L、乙酸钠4g-6g/L、酵母粉4g-6g/L、梓檬酸二铵lg-3g/L、磷酸氢二钾lg-3g/L、 硫酸镁〇. Ig-〇. 3g/L，其余为水。
[0014] 优选的，在S2中所用的接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培养液制备过程包括如下 步骤：
[0015] 31、配制一级培养基：一级培养基组分含量如下，蛋白胨88-128/1、葡萄糖35 8-45g/L、乙酸钠4g-6g/L、酵母粉4g-6g/L、梓檬酸二铵lg-3g/L、磷酸氢二钾lg-3g/L、硫酸镁 0.1 g-0.3g/L，其余为水;然后蒸汽灭菌；
[0016] S2、接种：随后植物乳杆菌和短乳杆菌进行接种培养，温度34°C_36°C，培养12h- 24h；
[0017] S3、配制培养液:培养液所用培养基的各组分含量如下，蛋白胨8g_12g/L、葡萄糖 25g-35g/L、乙酸钠4g-6g/L、酵母粉4g-6g/L、梓檬酸二铵lg-3g/L、磷酸氢二钾l-3g/L、硫酸 镁0.1-0.3g/L，其余为水;然后蒸汽灭菌，随后把S2得到的种子液按照15-25g/L的接种量进 行接种到培养液，温度34°C -36 °C，培养48h-l 20h。
[0018] 优选的，在S3中，将S2得到的发酵西洋参从培养液中取出，然后用纯化水喷淋洗 涤，随后在鼓风干燥箱内，温度保持在50°C_60°C，干燥至产物的含水量为30%-50%。
[0019] 优选的，在S4中，所用密闭容器为带内部加热装置的不锈钢容器。
[0020] 优选的，在S5中，阴干至产品含水量为8%-12%。
[0021] 上述黑参加工工艺制得的黑参在增强免疫力和抗肿瘤领域的应用。
[0022] 与现有技术相比，本发明的优点是:采用西洋参作为原料制备黑参，发酵过程中植 物乳杆菌和短乳杆菌产生乳酸、乙酸和酶，可将西洋参所含人参皂苷进行酶解和弱酸水解， 同时一部分植物乳杆菌和短乳杆菌留在西洋参内部，加热过程中又有一次加热条件下的水 解过程，可将部分人参皂苷转化为人参稀有皂苷。体外细胞学试验和动物学试验表明，用本 发明工艺生产得到的黑参具有良好的抗肿瘤效果和增强免疫力的作用;本工艺采用标准化 操作流程，便于质量控制，得到的西洋黑参有望成为保健食品和药品的重要生产原料，本发 明通过对制作工艺的优化，结合使用优化后的培养基进行杆菌培养，制得了一种人参稀有 皂苷非常高的黑参，对于增强免疫力和抗肿瘤有非常好的效果。
【附图说明】：
[0023]图1为西洋参提取物的HPLC检测结果。
[0024]图2为1号产品提取物的HPLC检测结果。
【具体实施方式】：
[0025]为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过【具体实施方式】，对本发明进行详细阐 述。
[0026] 一种黑参加工工艺，包括如下步骤：
[0027] S1、清洗:将新鲜的西洋参或润透的西洋参干品用水清洗干净后备用；
[0028] S2、发酵:将Sl得到的洗净后的西洋参浸没到接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培 养液中，然后进行恒温厌氧发酵，温度设定为34°C_36°C，发酵时间设定为48h-120h得发酵 西洋参；
[0029] S3、控制水分:将S2得到的发酵西洋参从培养液中取出清洗，然后干燥至含水量为 30%-50% ；
[0030] S4、加热:将步骤S3干燥处理得到的发酵西洋参置于密闭容器中，加热温度控制在 95°C_105°C，并维持lh-10h，然后降至室温；
[0031] S5、阴干:将S4得到的产物进行阴干，即得最终产品。
[0032]在S2中所用的培养液，包括以下重量含量的组分：蛋白胨8g-l 2g/L、葡萄糖25g-35g/L、乙酸钠4g-6g/L、酵母粉4g-6g/L、梓檬酸二铵lg-3g/L、磷酸氢二钾lg-3g/L、硫酸镁 0.1g-0.3g/L，其余为水。
[0033]在S2中所用的接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培养液制备过程包括如下步骤： [0034] 31、配制一级培养基：一级培养基组分含量如下，蛋白胨88-128/1、葡萄糖358-45g/L、乙酸钠4g-6g/L、酵母粉4g-6g/L、梓檬酸二铵lg-3g/L、磷酸氢二钾lg-3g/L、硫酸镁 0.1 g-0.3g/L，其余为水;然后蒸汽灭菌；
[0035] S2、接种：随后植物乳杆菌和短乳杆菌进行接种培养，温度34°C_36°C，培养12h-24h；
[0036] S3、配制发酵培养液:培养液所用培养基的各组分含量如下，蛋白胨8_12g/L、葡萄 糖25-35g/L、乙酸钠4-6g/L、酵母粉4-6g/L、柠檬酸二铵l-3g/L、磷酸氢二钾l-3g/L、硫酸镁 0.1-0.3g/L，其余为水;然后蒸汽灭菌，随后把S2得到的种子液按照15-25g/L的接种量进行 接种到培养液，温度34°C -36 °C，培养48h-l 20h。
[0037] 在S3中，将S2得到的产物从培养液中取出，然后用纯化水喷淋洗涤，随后在鼓风干 燥箱内，温度保持在50°C_60°C，干燥至产物的含水量为30%-50%。
[0038]在S4中，所用密闭容器为带内部加热装置的不锈钢容器。
[0039] 在S5中，阴干至产品含水量为8%_12%。
[0040]上述黑参加工工艺制得的黑参在增强免疫力和抗肿瘤领域的应用。
[0041 ] 实施例1:
[0042] 一种黑参加工工艺，包括如下步骤：
[0043] S1、清洗:将新鲜的西洋参或润透的西洋参干品用水清洗干净后备用；
[0044] S2、发酵:将SI得到的洗净后的西洋参浸没到接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培 养液中，然后进行恒温厌氧发酵，温度设定为35°C，发酵时间设定为80h得发酵西洋参;所述 培养液的制备过程包括如下步骤：
[0045] 1、配制一级培养基：一级培养基组分含量如下，蛋白胨10g/L、葡萄糖40g/L、乙酸 钠5g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L，其余为水；
[0046] 2、接种:蒸汽灭菌，随后植物乳杆菌和短乳杆菌分别按照20g/L的接种量进行接种 培养，温度34°C，培养24h;
[0047] 3、配制发酵培养液:培养液所用培养基的各组分含量如下，蛋白胨10g/L、葡萄糖 30g/L、乙酸钠 5g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L，其余为 水，然后蒸汽灭菌，随后把S2得到的种子进行移种，温度35°C，培养80h。
[0048] S3、控制水分:将S2得到发酵西洋参从培养液中取出清洗，然后干燥至含水量为 40%；
[0049] S4、加热：将步骤S3干燥处理得到的发酵西洋参置于带内部加热装置的不锈钢容 器中，温度控制在105°C，并维持lh，然后降至室温；
[0050] S5、阴干:将S4得到的产物进行阴干至产品含水量为10%，即得1号产品。
[0051 ] 实施例2:
[0052] 一种黑参加工工艺，包括如下步骤：
[0053] S1、清洗:将新鲜的西洋参或润透的西洋参干品用水清洗干净后备用；
[0054] S2、发酵:将Sl得到的洗净后的西洋参浸没到接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培 养液中，然后进行恒温厌氧发酵，温度设定为34°C，发酵时间设定为120h;所述培养液的制 备过程包括如下步骤：
[0055] 1、配制一级培养基:一级培养基组分含量如下，蛋白胨8g/L、葡萄糖35g/L、乙酸钠 4g/L、酵母粉4g/L、柠檬酸二铵lg/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸镁0.1g/L，其余为水；
[0056] 2、接种:蒸汽灭菌，随后植物乳杆菌和短乳杆菌分别按照25g/L的接种量进行接种 培养，温度35°C，培养18h;
[0057] 3、配制培养液:培养液所用培养基的各组分含量如下，蛋白胨8g/L、葡萄糖25g/L、 乙酸钠4g/L、酵母粉4g/L、柠檬酸二铵lg/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸镁0.1g/L，然后蒸汽灭 菌，随后把S2得到的种子进行移种，温度34°C，培养120h。
[0058] S3、控制水分:将S2得到的发酵西洋参从培养液中取出清洗，然后干燥至含水量为 30% ；
[0059] S4、加热：将步骤S3干燥处理得到的发酵西洋参置于带内部加热装置的不锈钢容 器中，温度控制在100°c，并维持4h，然后降至室温；
[0060] S5、阴干:将S4得到的产物进行阴干至产品含水量为8%，即得2号产品。
[0061 ] 实施例3:
[0062] 一种黑参加工工艺，包括如下步骤：
[0063] S1、清洗:将新鲜的西洋参或润透的西洋参干品用水清洗干净后备用；
[0064] S2、发酵:将Sl得到的产物浸没到接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培养液中，然后 进行恒温厌氧发酵，温度设定为36°C，发酵时间设定为48h;所述培养液的制备过程包括如 下步骤：
[0065] 1、配制一级培养基：一级培养基组分含量如下，蛋白胨12g/L、葡萄糖45g/L、乙酸 钠6g/L、酵母粉6g/L、柠檬酸二铵3g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.3g/L;
[0066] 2、接种:蒸汽灭菌，随后植物乳杆菌和短乳杆菌分别按照15g/L的接种量进行接种 培养，温度36°C，培养12h;
[0067] 3、配制培养液:培养液所用培养基的各组分含量如下，蛋白胨12g/L、葡萄糖35g/ L、乙酸钠6g/L、酵母粉6g/L、柠檬酸二铵3g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.3g/L，其余为水， 然后蒸汽灭菌，随后把S2得到的种子进行移种，温度36°C，培养48h。
[0068] S3、控制水分:将S2得到的发酵西洋参从培养液中取出清洗，然后干燥至含水量为 50% ；
[0069] S4、加热：将步骤S3干燥处理得到的发酵西洋参置于带内部加热装置的不锈钢容 器中，温度控制在95°C，并维持10h，然后降至室温；
[0070] S5、阴干:将S4得到的产物进行阴干至产品含水量为12%，即得3号产品。
[0071 ]测定实验1:西洋参和黑参的人参皂苷种类检测
[0072]将按照本发明工艺生产得到的1号产品和原料西洋参进行提取，利用高效液相色 谱仪对所含有的人参皂苷种类进行检测，判定生产过程中人参皂苷的变化。
[0073]检测步骤(HPLCfe):
[0074] 1、样品处理方法:精确称量西洋参粉末或1号产品粉末1000 mg，装入IOmL离心管 中，均加入5mL甲醇摇匀，超声提取30min，提取液经微膜过滤(孔径0.45μπι)，过滤后液体作 为待检测样品。
[0075] 2、按照下表给出流动相条件进行检测：
[0077] 进样量15yL，检测波长203nm，检测结果见图1和图2。
[0078]由图1可以看出，西洋参提取物所含人参皂苷的出峰时间在29min-45min。
[0079] 由图2可以看出，1号产品提取物所含人参皂苷的出峰时间在47min-59min。
[0080] 所以，西洋参经过本发明工艺加工为1号产品（即黑参)之后，所含有的人参皂苷都 在加工过程中发生了变化，西洋参中所含有的极性较高的人参皂苷转变为了极性较低的人 参稀有皂苷(极性越低在本HPLC检测中出峰时间越晚）。
[0081 ]测定实验2:黑参的急性毒性试验(经口）
[0082]分别采用本发明得到的1号产品、2号产品、3号产品提取物和西洋参提取物对昆明 小鼠进行急性毒性试验(经口），其中西洋参提取物和1号产品、2号产品、3号产品提取物均 使用70%乙醇超声提取，二者提取收率相当，均为20%-25%之间。两种提取物100目粉碎后 用生理盐水加10 %植物油均质为乳剂备用。
[0083] SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重20g±2g，共120只分为8组，每组15只。通过灌胃给 药，剂量参考表1设定为501mg/kg和5000mg/kg，给药后要注意观察小鼠中毒表现和死亡情 况。观察指标通常包括小鼠外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况(死亡时间、濒死亡前的反 应）、体重变化(给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可每3天称重一次)等， 观察时间为7天，对死亡小鼠和观察期满存活小鼠处死进行大体解剖，认真做好试验记录。 [0084]试验结束后，要按照试验结果，填写急性毒性试验记录表。小鼠按20g体重给药 〇.4mL，用配制好的乳剂灌胃。
[0085]实验结果见表2,西洋参高剂量组的小鼠在灌胃的第6天和弟7天分别有两只小鼠 死亡，且存活小鼠的体重平均下降12.3%，西洋参低剂量组无小鼠死亡。参照表1的标准，黑 参提取物的毒性比西洋参提取物的毒性略高，都属于低毒化合物。 Γ OORAl 丰1 O各物怒Π 刍杜蛊杜公祕说姓
[0090] 测定实验3:黑参总皂苷对肿瘤细胞的抑制试验
[0091 ]主要试验材料：西洋参总皂苷（自提，以人参皂苷Re计，总皂苷含量96.7 % ) 1号产 品总皂苷、2号产品总皂苷、3号产品总皂苷（自提，以人参皂苷Re计，总皂苷含量分别为 95 · 7 %、95 · 1 %、96 · 0% )、紫杉醇(Merk公司）、RPMI-1640培养液(Hyclone公司）、96孔细胞 培养板(Corning公司）、DMS0(sigma公司）、乳腺癌细胞MCF-7(ATCC细胞库)和肺癌细胞NCI-H4 6〇( ATCC 细胞库）
[0092]主要仪器:二氧化碳培养箱、倒置显微镜、生物安全柜、多功能酶标仪 [0093] 试验操作过程：
[0094] 首先确定西洋参总皂苷、1号产品总皂苷、2号产品总皂苷、3号产品总皂苷和紫杉 醇为实验组，含溶剂的细胞培养液为对照组。先用含20%DMS0的1640培养液溶解西洋参总 皂苷、黑参总皂苷和紫杉醇;通过添加培养液调整DMSO含量至0.5%且西洋参总皂苷、1号产 品总皂苷、2号产品总皂苷、3号产品总皂苷和紫杉醇的浓度均为200yg/mL;然后取出部分母 液将上述培养液中的西洋参总皂苷、1号产品总皂苷、2号产品总皂苷、3号产品总皂苷和紫 杉醇分别用含〇.5%DMSO的1640培养液稀释为100yg/mL、50yg/mL和25yg/mL;对照组用含 0.5 % DMSO 的 1640培养液。
[0095] 具体步骤如下：
[0096] 乳腺癌细胞株MCF-7和人肺癌细胞株NCI-H460,分别用RPMI-1640细胞培养液进行 培养。将液氮冻存的种子细胞1500rpm离心5min，弃上清加新鲜细胞培养液，吹匀后加入培 养皿中，放入维持5 %CO2的细胞培养箱中，37°C恒温培养，待细胞贴壁生长24h-48h，细胞铺 满皿底面积70 % -80 %左右时，加入I3BS洗涤2-3遍，再加入4mL胰酶37 °C消化约2min，待细胞 变圆之后加入等体积细胞培液终止消化，并将细胞从培养皿底部吹打下来。收集细胞液，离 心弃上清，加入适量1640细胞培养液，吹匀后将细胞悬液分别加入两个25cm 2培养皿，继续 培养。
[0097] 待细胞铺满皿底面积70 %-80 %左右时，加入I3BS洗涤2-3遍，再加入4mL胰酶37 °C 消化约2min，待细胞变圆之后加入等体积细胞培液终止消化，并将细胞从培养皿底部吹打 下来。收集细胞液，离心弃上清，加入一定的培养液，吹匀，取50此加入细胞计数板在倒置显 微镜上计数。
[0098] 细胞计数后通过添加培养液调整细胞密度至(8-10) X 104/mL，将细胞接种至96孔 细胞培养板中，每孔加入IOOyL，放入二氧化碳培养箱中37 °C培养24h。
[0099] 24h后吸去每个孔中的培养液，加入含药培养液，每个浓度设置5个复孔。然后放进 二氧化碳培养箱中培养48h，48h后吸去孔中培养液，每孔依次加入IOOyL培养液和50yL MTT 溶液，摇匀后再次放进二氧化碳培养箱培养4h，4h后吸出混合液，加入150yL DMSO来溶解紫 色晶体甲瓒，酶标仪上设置中速震荡l〇min，检测波长570nm，测定每孔的吸光度值A。
[0100] 肿瘤细胞抑制率=(空白组A-实验组A) X 100%/空白组。
[0101] 上述西洋参总皂苷、1号产品总皂苷、2号产品总皂苷、3号产品总皂苷和紫杉醇对 两种肿瘤细胞的抑制率如表3所示。
[0102] 表3西洋参总皂苷、黑参总皂苷和紫杉醇对两种肿瘤细胞的抑制率
[0104] 测定实验4:黑参总皂苷对NK细胞活性试验
[0105] 实验材料:乳酸脱氢酶LDH基质液(按照表4准备）、YAC1细胞(ATCC细胞库）、西洋参 总皂苷（自提，以人参皂苷Re计，总皂苷含量96.7% )、1号产品总皂苷、2号产品总皂苷、3号 产品总皂苷（自提，以人参皂苷Re计，总皂苷含量分别为95.7%、95.1%、96.0%)。
[0106] 表4乳酸脱氢酶LDH基质液种试剂及浓度 Lmua」 王安探作卯卜：
[0109] 将表4试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液中（pH8.2)，配制。
[0110] 靶细胞的传代(YACl细胞)的制备过程:实验前24h将靶细胞进行传代培养。使前用 Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4 X 105个/mL。
[0111] 脾细胞悬液的制备（效应细胞）的制备过程:无菌取小鼠脾脏，置于盛有适量无菌 Hanks液的小皿中，用镊子轻轻将脾夹碎，经200目筛网过滤单细胞悬液。1000 rpm离心 IOmin，加入0.5mL无菌水震荡20s，裂解红细胞后再加入2倍的Hanks液0.5mL及SmlJtlHanks 液，1000 rpm离心10min，用ImL含10 %小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1 %冰醋酸稀 释后计数(活细胞数应在95%以上），用台盼兰染色计数活细胞数(应在95%以上），最后用 RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2 X IO7个/mL。
[0112] NK细胞活性检测：取不同药物浓度处理过的效应细胞各100yL(20yL药+80yL细 胞），加入96孔细胞培养板中，然后将靶细胞悬液也分别加100yL(效靶比50:1)，并同时设靶 细胞自然释放对照组（IOOyL靶细胞+IOOyL RPMI-1640)和最大释放对照组（IOOyL靶细胞+ IOOyL 1 % ΝΡ-40)，每个样本设5个复孔。上述各项均设5个复孔，于37 °C、5 % C02培养箱中培 养4h，然后将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清IOOyL置于平底96孔板中，同时 加入0)!1基质液10(^1^，反应3111；[11，每孔加入11]1〇1凡的!1(]13(^1^，在酶标仪49〇111]1处测定光密 度值(OD)。
[0113] 按公式1计算NK细胞活性： 反应应OD-自然释然释OD
[0114] 公式1:NK细胞活性（％)= ----X 100% 最大释大释OD -自然释然释OD
[0115] 西洋参总皂苷和1号产品总皂苷、2号产品总皂苷、3号产品总皂苷对NK细胞活性测 定结果见表5。
[0116] 表5西洋参总皂苷和黑参总皂苷对NK细胞活性测定结果
[0118] 注:与对照组相比，*表示显著(P<0.05);林表示极显著(P<0.01)。
[0119] 体外细胞学试验和动物学试验表明，用该方法加工的黑参微毒，具有良好的抗肿 瘤效果和增强免疫力的作用。本工艺采用标准化操作流程，便于质量控制，得到的黑参有望 成为保健食品和药品的重要生产原料，为西洋参的应用提供了更多可能的途径。
[0120] 上述【具体实施方式】不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人 员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
[0121] 本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
【主权项】
1. 一种黑参加工工艺，其特征在于:包括如下步骤： 51、 清洗:将新鲜的西洋参或润透的西洋参干品用水清洗干净后备用； 52、 发酵:将S1得到的洗净后的西洋参浸没到接种有植物乳杆菌和短乳杆菌的培养液 中，然后进行恒温厌氧发酵，温度设定为34°C_36°C，发酵时间设定为48h-120h得发酵西洋 参； 53、 控制水分：将S2得到的发酵西洋参从培养液中取出清洗，然后干燥至含水量为 30%-50% ； 54、 加热：将步骤S3干燥处理得到的发酵西洋参置于密闭容器中，加热温度控制在95 °C -105 °C，并维持lh-1 Oh，然后降至室温； 55、 阴干:将S4得到的产物进行阴干，即得最终产品。2. 根据权利要求1所述的一种黑参加工工艺，其特征在于:在S2中所用的培养液，包括 以下重量含量的组分:蛋白胨8_12g/L、葡萄糖25-35g/L、乙酸钠4-6g/L、酵母粉4-6g/L、柠 檬酸二铵l_3g/L、磷酸氢二钾l-3g/L、硫酸镁0.1-0.3g/L，其余为水。3. 根据权利要求1所述的一种黑参加工工艺，其特征在于:在S2中所用的接种有植物乳 杆菌和短乳杆菌的培养液制备过程包括如下步骤： 51、 配置一级培养基：一级培养基组分含量如下，蛋白胨8-12g/L、葡萄糖35-45g/L、乙 酸钠4_6g/L、酵母粉4-6g/L、柠檬酸二铵l-3g/L、磷酸氢二钾l-3g/L、硫酸镁0.1-0.3g/L，其 余为水;然后蒸汽灭菌； 52、 接种:随后植物乳杆菌和短乳杆菌进行接种培育，温度34°C_36°C，培育12h-24h; 53、 配置培养液：培养液所用培养基的各组分含量如下，蛋白胨8-12g/L、葡萄糖25-35g/L、乙酸钠4-6g/L、酵母粉4-6g/L、柠檬酸二铵l-3g/L、磷酸氢二钾l-3g/L、硫酸镁0. ΙΟ. 3g/L ， 其余为水; 然后蒸汽灭菌 ，随后把 S2 得到 的种子液按照 15-25g/L 的接种量进行接种 到培养液，温度34°C -36 °C，培育48h-l 20h。4. 根据权利要求1所述的一种黑参加工工艺，其特征在于:在S3中，将S2得到的发酵西 洋参从培养液中取出，然后用纯化水喷淋洗涤，随后在鼓风干燥箱内，温度保持在50°C-60 °C，干燥至产物的含水量为30%-50%。5. 根据权利要求1所述的一种黑参加工工艺，其特征在于:在S4中，所用密闭容器为带 内部加热装置的不锈钢容器。6. 根据权利要求1所述的一种黑参加工工艺，其特征在于:在S5中，阴干至产品含水量 为 8%-12%〇7. 根据权利要求1所述的一种黑参加工工艺制得的黑参在增强免疫力和抗肿瘤领域的 应用。
【文档编号】A61P37/04GK106074647SQ201610717602
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】王文水, 蒋胜, 王琳
【申请人】蒋胜