专利名称：虎杖苷在制备防晒化妆品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然植物提取物虎杖苷的新用途，具体涉及虎杖苷在制备防晒化妆品中的应用。
背景技术：
皮肤作为抵抗环境和外源有害物质的有效屏障，保护着人体内的各种器官。皮肤过度或长期暴露于阳光紫外线下能引起许多皮肤疾病，是皮肤干燥、起皮、起皱、色斑异常以及皮肤癌产生等的重要因素。阳光紫外线光谱可以被分为3个部分即短波(UVC 200-280nm),中波(UVB 280-320nm)、长波(UVA :320_400歷)。其中，由于臭氧层的吸收，短波射线(UVC)几乎不能到达地球表面，所以阳光紫外线对人皮肤造成的损伤主要是由中波(UVB)和长波(UVA)射线的综合作用引起的。长波射线(UVA)占阳光紫外线总量最多，能够穿透皮肤最深，它能够诱导皮肤细胞产生单态氧等活性氧簇，从而间接的对细胞内的大分子物质(蛋白质、脂质和 DNA)产生伤害，常常引起皮肤松弛以及皮肤免疫功能的失常。中波射线(UVB)可以穿透人皮肤的整个表皮层和部分真皮层，虽然它在阳光紫外线中所占总量只有大约5%，但是它可以直接诱导DNA损伤和氧化刺激，从而引起皮肤早衰以及对免疫系统的损害等有害的生物效应，而这些有害生物效应则是阳光紫外线诱导皮肤肿瘤发生过程中的重要影响因素。目前随着社会的发展，物质生活水平的提高，人们对自己外形和容貌的重视以及对阳关紫外线损伤皮肤知识的了解，防晒产品日益受到人们的关注和普遍使用。阳光紫外线照射对人皮肤细胞的损伤研究已经成为热点，寻找能够保护皮肤细胞免受阳光紫外线照射损伤的无毒副作用且有效的药物则是人们当下十分关注且亟待解决的问题之一。根据国内外学者的研究表明，许多天然多酚类物质(如绿茶多酚、葡萄籽原花青素等)对阳光紫外线引起的皮肤炎症、氧化刺激和DNA损伤等光损伤有防护作用。由于从中草药中提取的天然有效活性成分一般副作用小，安全性高，使用放心，人们的接受度高，具有一定的研究优势。根据国内外研究表明，虎杖苷具有保护心血管细胞、降血脂、抗脂质过氧化、抗血小板凝聚、抗肿瘤作用，同时还有镇咳、平喘、抗菌作用，抗病毒作用等药理作用。但至今尚未见国内外关于虎杖苷在光损伤防护方面作用的相关文献报道。由于虎杖苷的分子量较小，比较有利于皮肤的吸收，因此研究虎杖苷对紫外线损伤皮肤的保护作用具有重要的理论意义和实际应用价值。本发明创新地提出了一种具有保护皮肤防治紫外线损伤的天然植物有效成分虎杖苷在化妆品中的应用。本发明在细胞水平研究发现虎杖苷能明显抵抗紫外线对人表皮细胞的损伤作用，并对人表皮细胞具有保护和修复作用。本发明在动物水平研究发现虎杖苷能明显保护由于紫外线对小鼠皮肤的伤害，防紫外线作用效果显著。在本发明的人体实验结果表明，虎杖苷添加的化妆品能明显增加皮肤弹性和水分的含量，降低皮肤黑色素含量。 本发明的虎杖苷在防晒化妆品中的应用，可以作为化妆品添加剂的形式使用，可以制成具有防晒的霜剂、乳剂、面膜、爽肤水、护肤水、软膏、油剂、凝胶、气雾剂、溶液剂、或涂膜剂等各类剂型。
发明内容
本发明提出了虎杖苷在制备防晒化妆品中的应用。其中，虎杖苷是所述防晒化妆品中抗紫外线损伤的活性成分。虎杖苷的用量为 0.1%-10%。其中，所述防晒化妆品为外用化妆品，包括霜剂、乳剂、面膜、爽肤水、护肤水、软膏、油剂、凝胶、气雾剂、溶液剂、或涂膜剂。本发明提供具有保护皮肤细胞防治紫外线损伤作用的天然植物提取物虎杖苷在化妆品中的应用。本发明中的虎杖苷可以是纯品，或包含虎杖苷成分的任何组成物或混合物或复方。其中，所述防晒化妆品中虎杖苷的含量可以是起到有效活性作用的任何比例范围。本发明中虎杖苷的含量为质量浓度0. 1%以上。较佳的是，本发明中虎杖苷的含量为0. 1% -10%质量百分比浓度。虎杖苷(Polydatin)，主要来源于蓼科植物虎杖的根茎和根，具有很高的生物活性。虎杖苷的化学名称为3，4’，5-三羟基芪-3-β -单-D-葡萄糖苷，白色针状结晶粉末。 易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，微溶于水。分子式为C2。H 2 20 8，分子量为390。结构式如下式⑴所示
本发明通过实验研究首次提出了虎杖苷具有明显抵抗紫外线对皮肤的损伤作用。通过细胞水平实验和小鼠动物实验研究，本发明发现虎杖苷具有显著防治紫外线对表皮细胞的损伤作用，并对人表皮细胞具有保护和修复的效果。在本发明人体实验中发现添加1%虎杖苷制成的化妆品涂抹人体皮肤后能明显增加人皮肤的弹性和水分，降低皮肤黑色素的形成，效果十分显著。本发明首次公开了虎杖苷具有明显保护皮肤的防晒作用效果，是一种具有很好作用效果的化妆品添加剂。本发明应用中的所述防晒化妆品为外用化妆品，可以化妆品添加剂的形式使用。 含有本发明活性成分虎杖苷的皮肤外用组合物或混合物或复方，可以采用任何适用于皮肤的剂型，如可以制成具有防晒的霜剂、乳液、面膜、爽肤水、护肤水、软膏、油剂、凝胶、气雾剂、溶液剂、或涂膜剂等各类使用剂型。上述各种类型的化妆品可以按照化妆品领域的常规方法制备。
图1是紫外线(UVB)照射HaCaT细胞的半致死剂量结果图。
图2是虎杖苷对UVB照射的HaCaT细胞的存活率的影响示意图。图3是虎杖苷对HaCaT细胞活性的影响示意图。图4是虎杖苷对UVB照射的HaCaT细胞的形态和数量的影响示意图。图5是虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞C0X-2基因转录水平的影响示意图。图6是虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞C0X-2基因蛋白水平的影响示意图。图7是虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞cleaved caspase3蛋白含量的影响示意图。图8是虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞PARP蛋白酶被切割失活的影响示意图。图9是虎杖苷对UVB照射的裸鼠皮肤的保护作用效果示意图。
具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实验材料与方法 1、实验材料
虎杖苷粉末(购自同田生物)，纯度> 99%，IOmg溶解于500微升DMSO溶液中，配成浓度为20mg/ml的原液，置于4°C保存。使用时用无血清的培养液将原液稀释成所需浓度即可。2、细胞培养
人皮肤角质细胞(HaCaT细胞，购自ATCC)的培养实验所用HaCaT细胞培养于含有10% 小牛血清和1%双抗的1640培养基中，放置于37°C 5% CO2培养箱中培养。当细胞基本长满培养瓶底部时进行细胞传代和铺板。3、加药和紫外线照射处理
用基本长满培养瓶底部的HaCaT细胞进行铺板。用于筛药的细胞以IX IO5个/ml的细胞密度接种于96孔板中，分为空白组(不做任何处理)、对照组(不加虎杖苷但接受UVB照射)和实验组(加入设定浓度的虎杖苷并接受UVB照射)。待细胞贴壁生长1 后，吸走培养基，用PBS清洗一遍，实验组分别加入不同浓度的虎杖苷溶液。加虎杖苷1 后，对照组和实验组细胞接受90mJ的UVB照射，空白组不照UVB。照射后吸走虎杖苷溶液，加入新鲜无血清1640培养基。4、MTS法检测细胞存活率
用于筛药的96孔板中细胞在接受完90mJ UVB照射后Mh JnAMTS 18μ1/孔，然后放置在37°C培养箱中孵育Ih后取出，用酶联免疫仪测定490nm波长下各孔的吸光度，比较空白组、对照组和实验组吸光度的差异，确定不同浓度的虎杖苷是否对UVB引起的HaCaT的损伤有保护作用。5、动物实验
裸鼠10只(上海斯莱克动物有限公司，SPF级)，实验前适应性预饲养一周，鼠房12小时光照/12小时黑暗间隔，动物给予标准饲料和水，每天由实验人员观察记录。将裸鼠以脊柱为界，左面涂抹基础化妆品配方，右面涂抹添加1%虎杖苷的防晒化妆品。每天早晚各涂抹一次，早晨涂抹完成后给裸鼠照射紫外线UVB (0. 5J/cm2),如此连续处理5天，每天观察并记录实验结果。6、数据统计分析
实验数据以平均数加减标准差表示，组间差异比较采用t检验。实施例1、紫外线(UVB)照射HaCaT细胞的剂量确定
96 孔板中的 HaCaT 细胞，采用 3OmJ/cm2、6OmJ/cm2、9OmJ/cm2 和 120mJ/cm2 的 UVB 剂量进行照射，并设置了不接受照射的空白组。用MTS法测得各组细胞存活率如图1。图1显示 UVB照射HaCaT细胞的半致死剂量为90mJ/cm2，因此以后的实验均用90mJ/cm2作为UVB照射细胞的损伤剂量。实施例2、虎杖苷对UVB照射的HaCaT细胞的保护作用
UVB照射使对照组HaCaT细胞致死率达到半致死以下，极大地降低了 HaCaT细胞的增殖活性。而虎杖苷在浓度为10yg/ml时，就有显著保护HaCaT细胞免受UVB损伤的作用，如图2所示，并且这种保护作用在虎杖苷的浓度为10-200 μ g/ml范围内呈现剂量依赖性。图 2中加药组与紫外对照组比较，*P < 0. 05，< 0. 01，P < 0. 001。实施例3、虎杖苷对HaCaT细胞活性的影响
用不同浓度的虎杖苷(20μ g/ml、40y g/ml、80y g/ml、100y g/ml、150y g/ml、200y g/ ml)处理HaCaT细胞24h后，采用MTS法检测细胞增殖活性，结果如图3所示。图3中，加药组与紫外对照组比较，*P < 0. 05，< 0.01, P < 0. 001。当虎杖苷作用浓度为 80 μ g/ml以下时，对HaCaT细胞的增殖活性几乎没有任何影响；而当虎杖苷作用浓度达到 100 μ g/ml及以上时，则能够较为显著的抑制HaCaT细胞的增殖活性。因此，选择虎杖苷浓度20 μ g/ml,40 μ g/ml和80 μ g/ml作为本发明细胞和分子机制研究的药物浓度。实施例4、虎杖苷对UVB照射的HaCaT细胞的形态和数量的影响
UVB照射能够引起HaCaT细胞的损伤，导致细胞形态数量发生变化，表现为细胞碎片增多，漂浮于培养液中。实验结果如图4所示，空白组(不做任何处理的细胞)和药效空白组 (仅加入80 μ g/ml H但不接受UVB照射的细胞)中贴壁HaCaT细胞数量多且生长密集；而对照组(只加UVB照射的细胞)经过UVB照射后，贴壁细胞数量大量减少，说明UVB照射使得 HaCaT细胞损伤明显。在实验组(加入不同浓度的虎杖苷并接受相同剂量UVB的照射)，细胞贴壁的数量和密集程度要明显好于对照组，且浓度越高，保护效果越明显，呈一定的量效关系。实施例5、虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞中C0X-2基因转录水平的影响 C0X-2基因是与细胞炎症反应因子的产生以及肿瘤发生有关的基因，UVB辐射能够诱
导HaCaT细胞中C0X-2基因的高表达，我们用20 μ g/ml,40 μ g/ml和80 μ g/ml的虎杖苷分别来处理HaCaT细胞作为实验组，并设置了空白组、药效空白组和对照组，采用RT-PCR法从 RNA水平检测了虎杖苷对UVB照射的HaCaT细胞中C0X-2表达水平的影响，结果如图5所示， UVB照射能使对照组HaCaT细胞中C0X-2基因的表达水平相比于正常HaCaT细胞有明显的上升。而在UVB照射前用虎杖苷处理的HaCaT细胞，可以有效抑制UVB诱导的C0X-2基因表达量的上调，且与虎杖苷的浓度呈量效关系。其中，加药组与紫外对照组比较，*P<0.05， **P < 0. 01，_ P < 0. 001。实施例6、虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞中C0X-2基因蛋白水平的影响
用Wfestern blotting法检测HaCaT细胞中C0X-2基因蛋白含量，实验结果表明，UVB照射能使对照组HaCaT细胞中C0X-2基因的蛋白含量相比于正常HaCaT细胞有明显的上升。 而用虎杖苷处理的HaCaT细胞，可以有效地抑制UVB诱导的C0X-2基因蛋白的含量，且呈明显的量效关系，如图6所示。其中，加药组与紫外对照组比较，*P < 0. 05，< 0. 01，*** P < 0. 001。实施例7、虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞中cleaved caspase3基因蛋白水平的影响
caspase3是与细胞凋亡密切相关的基因，cleaved caspase3是caspase3的活化形式，cleaved caspasd在细胞中含量的升高预示着细胞的凋亡。UVB辐射能够诱导细胞中 cleaved caspase3含量上升并引起细胞凋亡，我们用20 μ g/ml、40 μ g/ml和80 μ g/ml的虎杖苷分别来处理HaCaT细胞作为实验组，并设置了空白组、药效空白组和对照组。结果表明，正常HaCaT细胞中几乎没有cleaved caspase3蛋白，而UVB照射过的对照组HaCaT细胞中cleaved caspasd蛋白却有很高的含量。用不同浓度的虎杖苷处理HaCaT细胞，则可以显著抑制UVB照射诱导的cleaved caspase3蛋白的产生，如图7所示，并且这种抑制效果随着虎杖苷浓度的升高呈现依赖性。其中，加药组与紫外对照组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 01，_ P < 0. 001。实施例8、虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞中PARP蛋白酶被切割失活的影响 PARP是一种核酶，它与DNA损伤修复和细胞凋亡有关。其处于正常活性形式时的大小
为116kDa，UVB能够诱导它的切割(切割成85_89kDa和M_29kDa两个大小的蛋白)，使它失活。我们用20 μ g/ml,40 μ g/ml和80 μ g/ml的虎杖苷分别处理HaCaT细胞作为实验组， 采用Wfestern blotting法检测了虎杖苷对UVB照射诱导HaCaT细胞中PARP酶被切割失活的影响。实验结果表明，UVB照射造成对照组HaCaT细胞中的PARP酶被大量切割，形成 89kDa的小片段蛋白，当使用不同浓度的虎杖苷处理细胞后，89kDa蛋白的含量明显减少， 说明PARP酶被切割的量在减少，并且虎杖苷对PARP酶的保护作用具有如图8所示的随着 H浓度的升高而呈现的依赖性。其中，加药组与紫外对照组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 01，
**氺 P < 0. 001。实施例9、虎杖苷对UVB照射的裸鼠皮肤的保护作用效果
UVB的照射能够引起皮肤起皮、起皱等现象的发生。本实施例将1%虎杖苷制成化妆品膏剂，化妆品基础配方成分为每100克含水78. 8克，甘油6克，EDTA 二钠0. 1克，鲸蜡硬脂醇0. 8克，碳酸二辛酯4. 0克，辛酸癸酸三甘油酯3. 0克，白矿油4. 0克，硬脂醇醚一 21 1. O克，硬脂醇醚一 2 1. 0克，聚丙烯酸13/聚异丁烯/聚山梨酸酯20 0. 8克，苯氧乙醇 0.3克，羟苯甲酯0.2克。分别给10只裸鼠的后背皮肤左半边涂上基础配方化妆品膏剂、右半边涂抹本发明含1%虎杖苷的基础配方制成的膏剂，每天左右半边分别涂抹0.1克基础膏剂和虎杖苷药物膏剂后进行UVB的照射，每天照射UVB (0. 5J/cm2)，连续实验5天后，观察实验结果并拍照。图9中显示实验后任选两只裸鼠拍摄的背部情况照片。实验结果显示，没有添加虎杖苷的基础膏剂涂抹在裸鼠左边背部，在UVB照射后，裸鼠后背左半边皮肤产生了明显的起皮现象。而右半边涂抹了本发明含1%虎杖苷的基础膏剂的右半边皮肤，在UVB照射后，仍然表现得比较光滑，说明虎杖苷能够有效的保护裸鼠皮肤免受UVB照射带来的损害，是一种效果和作用非常良好的防晒化妆品添加剂。
实施例10、虎杖苷对人体皮肤在阳光紫外线照射前后的实验结果比较
将虎杖苷按1%的质量比加入化妆品的基础配方中，制成膏剂，化妆品基础膏剂配方见实施例9。实验前用皮肤弹性水分测试仪(Cutometer MPA 580，德国)检测每个人左右手臂正面的皮肤弹性、水分、黑色素含量的基础值，选取左右手臂没有显著差异的人员参与本实验，共50个志愿者参加本次实验，每组10人，男女各5人。开始正式实验，在志愿者左手手臂正面只涂化妆品基础配方膏剂作为对照(以下称对照组)，右手手臂正面涂抹加过虎杖苷的化妆品基础膏剂(以下称药物组)，每天涂抹一次，每次大约0. 3克。要求志愿者每天将涂抹过含或不含虎杖苷的化妆品基础膏剂的双手手臂在太阳光下照射半小时，实验两周后，再检测左右手臂皮肤的弹性、水分和黑色素含量情况。药物组分五组:A组使用含0. 01%虎杖苷的膏剂；B组使用含0. 1%虎杖苷的膏剂；C组含1%虎杖苷的膏剂；D组使用含10%虎杖苷的膏剂；E组使用含20%虎杖苷的膏剂。实验结果表明，所有涂抹含有虎杖苷药物组化妆品的志愿者的手臂均没有引起任何皮肤过敏症状。实验结果还表明，药物组涂抹过虎杖苷药物组的手臂实验前后比较皮肤弹性的百分比均有明显升高，而黑色素含量的百分比则明显降低，与对照组实验前后比较差异显著，且呈明显的量效关系，而皮肤水分的变化不明显，见表1。说明含0.01%-20%的虎杖苷各药物组对被实验对象均具有防晒作用，在0. 1%-20%的浓度范围下防晒效果十分明显，主要表现在增加皮肤弹性和降低黑色素生成，并对皮肤细胞具有很好的保护作用效果， 是一种非常理想的化妆品添加剂，最适添加剂量在0. 1%_10%质量百分比浓度之间。表1虎杖苷对人体皮肤弹性、水分和黑色素的影响
(实验后的数据-实验前的数据)/实验前的数据X100%的平均值
权利要求
1.虎杖苷在制备防晒化妆品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述虎杖苷是所述防晒化妆品中抗紫外线损伤的活性成分。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述虎杖苷的用量为0.1%-10%。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防晒化妆品为外用化妆品，为霜剂、乳剂、面膜、爽肤水、护肤水、软膏、油剂、凝胶、气雾剂、溶液剂、或涂膜剂。
全文摘要
本发明公开了虎杖苷在制备防晒化妆品中的应用。虎杖苷在细胞水平能明显抵抗紫外线对人表皮细胞的损伤作用，在动物水平能明显保护由于紫外线对小鼠皮肤的伤害，防紫外线作用效果显著。本发明虎杖苷应用于防晒化妆品中，可以化妆品添加剂的形式使用，或制成具有防晒的霜剂、乳剂、面膜、爽肤水、护肤水、软膏、油剂、凝胶、气雾剂、溶液剂、或涂膜剂等各类剂型。
文档编号A61Q17/04GK102258434SQ201110202868
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者何云东, 刘明耀, 刘雨婷, 刘霞, 叶希韵 申请人:华东师范大学