含有具有可释放掺杂剂的陶瓷颗粒的纳米纤维垫的制作方法

本发明涉及一种含有陶瓷颗粒的纳米纤维垫。陶瓷颗粒可释放地封装有待从纳米纤维垫递送的掺杂剂。特别地，本发明涉及一种纳米纤维垫，该纳米纤维垫含有至少一种封装在陶瓷基质中的掺杂剂。本发明还提供纳米纤维垫，该纳米纤维垫含有至少一种封装在陶瓷基质中的掺杂剂和至少一种游离掺杂剂，该游离掺杂剂可与该封装的掺杂剂相同或不同。还考虑制备该纳米纤维垫的方法。

背景技术：

纳米纤维通常被认为是直径小于1μm的纤维，具有改善用于多种应用的许多产品的潜力。它们具有与其非常高的表面积相关的独特物理、机械和电气特性。在这方面，与商业纺织品相比，纳米纤维-非织造垫通常具有非常小的孔径。

纳米纤维通常适合于用于受控药物递送的非织造垫的生产。静电纺丝纤维具有所需的性质(如高负载量、可同时进行各种治疗剂的递送、易于操作和成本效益好)，这些性质已经扩展了其在药物递送中的用途。在各种应用中，伤口敷料和局部癌症治疗是研究最多的两个领域。

静电纺丝是一种用于生产纳米纤维的技术，其利用静电力来生产直径范围从数百纳米到微米的超细纤维。这是目前通过外部和内部电场的作用生产超细纤维的公知的技术。静电纺丝装置由一个旋转电极(喷丝头)组成，该电极与高压源连接。喷丝头通常带正电荷，并位于与带相反电荷的收集器相距规定的距离处。可以使用不同的静电纺丝装置，包括水平装置或垂直装置，其中喷丝头分别位于收集器的上方和下方。根据纳米纤维的所需结构，可以使用不同种类的收集器进行静电纺丝。存在具有光滑或结构化的表面的静态或旋转的收集器。将聚合物溶液加入喷丝头中，在该喷丝头的孔中产生聚合物液滴。通过电力拉伸和拉长聚合物液体，并将其作为纳米纤维收集在接地的收集器上。

静电纺纳米纤维已成功用于实现不同的药物控制释放曲线，例如即时、平滑、脉冲、延迟和双相释放。药物可以通过在聚合物溶液中溶解或分散而嵌入纤维中。用于组织发育的许多有趣的生物实体(例如天然的蛋白质或核酸)不溶于有机溶剂，并且当分散在聚合物溶液中时可能丧失生物活性。

已经开发了通过洗脱杀菌化合物发挥其抗微生物作用的商业伤口敷料，以向伤口提供治疗剂量的银离子的持续释放。然而，银离子对角质形成细胞和成纤维细胞具有高毒性，并且如果不加选择地施用于愈合组织区域，则可能延迟伤口修复。除此之外，还需要持续的伤口清洁和矫正，但其使患者感到不适并需要大量的护理输入。来自静电纺纳米纤维基质的可生物降解的药物洗脱伤口敷料可能提供优于常规的几个优点。

根据伤口类型及其愈合情况，必须使用最合适的伤口敷料系统。对于快速愈合伤口，通常使用不同类型的伤口敷料材料。由于纳米纤维结构的独特性质，与其他现代伤口敷料材料(例如水胶体、水凝胶等)相比，这些材料在各种类型伤口上的应用更具吸引力。通常，可以认为所有现代伤口敷料材料应该在伤口/敷料界面处保持合适的环境、吸收多余的渗出物而不会泄漏到敷料表面，提供隔热、提供机械和细菌保护、允许气体和流体交换、吸收伤口气味、不粘附伤口、易于清除、无创伤、提供一些清创作用(去除死亡组织和外来颗粒)、无毒、(对患者和医疗工作人员)无过敏并且非致敏、而且是无菌并且不留下疤痕的。

静电纺丝载药纳米纤维膜可能具有几个优点。局部抗生素和麻醉剂具有将高药物浓度提供到所需的精确区域的优点，并且局部施用的抗生素的总剂量通常不足以产生全身毒性作用。由可生物降解的聚合物膜制成的抗生素负载伤口敷料具有许多进一步的优点。首先，可生物降解的膜提供杀菌浓度的抗生素持续完全治疗特定感染所需的延长时间。其次，关于从数周到数月的生物降解程度的通用性可以允许治疗许多类型的感染。第三，可生物降解的膜可溶解，因此不需要去除。当这些膜缓慢溶解时，它们可能为需要组织再生的伤口提供原位支架，例如，软组织或骨缺损会慢慢堆积起来，最大限度地减少重建的需要。

局部施用对皮肤或周围组织具有局部镇痛作用的药物通常用于不同的疼痛情景，通常旨在阻断或减少伤害性神经末梢的活化和向中枢神经系统传播动作电位。用于此目的的最广泛使用的一类药物是局部麻醉剂，其作为电压门控钠通道阻滞剂起作用。该局部麻醉剂用于表面麻醉，其中将喷雾、溶液或乳膏施用于皮肤或粘膜，效果通常短暂并且仅限于接触区域。另一种方法涉及浸润麻醉，其中将局部麻醉剂注射和/或注入待麻醉的组织中。周围神经阻滞用于麻醉由周围神经支配的区域，其中将局部麻醉剂注射在受影响的区域附近。

对于局部应用，局部麻醉剂目前以溶液、霜剂和贴剂的形式提供。该溶液用于注射、渗透和喷雾，而镇痛/麻醉作用的持续时间通常由所用局部麻醉剂的药理学特征而定。乳膏制剂直接用于皮肤，但难以维持较长时间。

利多卡因贴剂代表了局部麻醉剂递送的相对新的可能性，除了治疗神经性疼痛外，其还用于许多不同的临床环境。目前使用脂质体、聚合物和微球(weiniger,c.f.,l.golovanevski,a.j.domb和d.ickowicz。用于局部麻醉剂的延长释放制剂。anaesthesia[麻醉杂志]2012,67(8),906-916)，正在开发许多新的局部麻醉制剂以延长效果并降低全身毒性。基于纳米纤维的系统也被开发并用于伤口敷料(chen,davew.,yung-henghsu,jun-yiliao,shih-jungliu,jan-kanchen和stevewen-nengueng可从新型电纺夹层结构plga/胶原纳米纤维膜中持续释放万古霉素、庆大霉素和利多卡因(sustainablereleaseofvancomycin,gentamicinandlidocainefromnovelelectrospunsandwich-structuredplga/collagennanofibrousmembranes)。internationaljournalofpharmaceutics[国际药剂学杂志]2012,430,335–341)和硬膜外镇痛，其中，利多卡因包埋的聚([d,l]-丙交酯-共-乙交酯)纳米纤维减少了椎板切除术后大鼠疼痛的严重程度(tseng,yy,wachen,jyliao,yckao和sjliu用于在椎板切除术后将利多卡因持续递送到硬膜外腔的可生物降解的聚([d,l]-丙交酯-共-乙交酯)纳米纤维(biodegradablepoly([d,l]-lactide-co-glycolide)nanofibersforthesustainabledeliveryoflidocaineintotheepiduralspaceafterlaminectomy)。nanomedicine[纳米医学].2014,9,77-87)。在这项研究中，纳米纤维提供的利多卡因持续释放超过两周，局部浓度远高于血浆中的浓度。

本申请要求保护的主题不限于解决任何缺点或仅在诸如上述那些环境中操作的实施例。相反，仅提供该背景以说明可能实践本申请描述的一些实施例的一个示例性技术领域。

技术实现要素：

如上所述，本发明一般涉及一种纳米纤维垫，该纳米纤维垫含有至少一种封装在陶瓷基质中的掺杂剂，并且可能含有至少一种游离掺杂剂，该游离掺杂剂可与该封装的掺杂剂相同或不同。还描述了制备该纳米纤维垫的方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种纳米纤维垫，其包含：

形成所述垫的静电纺纳米纤维；和

陶瓷颗粒，其分散在整个所述纳米纤维中，并且包含陶瓷基质和可释放地封装在所述陶瓷基质内的掺杂剂，

其中，在纳米纤维的静电纺丝期间，陶瓷颗粒分散在整个纳米纤维中，由此在所述静电纺丝期间所述掺杂剂被所述陶瓷基质保护。

已经发现，通过保护可释放地封装掺杂剂的陶瓷基质内的掺杂剂，可以在静电纺丝期间将掺杂剂掺入纳米纤维垫中。当形成纳米纤维垫时，可以从陶瓷基质中选择性地释放封装的掺杂剂以实现其目的。

静电纺纳米纤维可以由适用于静电纺丝的任何材料形成。静电纺纳米纤维可包括可生物降解的聚合物和非生物可降解的聚合物。重要的是，尽管不是必须的，但封装在颗粒内部的掺杂剂难以溶解于待静电纺丝的聚合物溶液的溶剂(即水或醇或另一种有机溶剂)中。否则，颗粒的内容物可能在聚合物溶液中过早地释放，进而作为“游离药物”掺入纤维中。颗粒可以是微溶的，但优选不是高度可溶的。

在某些实施例中，静电纺纳米纤维选自由以下组成的组：生物相容的和可生物降解的或不可生物降解的合成或天然聚合物。例如，静电纺纳米纤维可选自下组，该组由以下各项组成：醋酸纤维素、胶原、弹性蛋白、明胶、透明质酸、聚丙烯腈、聚己内酯、聚对二氧环己酮、聚环氧乙烷、聚羟基丁酸酯、聚(d-丙交酯)、聚(d,l-丙交酯-共-己内酯)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)、聚丙交酯、聚(l-丙交酯)、聚(l-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠和玉米蛋白。在优选的实施例中，静电纺纳米纤维由聚乙烯醇(pva)形成。例如，优选12wt.％pva溶液。

分散在整个纳米纤维中的陶瓷颗粒包含可释放地保持在陶瓷基质内的掺杂剂。颗粒可以包含固体多孔球体，或者可以采用芯的形式，其中一个或多个层围绕芯。如果是后者，掺杂剂可以位于芯、壳或两者中。芯和壳中可包含相同或不同的掺杂剂。

陶瓷基质可以是前体材料的聚合和/或缩合和/或交联产物。其可以是水解的硅烷，例如水解的有机硅烷。其可包含有机改性的陶瓷，例如有机改性的二氧化硅(有机二氧化硅)。其可以是具有结合的有机基团的陶瓷。结合的有机基团可以是乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、异辛基、癸基、十二烷基、环己基、环辛基或环戊基。这些可以被取代(例如，用官能团、卤素、芳基等取代)或可以是未取代的。其他合适的有机基团包括芳基，其可具有约6至14个碳原子，并且可具有例如6、8、10、12或14或多于14个碳原子。实例包括苯基、联苯基、萘基和蒽基。这些可任选地各自被一个或多个烷基(例如c1-c6直链或支链烷基)、卤素、官能团或其他取代基取代。有机基团可以是烯基或炔基或苄基。烯基或炔基可具有2至约18个碳原子，并且可以是直链的、支链的或(如果存在足够的碳原子)环状的。其可以具有一个或多于一个双键、或一个或多于一个三键，并且可以具有双键和三键的混合物。如果该基团具有多于一个不饱和基团，则不饱和基团可以是共轭的或非共轭的。固体基质可包含衍生自用于形成陶瓷颗粒的催化剂的化学基团，并且这些基团可以在颗粒的表面上。如果在形成反应中使用的表面活性剂能够与前体材料化学结合，则基质可以包含衍生自表面活性剂的化学基团。例如，如果前体材料包含有机基三烷氧基硅烷，并且催化剂包含三烷氧基氨基烷基硅烷，则基质可包含氨基烷基甲硅烷基单元。这些可以均匀地或不均匀地分布在颗粒中。它们可以优先地靠近颗粒表面。它们可以为颗粒表面提供一定程度的亲水性(例如，由于氨基官能度)。另外，表面活性剂可以能够与前体材料化学地结合。例如，如果前体材料包含有机基三烷氧基硅烷，并且表面活性剂包含三烷氧基甲硅烷基官能度，则基质可包含表面活性剂衍生的单元。表面活性剂可以吸附在颗粒的表面。

掺杂剂可选自下组，该组由以下各项组成：疏水性和亲水性小分子药物，如抗生素(氯霉素(chloremphenicol))、镇痛药(非甾体抗炎药、例如双氯芬酸和布洛芬)、狄布卡因、布比卡因、辣椒素、阿米替林、三硝酸甘油酯、阿片类药物、薄荷醇、吡美莫司和苯妥英)、用于晕动病的东莨菪碱(托烷类生物碱药物)。它可包括用于治疗目的的蛋白质：类固醇激素(皮肤湿疹或节育、hrt、雌激素或睾酮)、生长因子、细胞因子、抗体(用于伤口愈合)、疫苗(口腔贴剂)、用于心绞痛的硝酸甘油(舌下贴剂)、维生素b12。掺杂剂可以是荧光或放射性或金属(例如金)示踪剂，以研究生物过程或监测或诊断病症。在一个特定的实施方案中，掺杂剂是利多卡因。

掺杂剂可以是疏水材料、亲水材料、寡核苷酸(dna和rna)或蛋白质等，可以代表占颗粒重量或体积的约0.01％和50％之间，或颗粒重量或体积的约0.01％和10％之间、0.01％和1％之间、0.01％和0.5％之间、0.01％和0.1％之间、0.01％和0.05％之间、0.1％和30％之间、1％和30％之间、5％和30％之间、10％和30％之间、0.1％和10％之间、0.1％和1％之间或1％和10％之间，并可代表颗粒重量或体积的约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或30％。

尽管不是必须的，但颗粒的直径在一定程度上可以由静电纺纳米纤维的尺寸决定。例如，颗粒的直径应使得其可以掺入垫的纳米纤维中而不损害垫纤维的完整性。例如，颗粒的直径可以为约1nm至约1000nm。虽然人们会认为颗粒应该比纤维小，但这并不是必须的。已经发现，在纤维膨胀的情况下，可以将比纤维大的聚集体掺入纤维内。通常，粒径优选小于纤维直径的1.5倍，更优选小于纤维直径，甚至更优选纤维直径的1/2。

颗粒可以是球形、扁球形、卵形或椭圆形。它们可以是规则或不规则的形状。它们可以是无孔的、中孔的或微孔的。其比表面积可以在约2和400m²/g之间，或者在约2和25m²/g之间、2和20m²/g之间、2和15m²/g之间、2和10m²/g之间、10和50m²/g之间、10和25m²/g之间、15和25m²/g之间或20和50m²/g之间，并且可具有约2m²/g、3m²/g、4m²/g、5m²/g、6m²/g、7m²/g、8m²/g、9m²/g、10m²/g、11m²/g、12m²/g、13m²/g、14m²/g、15m²/g、16m²/g、17m²/g、18m²/g、19m²/g、20m²/g、21m²/g、22m²/g、23m²/g、24m²/g、25m²/g、26m²/g、28m²/g、30m²/g、35m²/g、40m²/g、45m²/g或50m²/g的比表面积。

掺杂剂能够从颗粒中释放出来(例如在一段时间内)。释放可以是受控的或持续的。颗粒可以在约1分钟至2周的时间内释放掺杂剂。掺杂剂的释放速率的特征在于半释放时间，其是已经释放一半原始量的疏水材料的时间。颗粒可具有约1分钟至96小时的半释放时间。因此，颗粒可用于需要在相对短的时间内持续释放的应用(例如约1分钟至约1小时)，或者其可用于需要在中间时段持续释放的应用(例如约1小时至约1天)，或者它们可以用于需要在相对长的时期内持续释放的应用(例如超过1天)。

颗粒可以与可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂构成组合物的形式。当掺杂剂是药物物质时，载体可以是药学上可接受的载体，并且颗粒可以是药学上可接受的；当掺杂剂是兽药物质时，载体可以是兽医可接受的载体，并且颗粒可以是兽医可接受的；当掺杂剂是杀生物物质时，载体可以是杀生物可接受的载体，并且颗粒可以是杀生物可接受的；当掺杂剂是化妆品物质时，载体可以是化妆品可接受的载体，并且颗粒可以是化妆品可接受的；并且当掺杂剂是杀真菌物质时，载体可以是杀真菌可接受的载体，并且颗粒可以是杀真菌可接受的。

掺杂剂的封装可以基本可以根据国际公开号wo2006/133519中公开的方法实现，其内容以其整体并入本文。封装可以根据国际公开号wo2001/062232、wo2006/050579、wo2006/084339和wo2012/021922中公开的方法实现，其也以其整体并入本文。

令人惊讶地发现，通过在纳米纤维垫中包含陶瓷颗粒及游离掺杂剂的组合可以显著提高效果，所述陶瓷颗粒包含陶瓷基质和封装在所述陶瓷基质中的可释放的掺杂剂。如本文所用，“游离掺杂剂”旨在表示未封装在陶瓷基质中的掺杂剂(例如粉末形式)。因此，在其他实施方案中，纳米纤维垫还包含分散在整个纳米纤维中的游离掺杂剂。游离掺杂剂可以与封装的掺杂剂相同或不同。通常，游离掺杂剂与封装的掺杂剂相同。

因此，在另一方面，本发明提供了一种纳米纤维垫，其包含：

形成所述垫的静电纺纳米纤维；

陶瓷颗粒，其分散在整个所述纳米纤维中，并且包含陶瓷基质和可释放地封装在所述陶瓷基质内的掺杂剂；和

分散在整个纳米纤维中的游离掺杂剂。

上述选项同样适用于本发明的此方面，并通过引用明确地并入本文。

在本发明的另一方面，提供了一种形成纳米纤维垫的方法，其包括：

提供含有电纺纳米纤维前体的静电纺丝溶液；

将包含陶瓷基质和可释放地封装在所述陶瓷基质中的掺杂剂的陶瓷颗粒加入到所述静电纺丝溶液中；并且

静电纺丝包含所述陶瓷颗粒的静电纺丝溶液，以形成所述纳米纤维垫，所述纳米纤维垫具有分散在所形成的电纺纳米纤维中的所述陶瓷颗粒。

如上所述，已经发现，游离掺杂剂也分布在整个纳米纤维垫中，可以获得令人惊喜的结果。因此，优选该方法包含将粉末形式的掺杂剂添加到静电纺丝溶液中；静电纺丝包含陶瓷颗粒和粉末形式的掺杂剂的静电纺丝溶液，以形成具有陶瓷颗粒和分散在整个形成的电纺纳米纤维中的掺杂剂的纳米纤维垫。这可以有利地增加所得层中掺杂剂的量。

通常可以根据所选择的纳米纤维来选择静电纺丝条件。静电纺丝参数的示例性范围在下表1中提供。

表1：静电纺丝的参数

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise，或如“comprises”或“comprising”的变体)”将被理解为暗示包含所述一个步骤或成分或整数或一组步骤或成分或整数，但不排斥任何其他步骤或成分或整数或一组步骤、成分或整数。因此，在本说明书的上下文中，术语“包含”以包含性的含义使用，因此应理解为“主要包括但不必仅包括”。

本发明由在下文中充分描述和示出的部件的特征及组合构成，应当理解为，在不脱离本发明的范围或牺牲本发明的任何优点的情况下，可以进行细节上的各种改变。

附图简述

为了进一步阐明本发明的一些实施例的各个方面，将参考附图来呈现本发明的更具体的描述，其中：

图1示出了封装利多卡因的概要性过程的流程图。

图2示出了含有利多卡因的颗粒的tga/dta分析图。

图3示出了含有利多卡因的颗粒的静态光散射分析图。

图4示出了含有利多卡因的颗粒的sem图像。

图5示出了含有利多卡因的颗粒的tem图像。

图6示出了sotaxusp4系统中来自纤维的游离的和陶瓷封装的利多卡因的释放曲线。

图7示出了franz单元设备。

图8示出了纳米纤维的sem图像：a)含有利多卡因粉末的纳米纤维(5000x)；b)含有利多卡因粉末的纳米纤维(25000x)；c)含有利多卡因球体的纳米纤维(5000x)；d)含有球体中的利多卡因的纳米纤维(25000x)；e)含有利多卡因粉末和球体中的利多卡因的纳米纤维(5000x)；f)含有利多卡因粉末和球体中的利多卡因的纳米纤维(25000x)；g)pva纳米纤维(5000x)；h)pva纳米纤维(25000x)。

图9示出了具有游离的和/或陶瓷封装的利多卡因的纳米纤维贴剂与商业贴剂之间利多卡因经48小时通过人体皮肤的渗透曲线。

图10示出了贴剂通过皮肤释放的利多卡因的量的图。

图11示出了真皮中贴剂释放的利多卡因的量的图。

图12示出了表皮中贴剂释放的利多卡因的量的图。

图13示出了贴剂中剩余的利多卡因的量的图-纳米纤维贴剂之间的比较。

图14示出了贴剂中剩余的利多卡因的量的图-纳米纤维贴剂和商业贴剂之间的比较。

图15示出了水中的游离的利多卡因通过人体皮肤的渗透曲线。

图16示出了前12小时利多卡因的释放(通过皮肤)。

图17示出了长达48小时的时间内，在不同时间通过皮肤释放的利多卡因。

图18-19示出了在两个单独的实验中，经24小时从新批次的利多卡因纳米纤维垫释放的利多卡因。

图20示出了组合贴剂和商业贴剂的比较，在24小时通过人体皮肤渗透的的利多卡因在四个独立研究中的平均百分比(％)。

图21示出了嵌入纳米纤维垫中的60nm颗粒在来自人皮肤的不同角质层中的渗透：该图显示了经过24小时各层角质层中纳米颗粒的浓度(校准至荧光水平)。

实施例

用于生产封装的利多卡因的材料

利多卡因和四氢呋喃(thf)、苯基三甲氧基硅烷(ptms)和(3-氨基丙基))三乙氧基硅烷(aptes)、原硅酸四乙酯(teos)和tertigolnp-15(np-15)。

封装的利多卡因的生产

利多卡因的封装基本上根据国际公开号wo2006/133519中公开的方法实现，其公开内容以其整体并入本文，如上所讨论。

通常，该过程产生直径范围为200-1000nm的颗粒，这对于纳米纤维中的有效掺入(直径范围：～100-300nm)来说太大。因此，该方法进一步发展从而允许将颗粒掺入纤维。这涉及通过调节试剂比率和控制乳液性质(通过改变为具有比通常使用的亲水亲油平衡更高的亲水亲和平衡的表面活性剂)来减小颗粒的平均尺寸。

具体地，对于利多卡因封装，修改的过程的概述在图1的流程图中示出。通过将54g的np-15溶解在400ml的水中制备表面活性剂溶液。通过将22.4ml的aptes与22.4ml的水混合并冷却来水解aptes。将12.8g的利多卡因溶于6.4ml的thf中，然后加入22.09g的ptms和13.44的teos。将利多卡因/ptms/teos混合物加入到表面活性剂溶液中并使其充分混合。加入利多卡因溶液60分钟后，加入水解的aptes溶液。将颗粒老化过夜，然后通过离心(在12,000rpm下10分钟)分离并收集用于分析和进一步的实验。

颗粒的分析

在产生之后，通过一系列技术表征颗粒以确认颗粒的组成、尺寸和负载量。通过热重分析/差示热分析(tga/dta)测定组成，与先前的颗粒制剂一致(图2)。通过静态光散射(malvernmastersizer2000μu)(图3)、扫描电子显微镜(sem，jeolneoscopejcm-5000)(图4)和透射电子显微镜(tem，philipscm10)(图5)测定尺寸。这些分析表明，产生约60nm的球形颗粒，显示形态均匀。

使用高效液相色谱(hplc)测定颗粒的负载量。为此，利用乙醇将利多卡因从颗粒中浸出，随后通过离心从溶液中除去颗粒。然后通过hplc分析上清液以确定负载量。在利多卡因颗粒的情况下，负载量范围为10-15wt％。

用于生产纳米纤维的材料

聚乙烯醇(pva)是一种合成的亲水聚合物，属于乙烯基聚合物。pva构成简单的化学结构，其含有官能羟基。它可溶于极性溶剂(如，水)。当形成酯键时，通过聚乙烯乙酸酯在甲醇中类似聚合物的水解或醇解制备pva。用西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich)的18-88制备聚乙烯醇溶液。

静电纺丝

将pva在60℃的高温下溶解在蒸馏水中，并持续搅拌24小时，以达到12wt％的浓度。将三种形式(粉末、胶囊及两者的组合)的各种量的利多卡因加入pva溶液中。使用qsonica超声波仪将利多卡因均匀分散在pva溶液中。使用静电纺丝装置对所有含有利多卡因或利多卡因陶瓷颗粒的溶液进行静电纺丝。在非织物纺织品上收集纳米纤维。使用直径为1.6mm的针作为电极。

目的是优化生产以确定可多产地并且有效地静电纺丝的聚合物溶液中利多卡因的最大量。使用franz扩散池，生产具有最高可能量的利多卡因的纳米纤维层用于测试。

静电纺丝的条件

在下表中描述静电纺丝过程中的所有参数：

表2：含有利多卡因粉末的纳米纤维的生产

表3：含有在球体中的利多卡因的纳米纤维的生产

表4：含有利多卡因粉末和在球体中的利多卡因的组合的纳米纤维的生产

表5：不含利多卡因的pva纳米纤维的生产

hplc方法

用hplc定量测量纳米纤维释放的利多卡因的量。通常，hplc分离基于分析物的分离，其基于分析物在静止相(色谱柱)和流动相(液体)之间的分布。至于利多卡因，将贴剂提取物(来自皮肤或缓冲液)装载到c18反相柱上，并在乙腈和0.1％三氟乙酸溶液的混合物中洗脱。使用uv-vis检测器来量化存在的利多卡因的量。

usp4方法

最初使用具有闭合构型的纳米颗粒适配器的sotaxce7智能usp4系统研究利多卡因从纤维和颗粒中的释放。该系统使再循环di水在含有样品的透析管上在指定的时间段内连续流动，并在不同的时间点收集上清液的级分。然后通过hplc分析收集的级分。使用这种方法比较具有游离利多卡因(即不在颗粒中的利多卡因)的纤维和含有封装的利多卡因的纤维(即颗粒中的利多卡因)，发现两种纤维的释放曲线没有显著差异(图6)。因此，掺入纳米纤维垫中的颗粒能够像纤维中含有游离利多卡因的垫一样有效地释放利多卡因。

franz池法

尽管usp4装置对于释放的研究是有效的，但是不可能通过该方法检测利多卡因的透皮释放动力学。屏障(在这种情况下是皮肤)在透皮传播过程中起主要作用。可以在体外或体内测试透皮渗透。测试透皮体外吸收的经典方法是静态垂直扩散池(称为franz池)(图7)。实验通常在人或动物皮肤上进行。人体皮肤是开发人类使用产品的最佳标准。

通常在franz池中，皮肤膜将供体(上部)池部分与受体(下部)分开。膜位于供体部分的底表面上。将测试物质置于合适的介质中进入供体部分。该受体被受体液充满(通常为ph7.4的缓冲液)。连续搅拌该部分，定期取出样品并进行分析。收集样品的仪器分析通常通过hplc、放射线照相或闪烁扫描进行，这取决于所研究物质的类型。

在这里，使用hplc分析和franz池方法研究利多卡因纳米纤维层的释放动力学。下一节描述了含有利多卡因粉末、多卡因球体和利多卡因粉末及利多卡因球体的组合的纳米纤维层的生产及优化。

纳米纤维层的表征

在用金溅射涂覆之后，使用扫描电子显微镜(sem)(zeiss)分析纳米纤维结构。使用图像分析软件(niselements)通过sem图像分析电纺纤维的直径。对于所有制备的层，纳米纤维的直径达到300nm(参见图8)。

利用franz池法比较不同类型纳米纤维垫中利多卡因的释放

使用franz池方法进行利多卡因的渗透分析，利多卡因以各种方式(即，在纳米纤维中、在纳米纤维中的陶瓷颗粒中直接地)固定到皮肤中并穿过皮肤。人体皮肤用作屏障膜。随后通过hplc分析样品。使用ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)作为受体缓冲液。在32℃下连续对其进行搅拌。分析每个纳米纤维层面积为2cm²的样品。

该实验的目的是获得固定化利多卡因从纳米纤维层穿过人体皮肤的渗透曲线。利多卡因直接通过pva中静电纺丝的利多卡因粉末或pva中封装的利多卡因固定在纳米纤维层中，或者通过这些方法的组合固定利多卡因。样品的特征如表6所示。用这些样品分析含有利多卡因的商业贴剂“乌萨特斯(versatis)”。在实验后分析利多卡因在纳米纤维层(利多卡因供体)和皮肤(表皮和真皮)中的残留物。实验时间表示意性地显示在表7中。

表6分析的样品的特征

*球体中的利多卡因的浓度＝1.29％，缓冲液中的游离利多卡因的浓度＝4.83％

**商业贴剂“乌萨特斯(versatis)”

表7：实验结果

表8：游离利多卡因的滞后时间(来自图9的数据)。

讨论

发现在水溶液中，利多卡因在皮肤中的滞后时间(图15)为15小时(表8)。因此，在第一组渗透研究中，在12小时后收集通过皮肤进行渗透分析的样品。

纳米纤维层的渗透曲线显示，在最初12小时内其穿透皮肤速度比利多卡因水溶液更快。据认为，利多卡因的这种快速传播可能是由于pva降解为代谢物(乙酸酯、丙酮酸、乳酸等)，然后通过主动运输或被动扩散将其运输到细胞中。利多卡因可能与这些代谢物(例如作为活性同向转运体)一起渗透，或者这些代谢物可作为利多卡因的渗透促进剂。

在实验期间(48小时)，商业贴剂乌萨特斯(versatis)(样品5)的渗透曲线显示出线性释放(图9)。12小时内释放的利多卡因的量与来自纳米纤维样品2和3的释放的利多卡因的量相当，并且比组合贴剂(样品4)低约4倍。就利多卡因透过皮肤的百分比而言，纳米纤维垫远远优于商业贴剂(70-85％，而商业贴剂仅释放4.1％)。来自供体(贴剂中的剩余利多卡因)的48小时终点分析的数据(图13和图14)表明，>95％的利多卡因仍然留在商业贴剂中，而相比之下，在纳米纤维样品2、3和4中只有15％-30％残留。商业贴剂中利多卡因在真皮和表皮中的积累(～69μg)比纳米纤维层中的高(范围：10-30μg)(图12和图13)。在48小时时，通过皮肤释放的利多卡因的总量显示组合垫(130μg/cm²)的释放最高，然后是商业贴剂(99μg/cm²)，然后是纳米纤维垫样品2和3(分别为36和39μg/cm²)(图10)。有趣的是，当释放速率标准化为最初的利多卡因负载量时，样品2和样品4(具有封装的利多卡因纳米纤维垫)在任何时候都表现出最大的渗透效率(20％-80％)，而商业贴剂在48小时时仅显示出2％的渗透。

具有在球体中的利多卡因的(样品2)或利多卡因粉末(样品3)的纳米纤维层的渗透曲线非常相似，它们之间没有显著差异(图9)。对于两者，大部分利多卡因在24小时后释放，随后释放的利多卡因是线性的。由于在含有游离利多卡因的垫中，利多卡因的初始负载量增加了3倍，这表明两种技术之间存在潜在的协同效应。此外，样品2和3中释放的利多卡因的量与12小时后商业贴剂释放的利多卡因的量相当，表明当使用纳米纤维垫时利多卡因具有优异的渗透性。

通过封装的利多卡因及利多卡因粉末的组合(样品4)将利多卡因固定到纳米纤维层中显示出非常不同的渗透曲线。在12小时后，样品2、3和5通过皮肤释放的利多卡因显示出相似的量，而样品4在12小时后表现出通过皮肤释放的利多卡因高达4倍(图9)。这再次表明封装的利多卡因和纳米纤维之间的有益相互作用促进了利多卡因更好的渗透曲线。此外，样品4在48小时内通过皮肤释放最高量的利多卡因(图9)，其中利多卡因在真皮(图10)和表皮(图11)中的积累显著。特别是与使用游离的利多卡因(样品3)的样品释放相比，尽管负载量非常相似(样品3约为6％，样品4约为5％)，样品4始终释放出明显更高量的利多卡因。因此，封装的利多卡因与游离利多卡因的存在增强了利多卡因释放和渗透的效率。重要的是，在任何时候，组合样品4释放的利多卡因都比商业样品多，在48小时的时候，其只有25％的利多卡因未消耗，而在商业贴剂中有96％的利多卡因未消耗。

由于纳米纤维与封装的利多卡因的协同作用，组合样品中层的不同降解特征可能导致在利多卡因从不同类型的垫转移到皮肤中期间的渗透曲线的变化。

进一步研究

进行了另外三项franz池研究，其结果概述如下。结论是在4下储存4个月后贴剂稳定，并且组合贴剂中利多卡因的释放早在2小时就开始了。这比任何时候从商业贴剂获得的量都多大约2-7倍。贴剂准备如下：

表9：具有在球体中的利多卡因的纳米纤维的生产

参考图16-19，示出了在franz池实验中使用不同批次的聚合物和利多卡因颗粒的三个单独研究中组合贴剂的性能。测量来自组合贴剂和商业贴剂的利多卡因通过人皮肤(每次新鲜获得)的渗透。图16的图表显示了前12小时利多卡因(通过皮肤)的释放。图17的图表显示了长达48小时的时间内，利多卡因在不同时间通过皮肤的释放。图18-19的图描绘了在两个单独的实验中经24小时从不同批次的贴剂释放的利多卡因。

参考图20，示出了通过4个独立研究，组合贴剂和商业贴剂的比较，表示为24小时透过人体皮肤的利多卡因平均的百分比(％)。在24小时时，利多卡因组合贴剂释放的利多卡因约是80％，而商业贴剂中只有1％。

来自这些研究的数据增强了利多卡因组合贴剂相对于商业贴剂的优越性。来自这些研究的数据表明，组合贴剂中利多卡因的释放早在2小时时就开始了(相对于商业贴剂>4小时)，显示利多卡因释放的水平比商业贴剂在任何时候都高出许多倍。值得注意的是，尽管有这样一个事实，组合贴剂中的利多卡因负载量比相同尺寸的商业贴剂中的利多卡因负载量低60-100倍。

组合贴剂一致且显著地比商业贴剂更有效，以更高的释放效率释放大约80％的有效负载量。

纳米粒子(50-100nm)对皮肤的渗透

在franz池实验中，用含有fitc标记的二氧化硅颗粒(～60nm)的组合贴剂处理人皮肤。将从该处理过的皮肤获得的角质层(sc，即由角质化死细胞组成的皮肤的最外层)分成15层，并通过荧光测定法经24小时在分开的层中定量荧光水平。

参考图21，仅可以在角质层(1-7)的顶层中检测到荧光，下层接近背景水平。这意味着在局部施用后，颗粒不太可能穿透角质层。

结论

使用国际公开号wo2006/133519中公开的方法的改进来优化利多卡因在二氧化硅基质中的封装，并适当大小(约60nm)的利多卡因负载颗粒被生产、表征并成功掺入纳米纤维非织造垫中。

使用静电纺丝法制备三种含有利多卡因的纳米纤维层。直接通过具有利多卡因粉末的pva溶液、具有含有利多卡因的颗粒的pva溶液、具有利多卡因粉末与含有利多卡因的颗粒的组合的pva溶液的静电纺丝，将利多卡因固定在纳米纤维层中。

usp4评估清楚地显示了当掺入纳米纤维垫中时颗粒能够释放利多卡因。然而，为了比较生物相关系统中来自不同类型垫的利多卡因的释放动力学，使用了franz池方法。在最初的12小时内，纳米纤维层的渗透曲线显示纳米纤维层中的利多卡因比水溶液中的穿透人体皮肤的速度更快。该过程可能是由pva代谢物的渗透增强引起的，pva代谢物通过主动运输或被动扩散运输到细胞中。该数据还清楚地显示了具有封装的利多卡因的颗粒释放利多卡因通过人体皮肤的能力。

通常，与商业贴剂乌萨特斯(versatis)相比，含有利多卡因的纳米纤维垫可提高渗透效率。尽管负载量高出几倍(5000x-50000x)，但乌萨特斯(versatis)在样品2和3上的表现相似，在12小时时比样品4差四倍。来自纳米纤维垫的利多卡因的这种渗透性的增强可归因于纤维的可生物降解性质以及pva代谢物的可能的渗透增强。

尽管利多卡因负载量低3倍，但具有封装在颗粒中的利多卡因纳米的纳米纤维层(样品2)和具有利多卡因粉末的纳米纤维层(样品3)的渗透曲线相似，这表明当将含有利多卡因的颗粒添加到纤维中时的渗透增强效果。然而，供体的终点分析显示样品2具有比样品3更多的利多卡因残留，可能表明对利多卡因释放的控制更强。

当利多卡因作为含有利多卡因的颗粒和游离利多卡因的组合(样品4)固定在纳米纤维层中时，这两种技术的协同效应尤其明显。该样品显示出非常独特的渗透曲线。

来自样品4的利多卡因的释放速率优于包括商业贴剂在内的所有类型的垫。这表明了这两种技术具有互利效果的可能性。在12小时后，该层显示其中利多卡因通过皮肤的释放比样品2和3高4倍。虽然数据显示，来自样品4的利多卡因与商业贴剂具有相似的线性释放，但是在任何时候都释放出的量都更高，并且在皮肤的较深层(即真皮)中具有相当的积累。

与仅含有具有封装的利多卡因的颗粒的纳米纤维(样品2)相比具有封装的利多卡因的颗粒和利多卡因粉末的组合(样品4)的纳米纤维显示出不同的渗透曲线。这种现象可能是由于在负载颗粒存在下各层的不同降解分布，或在利多卡因转移到皮肤期间的一些其他协同机制。

当在三个单独的franz池实验中使用不同批次的利多卡因陶瓷颗粒和pva生产的不同批次的纳米纤维贴剂时，利多卡因纳米纤维组合贴剂的这种优越性得到了加强和明确证实。

总体而言，纳米纤维贴剂在利多卡因通过皮肤的百分比释放方面的表现优于商业贴剂。负载颗粒与纳米纤维的组合似乎显著提高了利多卡因渗透的效率。虽然需要阐明确切的机制，但是一系列因素可能在这方面发挥作用：纤维的可生物降解性质、pva代谢物的渗透增强或由于纤维中颗粒的物理结合导致的机械可行性。

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