蛋白酶抗性的胰岛素类似物的制作方法

专利名称：：蛋白酶抗性的胰岛素类似物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对蛋白酶表现出抗性的新型胰岛素类似物、制备这样的胰岛素类似物的方法、制备含有本发明胰岛素类似物的胰岛素制剂的方法、以及应用这些胰岛素类似物治疗糖尿病的方法。
背景技术：
：口服途径是至今最广泛使用的给药途径，且普遍被患者所接受，尤其是对于慢性治疗。然而由于若干障碍诸如胃肠(GI)道内酶解、药物外排泵、肠粘膜吸收不足和可变吸收以及肝中的首过代谢，治疗性肽或蛋白常局限于胃肠外途径给药，而非优选的口服给药。人胰岛素被胃中(胃蛋白酶)、肠腔中(胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶等)和胃肠(GI)道粘膜表面中(氨肽酶、羧肽酶、肠肽酶、二肽基肽酶、内肽酶等)的各种消化酶类降解。遗憾的是，很多肽和蛋白已被证明有临床效果，如果其易于给予受者和可^^皮受者接受，它们的应用则将更广泛。糖尿病是指利用葡萄糖的能力部分或完全丧失的代谢病。所有人群中约5%患有糖尿病，该疾病接近传染病的比例。自二十世纪二十年代？1入胰岛素以来，人们一直对改善糖尿病的治疗不断作出努力。因为患有糖尿病的人接受超过数十年的长期治疗，因此存在安全、方便、改善生活质量的胰岛素制剂的较大需要。在糖尿病的治疗中，已推荐和应用许多种类的胰岛素制剂，例如常规胰岛素、低精蛋白胰岛素(特指中性低精蛋白锌胰岛素NPH)、胰岛素锌混悬液(诸如Semilente、Lente⑧和Ultralente⑧)和双相低精蛋白胰岛素。某些市售的胰岛素制剂特点为速效，而其它制剂则起效相对緩慢但表现出或多或少的长效。速效型胰岛素制剂通常是胰岛素溶液，而緩效的胰岛素制剂可为包含晶型胰岛素和/或非晶型胰岛素的混悬液，所述胰岛素通过单独添加锌盐或添加精蛋白或添加两者组合析出。人胰岛素由两条多肽链分别包含21个氨基酸残基的A链和30个氨基酸残基的B链组成。所述A链和B链通过两个二硫键相互连接。大多数其它物种来源的胰岛素是相似的，但在某些位置中可含有氨基酸的取代。近十年来已开发了许多人胰岛素类似物。它们为了特定作用特征(即速效或长效)而设计。包含这样的胰岛素类似物的市售产品包括Levemir、NovoRapid、Humalog、Apidra和Lantus。通常胰岛素制剂经皮下注射给予。然而，由于患者的顺应性、安全性和便利性，通过口服途径给予将是有益的。蛋白质药物例如胰岛素的口服给药由于酶和吸收屏障往往造成非常低的生物利用度。肽和蛋白质递送的常规途径为胃肠外给药，其是侵袭性的且不方便。因此人们不断地深入研究非侵袭性途径例如蛋白药物的口服递送。最近设计用于口服蛋白/肽递送的制剂包括含有蛋白酶抑制剂、渗透促进剂、基于聚合物的释药系统和胰岛素缀合物的复合制剂。所述胰岛素缀合物包括己基-胰岛素-单缀合物-2(HIM2)(NobexCooperation和GSK),即具有连接B29的PEG7-己基基团的人胰岛素类似物。在例如US7,030,082、US6,867,183和US6,770,625中业已报道口服用HIM2的蛋白水解稳定性和生物利用度相对于胰岛素得到增大。发明简述在本发明的一个实施方案中，提供了蛋白水解稳定性增强和生物胰岛素活性得以保留的胰岛素类似物。在本发明的另一个实施方案中，提供了胰岛素类似物，该类似物中相对于母体胰岛素分子(parentinsulinmolecule)有至少两个氨基酸被取代和/或缺失。在本发明的又一个实施方案中，4是供了胰岛素类似物，该类似物述母体胰岛素有至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代，其中所述取代位于所述母体胰岛素的两个以上蛋白酶切割位点内部或与其紧密邻近处，且其中这样的胰岛素类似物任选地进一步包含一个以上插入突变。提供本发明的胰岛素类似物也是本发明的目的，其中相对于所述母体胰岛素，所述胰岛素类似物的A链包含至少一个突变，所述胰岛素类似物的B链包含至少一个突变。本发明还涉及编码要求保护的胰岛素类似物的前肽原的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及含有这样的核酸序列的载体和含有这样的核酸序列或载体的宿主细胞。还提供获得本发明胰岛素类似物的方法和其作为药物的用途。附图详述图1:在37。C下根据完整胰岛素(类似物)的百分比测量人胰岛素(HI)和胰岛素类似物对胰凝乳蛋白酶的蛋白水解稳定性。图2:在25。C下根据完整胰岛素(类似物)的百分比测量人胰岛素(HI)和胰岛素类似物对胃蛋白酶的蛋白水解稳定性。发明详述本发明的胰岛素类似物为相对于母体胰岛素分子具有A和/或B氨基酸链的两个以上突变的胰岛素分子。业已发现通过用亲水性氨基酸取代位于胰岛素上两个以上蛋白酶位点内部或与其紧密接近处的两个以上疏水性氨基酸，得到相对于母体胰岛素蛋白水解稳定的胰岛素类似物。以下是一系列非限定性的实施方案，这些实施方案在本文中的其他地方作进一步描述实施方案1.胰岛素类似物，该类似物中相对于母体胰岛素，有至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代，其中所述取代位于母体胰岛素的两个以上蛋白酶切割位点内部或与其紧密接近处，且其中这样的胰岛素类似物任选地进一步包含一个以上插入突变。实施方案2.实施方案1的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素稳定性得以增强。实施方案3.实施方案1-2中任一项的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，胰岛素类似物的A链包含至少一个突变，胰岛素类似物的B链包含至少一个突变。实施方案4.实施方案1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含初次修饰胰岛素类似物的蛋白酶位点内的至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代为至少一个疏水性氨基酸被至少一个亲水性氨基酸所取代。实施方案5.实施方案1-4中任一项的胰岛素类似物，其中A12位的氨基酸为Glu或Asp,和/或A13位的氨基酸为His、Asn、Glu或Asp,和/或A14位的氨基酸为Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly或His，和/或A15位的氨基酸为Glu或Asp;而B24位的氨基酸为His,和/或B25位的氨基酸为His,和/或B26位的氨基酸为His、Gly、Asp或Thr，和/或B27位的氨基酸为His、Glu、Lys、Gly或Arg,和/或B28位的氨基酸为His、Gly或Asp;并且其任选地进一步包含一个以上插入突变。实施方案6.实施方案1-5中任一项的胰岛素类似物，其中A14位的氨基酸为Ghi、Asp或His，B25位的氨基酸为His，且其任选地进一步包含一个以上插入突变。实施方案7.实施方案1-6中任一项的胰岛素类似物，其中A14位的氨基酸为Glu、Asp或His，B25位的氨基酸为His而B30位的氨基酸缺失。实施方案8.实施方案1-6中任一项的胰岛素类似物，其中A14位的氨基酸为Glu、Asp或His，B25位的氨基酸为His。实施方案9.实施方案1-6中任一项的胰岛素类似物，其中所述一个以上插入突变选自A(-3)Gly、A(-2)Gly、A(-l)Pro、A(0)Pro、A8His、A18Gln、A18Gln、A21Gln、A21Gly、B(-3)Gly、B(-2)Gly、B(-l)Pro、B(0)Pro、BlGlu、BlGln、ro、BlGlu、BlGln、B3Gln、B10Pro、B14Thr、B16Glu、B17Ser、B26Asp、DesB26、DesB27、B27Glu、B27Glu、B28Asp、desB28、desB29、desB30、B31Leu和B32Glu。实施方案10.实施方案1-6或9中任一项的胰岛素类似物，其中所述插入突变为desB30。实施方案11.实施方案1-10中任一项的胰岛素类似物，其中A14为Glu。实施方案12.实施方案1-11中任一项的胰岛素类似物，其相对于所述母体蛋白表现出对一种以上蛋白酶类的稳定性增强。实施方案13.实施方案1-12中任一项的胰岛素类似物，其相对于所述母体蛋白显示出对两种以上蛋白酶类的稳定性增强。实施方案14.实施方案1-13中任一项的胰岛素类似物，其中所述母体氨基酸选自人胰岛素；人胰岛素的胰岛素类似物，其中B28位的氨基酸残基为Pro、Asp、Lys、Leu、Val或Ala，B29位的氨基酸残基为Lys或Pro,任选B30位的氨基酸残基缺失；des(B26-B30)人胰岛素、des(B27-B30)人胰岛素、des(B28-B30)人胰岛素、des(B29-B30)人胰岛素、des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素；人胰岛素的胰岛素类似物，其中B3位的氨基酸残基为Lys,B29位的氨基酸残基为Glu或Asp;人胰岛素的胰岛素类似物，其中A21位的氨基酸残基为Gly且其中所述胰岛素类似物在其C端进一步延伸两个Arg残基；胰岛素衍生物，其中B30位的氨基酸残基被苏氨酸曱酯取代；和胰岛素衍生物，其中des(B30)人胰岛素B29位中，赖氨酸的Ns位连有十四烷酰链。实施方案15.实施方案1-6、9或1-14中任一项的胰岛素类似物，其中选择一个以上插入突变以增强胰岛素的化学稳定性。实施方案16.实施方案15的胰岛素类似物，其中所述一个以上插入突变选自A18Gln、A21Gln、A21GLy和B3Gln。实施方案17.实施方案1-4或12-14中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物包含式1的A链氨基酸序列XaaA(—2)-XaaA(.i)-XaaA0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaAi3-XaaA14-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2广X犯A22式(l)(SEQIDNo:1)和式2的B链氨基酸序列XaaB(.2)-XaaB(.i)-XaaBo-XaaB1-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBi6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB3o-XaaB3广XaaB32式(2)(SEQIDNo:2)其中XaaA(.2)不存在或为Gly;XaaA(.!)不存在或为Pro;XaaAQ不存在或为Pro;XaaA8独立选自Thr和His;XaaA!2独立选自Ser、Asp和Glu;XaaA!3《虫立选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa甜独立选自Tyr、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^5》虫立选自Gln、Asp和Glu;Xaa雄独立选自Asn、Lys和Gln;XaaA2i独立选自Asn和Gln;XaaA22不存在或为Lys;XaaB(.2)不存在或为Gly;Xaasy)不存在或为Pro;XaaBo不存在或为Pro;XaaB1不存在或独立选自Phe和Glu;XaaB2不存在或为Val;XaaB3不存在或为独立选自Asn和Gin;XaaB4独立选自Gin和Glu;Xaa，独立选自His、Asp、Pro和Glu;Xaam6《虫立选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;XaaB24独立选自Phe和His;XaaB25独立选自Phe和His;XaaB26不存在或独立选自Tyr、His、Thr、Gly和Asp;XaaB27不存在或独立选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaB28不存在或3虫立选自Pro、His、Gly和Asp;XaaB29不存在或《虫立选自Lys和Gin;XaaB3o不存在或为Thr;XaaB31不存在或为Leu;Xaas32不存在或为Glu;C端可任选衍生为酰胺；其中所述A链的氨基酸序列和所述B链的氨基酸序列通过所述A链7位半胱氨酸与所述B链7位半胱氨酸之间的二石克键、以及所述A链20位半胱氨酸与所述B链19位半胱氨酸之间的二石危一建连接，且其中所述A链6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接；其中任选所述A链氨基酸序列N端通过含3-7个氨基酸的氨基酸序列与所述B链氨基酸序列C端连接，以形成单链胰岛素分子，其中任选以l-10个氨基酸延伸所述B链N端；其中若XaaA8为Thr且XaaA12为Ser且XaaA13为Leu且XaaA14为Tyr,则XaaA15为Glu或Asp;和其中若XaaB24为Phe且XaaB25为Phe且XaaB26为Tyr且XaaB27为Thr且XaaB2s为Pro,贝UXaaB29为Gln。实施方案18.实施方案1-4或12-14中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物包含式3的A链氨基酸序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaAi2-XaaAi3-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA2i式(3)(SEQIDNo:3)和式4的B链氨基酸序列XaaBi-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-Xa^B27""X犯B28-X犯B29-X犯B30式(4)(SEQIDNo:4)其中XaaA8独立选自Thr和His;XaaA。独立选自Ser、Asp禾口Glu;XaaAi3独立选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^4独立选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^5独立选自Gln、Asp和Glu;Xaa八i8独立选自Asn、Lys和Gln;XaaA21独立选自Asn和Gln;XaaB1独立选自Phe和Glu;XaaB3独立选自Asn和Gln;XaaB4》虫立选自Gin和Glu;Xaawo独立选自His、Asp、Pro和Glu;Xaaw6独立选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg牙口Glu;XaaB24独立选自Phe和His;XaaB26不存在或独立选自Tyr、His、Hir、Gly和Asp;XaaB27不存在或独立选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser禾口Ghi;Xaas28不存在或独立选自Pro、His、Gly和Asp;XaaB29不存在或独立选自Lys和Gin;XaaB3o不存在或为Thr;C端可任选衍生为酰胺；其中所述A链的氨基酸序列和所述B链的氨基酸序列通过所述A链7位半胱氨酸与所述B链7位半胱氨酸之间的二硫键、以及所述A链20位半胱氨酸与所述B链19位半胱氨酸之间的二石克键连接，且其中所述A链6位和11位的半胱氨酸通过二硫4建连接。实施方案19.实施方案18的胰岛素类似物，其中XaaA8独立选自Thr和His;Xaa^2独立选自Ser和Glu;Xaa^3独立选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaAM《虫立选自Asp、His和Glu;XaaA15独立选自Gin和Glu;Xaa鳩独立选自Asn、Lys和Gin;XaaA21独立选自Asn和Gin;XaaB1独立选自Phe和Glu;XaaB3独立选自Asn和Gin;XaaB4独立选自Gin和Glu;独立选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;XaaB24独立选自Phe和His;Xaas26独立选自Tyr、Thr、Gly和Asp;XaaB27独立选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg和Glu;XaaB28独立选自Pro、Gly和Asp;Xaas29独立选自Lys和Gin;XaaB3o不存在或为Thr;C端可任选衍生为酰胺；其中所述A链的氨基酸序列和所述B链的氨基酸序列通过所述A链7位半胱氨酸与所述B链7位半胱氨酸之间的二硫键、以及所述A链20位半胱氨酸与所述B链19位半胱氨酸之间的二硫键连接，且其中所述A链6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接。实施方案20.实施方案1-16中任一项的胰岛素类似物，其中B链C端通过3-15个氨基酸或3-7个氨基酸与A链N端连接，以形成单链胰岛素分子，其中任选以l-10个氨基酸延伸B链N端。实施方案21.药物组合物，所述药物组合物包含生物活性量的实施方案1-20中任一项的所述胰岛素分子和药学上可接受的载体。实施方案22.药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1-20中任一项的两种以上胰岛素类似物，其中每种类似物限定为具有至少一个突变，所述突变在至少一种其它变体中不存在。实施方案23.实施方案11-20中任一项的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂，任选包含辅药。实施方案24.用于治疗对象中的糖尿病的方法，所述方法包括给予对象实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物或实施方案21-23中任一项的药物组合物。实施方案25.降低哺乳动物中血糖水平的方法，所述方法通过向需要这种治疗的患者给予治疗有效剂量的实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物或实施方案21-23中任一项的药物组合物来进行。实施方案26.实施方案24或25的方法，所述方法为口服给药方法。实施方案27.实施方案24或25的方法，所述方法为胃肠外给药方法。实施方案28.实施方案24或25的方法，所述方法为气管内给药方法。实施方案29.实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物用作治疗或预防以下疾病的药物高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖症、X综合征和血脂障碍。实施方案30.实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物用作延迟或预防II型糖尿病病程的药物。实施方案31.实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物用作起以下作用的药物减少食物纟聂入、减少p-细胞凋亡、增强P-细胞功能和增大P-细胞群和/或用于恢复P-细胞的葡萄糖敏感性。实施方案32.编码实施方案l-20中任一项的胰岛素类似物的核酸序列、其衍生物、其部分序列、其降解序列或在严格条件下与其杂交的序列。实施方案33.编码实施方案l-20中任一项的胰岛素类似物前体的核酸序列、其衍生物、其部分序列、其降解序列或其在严格条件下与其杂交的序列。实施方案34.表达载体，所述表达载体包含实施方案32或33的核酸序列。实施方案35.宿主细胞，所述宿主细胞包含实施方案34的表达载体。实施方案36.制备胰岛素类似物的方法，所述方法包括培养实施方案35中宿主细胞的步骤。实施方案37.制备实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物的方法，其中所述氨基酸的取代通过定点诱变实现。实施方案38.制备实施方案21-23中任一项的药物组合物的方法，所述方法包括将实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物与药学上可接受的物质和/或赋形剂混合。实施方案39.药物组合物，所述药物组合物可由实施方案38的方法获得。胰岛素是由胰脏中P-细胞分泌的多肽激素。胰岛素由A和B两条多肽链构成，所述A和B两链通过两个链间二硫键连接。此外，所述A链特征为有一个链内二硫键。该激素由单链前体胰岛素原(前胰岛素原(preproinsulin))合成，所述前胰岛素原由24个氨基酸的前肽后接包含86个氨基酸的胰岛素原组成，其结构为前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C为31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg为用于从所述A链和B链切去连接肽的切割位点。本发明的胰岛素类似物可包含进一步的突变。胰岛素分子中突变的形式可为天然胰岛素分子A链和/或B链中的氨基酸残基的取代、缺失或插入。"desB30"或"B(l-29)"是指缺少B30氨基酸残基的天然胰岛素B链，"A(1-21)"是指天然胰岛素A链。小C肽及其氨基酸序列以氨基酸的三字母码表示。本文术语如Al、A2、A3等分别表示胰岛素A链(从N末端算起)的1、2和3位。同样，术语如B1、B2、B3等分别表示胰岛素B链(从N末端算起)的l、2和3位。当使用编码氨基酸的单字母码时，术语例如A21A、A21G和A21Q特指在A21位中的氨基酸分别为A、G和Q。当使用氨基酸的三字母码时，其相应的表示分别为A21Ala、A21Gly和A21Gln。(0)分别表示与Al或BlN末端相邻的位置。酸的位置。因此A(-2)和B(-2)分别表示与A(-l)和B(-l)N末端相邻的位置，A(-3)和B(-3)分别表示与A(-2)和B(-2)N末端相邻的位置等等。术语连接肽包含可以使胰岛素中的B链C端氨基酸残基与A链N端氨基酸残基相连的肽链。术语前肽是指多肽序列，其功能是允许将表达后的多肽从内质网引导到其高尔基体并进一步引导到分泌小泡以分泌至培养基中(即所述多肽穿过细胞壁或至少穿过细胞膜进入其酵母细胞的外周胞质空间的输出过程)。所述前肽可为所述酵母a-因子前肽，参阅US4,546,082和4,870,008。或者，所述前肽可为合成前肽，即在自然界中没有的前肽。合适的合成前肽为US5,395,922、5,795,746、5,162,498和W098/32867中公开的前肽。所述前肽优选在C末端含有内肽酶加工位点，例如Lys-Arg序列或其任何功能性类似物。术语"糖尿病"包括I型糖尿病、II型糖尿病和其它引起高血糖症的病况。术语疾病"治疗"包括所述疾病的治疗、预防或緩解。在本发明的一个实施方案中，所述胰岛素类似物尤其适合口服给药。疏水性氨基酸在本文理解为天然存在的氨基酸色氨酸(Trp,W)、苯丙氨酸(Phe,F)、缬氨酸(Val,V)、异亮氨酸(Ile,1)、亮氨酸(Leu，L)和酪氨酸(Tyr，Y)(括号内带有三字母缩写和单字母缩写)。亲水性氨基酸在本文理解为，不包括上述定义中的疏水性氨基酸的天然氨基酸。在一个实施方案中，本发明的亲水性氨基酸选自谷氨酸(Glu,E)、天冬氨酸(Asp,D)、组氨酸(His,H)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天冬酰胺(Asn,N)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、脯氨酸(Pro,P)、甘氨酸(Gly,G)、赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg,R)。在另一个实施方案中，本发明的亲水性氨基酸选自谷氨酸(Glu，E)、天冬氨酸(Asp,D)、组氨酸(His,H)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天冬酰胺(Asn,N)、赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg，R)。本发明的"胰岛素"在本文理解为人胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物。本文所用术语"母体胰岛素"意指在对其施用本发明任何突变前的胰岛素。母体胰岛素的非限定性实例为例如野生型胰岛素如人胰岛素或猪胰岛素；人胰岛素类似物；或人胰岛素衍生物例如PEG化或酰化的人胰岛素或胰岛素类似物。在一个实施方案中，本发明的母体胰岛素选自人胰岛素；人胰岛素的胰岛素类似物，其中B28位的氨基酸残基为Pro、Asp、Lys、Leu、Val或Ala;B29位的氨基酸残基为Lys或Pro,并任选缺失B30位的氨基酸残基；胰岛素类似物，其为des(B28-B30)人胰岛素、des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素；人胰岛素的胰岛素类似物，其中B3位的氨基酸残基为Lys，B29位的氨基酸残基为Glu或Asp;人胰岛素的胰岛素类似物，其中A21位的氨基酸残基为Gly,且其中所述胰岛素类似物在所述C端进一步延伸两个精氨酸残基；胰岛素衍生物，其中B30位的氨基酸残基被苏氨酸曱酯取代；和胰岛素衍生物，其中des(B30)人胰岛素的B29位赖氨酸的Ns位连有十四烷酰链。在一个实施方案中，本发明的母体氨基酸选自人胰岛素；DesB30人胰岛素；AspB28人胰岛素；AspB28、DesB30人胰岛素；LysB3、GluB29人胰岛素；LysB28、ProB29人胰岛素；GlyA21、ArgB31、ArgB32人胰岛素；和DesB30、ArgB31、ArgB32人胰岛素。本文所用术语"胰岛素类似物"意指经修饰的胰岛素，其中所述胰岛素的一个以上核苷酸残基被其它核苷酸残基所取代，和/或其中一个以上核苷酸残基从所述胰岛素中缺失，和/或其中一个以上核苷酸残基被插入至所述胰岛素中。在一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于8个修饰(取代、缺失或添加)。在一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于7个修饰(取代、缺失或添加)。在一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于6个修饰(取代、缺失或添加)。在另一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于5个修饰(取代、缺失或添加)。在另一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于4个修饰(取代、缺失或添加)。在另一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于3个修饰(取代、缺失或添加)。在另一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母体胰岛素包含少于2个〗务饰(取代、缺失或添加)。本文所用术语"胰岛素衍生物"意指经化学修饰的母体胰岛素或其类似物(即被共价修饰的母体蛋白)，所述胰岛素衍生物中有至少一个取代基不在母体蛋白或其类似物中存在。典型的修饰物为酰胺、糖类、烷基、酰基、酯和PEG化物等。本发明的人胰岛素衍生物的实例为苏氨酸曱脂-B30人胰岛素、Ns-B29-十四烷酰des(B30)人胰岛素、Ns-B29-十四烷酰GlnB3des(B30)人胰岛素、Ns-B29-十三烷酰人胰岛素、Ne-B29-十四烷酰人胰岛素、Ns-B29-癸酰人胰岛素和Ns-B29-十二烷酰人胰岛素。本文所用术语"人胰岛素"意指其结构和性质众所周知的人激素。人胰岛素有两条多肽链，即A链和B链，其通过半胱氨酸残基之间的二硫键连接。所述A链为21个氨基酸肽，B链为30个氨基酸肽，所述两条链由三个二硫键连接一个在所述A链6位和11位的半胱氨酸之间、第二个在所述A链7位的半胱氨酸和所述B链7位的半胱氨酸之间、第三个在所述A链20位的半胱氨酸和所述B链19位的半胱氨酸之间。胰岛素分子中的突变通过指定(A或B)链、位置和取代天然氨基酸的氨基酸的三字母码来表示。"desB30"是指缺少B30氨基酸的天然胰岛素B链或其类似物。因此，A21Gly人胰岛素、B28Asp人胰岛素、desB30人胰岛素为A链21位突变为甘氨酸的人胰岛素类似物，B链28位突变为天冬氨酸的人胰岛素类似物，B链30位缺失的人胰岛素类似物。"蛋白酶"或"蛋白水解酶"为降解蛋白和肽的消化酶类，存在于人体各种组织中，例如胃(胃蛋白酶)、肠腔(胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶等)和GI胃肠道的粘膜表面(氨肽酶、羧肽酶、肠肽酶、二肽基肽酶、内肽酶等)、肝(胰岛素降解酶、组织蛋白酶D等)和其它组织中。蛋白水解稳定的胰岛素类似物在本文理解为胰岛素类似物，其相对于人胰岛素被一种以上蛋白酶降解得更緩慢。在一个实施方案中，本发明的蛋白水解稳定的胰岛素类似物相对于母体胰岛素被一种以上蛋白酶降解得更緩慢。在本发明的另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物针对选自以下的一种以上酶类的降解稳定胃蛋白酶(例如同工型胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)、胰凝乳蛋白酶(如同工型胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B和/或胰凝乳蛋白酶C)、胰蛋白酶、胰岛素降解酶(IDE)、弹性蛋白酶(如同工型胰弹性蛋白酶I或/和I1)、羧肽酶(如同工型羧肽酶A、羧肽酶A2和/或羧肽酶B)、氨肽酶、组织蛋白酶D和鼠、猪或人源的肠提取物中存在的其它酶类。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物针对选自以下的一种以上酶类的降解稳定胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰岛素降解酶(IDE)、弹性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和组织蛋白酶D。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物稳定针对选自以下的一种以上酶类的降解稳定胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和IDE。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物针对选自胰凝乳蛋白酶和羧肽酶的一种以上酶类的降解稳定。T^可根据实施例中所描述通过测量本发明的胰岛素类似物对蛋白酶类(例如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A)的蛋白水解稳定性来确定。在本发明的一个实施方案中，TY2相对于人胰岛素得以增加。在本发明的另一个实施方案中，r/2相对于母体胰岛素得以增加。在又一个实施方案中，TY2相对于母体胰岛素增加了至少2倍。在又一个实施方案中，P/2相对于母体胰岛素增加了至少3倍。在又一个实施方案中，P/2相对于母体胰岛素增加了至少4倍。在又一个实施方案中，!Y2相对于母体胰岛素增加了至少5倍。在又一个实施方案中，TY2相对于母体胰岛素增加了至少io倍。蛋白酶切割位点(在本文中也称为蛋白酶位点)被理解为那些被蛋白酶识别的氨基酸残基和/或其肽键被蛋白酶切割的氨基酸残基。可通过由HPLC、MS或LC-MS分析确定切割"热点"，和/或通过基于需要确定蛋白酶切割位点的蛋白酶的酶特异性的预测，来确定蛋白酶切割位点。本领域的技术人员应了解如何确定蛋白酶切割位点，例如基于酶特异性根据例如以下出版物中所描述的来确定蛋白酶切割位点HandbookofProteolyticalEnzyme,第2版，Barrett，A.J.，Rawlings，N.D"Woesner,J.F.editors,ElsevierAcademicPress2004。例长口月夷凝乳蛋白酶被预测为切割不后接Pro的芳香族残基(Trp、Tyr、Phe或Leu)C端的肽键。同样，胰蛋白酶被预测为切割不后接Pro的石咸性残基(Lys或Arg)C端的肽键。弹性蛋白酶被预测为切割Ala、Val、Gly或Ser的残基C端，而羧肽酶A将移除除Arg、Lys和Pro之外的任何C端氨基酸。胰岛素降解酶(IDE)被预测为切割人胰岛素的以下位置B9-10、BlO-ll、B13-14、B14陽15、B24-25、B25-26、A13-14和A14-15。本文所用术语取代"在蛋白酶切割位点内部或与其紧密邻近的"氨基酸表示取代位于母体胰岛素中已确定为蛋白酶切割位点的位置内部或与该位置紧密邻近处的氨基酸。在一个实施方案中，位于胰岛素上两个以上蛋白酶位点内部或与其紧密邻近处的两个以上疏水性氨基酸被取代，其中所述疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在另一个实施方案中，位于胰岛素上两个以上蛋白酶位点内部的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，紧邻胰岛素上两个以上蛋白酶位点处的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，与胰岛素中两个以上蛋白酶位点相距两个氨基酸的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，与胰岛素上两个以上蛋白酶位点相距三个氨基酸的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，与胰岛素上两个以上蛋白酶位点相距至多四个氨基酸的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，与胰岛素上两个以上蛋白酶位点相距一个、两个或三个氨基酸或位于所述两个以上蛋白酶位点内部的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，与胰岛素上两个以上蛋白酶位点相距一个或两个氨基酸或位于所述两个以上蛋白酶位点内部的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在又一个实施方案中，紧邻胰岛素上两个以上蛋白酶位点或位于所述两个以上蛋白酶位点内部的两个以上疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。本发明的胰岛素类似物可具有与母体胰岛素净电荷不同的净电荷。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的净电荷比母体胰岛素净电荷带更多正电。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的净电荷比母体胰岛素净电荷带更多负电。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均正净电荷在水溶液中测量为0.5-5。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均正净电荷为1-5。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均正净电荷为1-4。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均正净电荷为1-3。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均正净电荷为2-3。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均负净电荷在水溶液中测量为-0.5--5。在一个实施方案中，本发明中的胰岛素类似物的平均负净电荷为-1--5。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均负净电荷在水溶液中测量为-1--4。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均负净电荷为-1--3。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的平均负净电荷为-2--3。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物可相对于人胰岛素溶解度增大。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH3-9下相对于人胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH4-8.5下相对于人胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH4-8下相对于人胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH4.5-8下相对于人胰岛素溶解度增大。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH5-8下相对于人胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH5.5-8下相对于人胰岛素溶解度增大。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH6-8下相对于人胰岛素溶解度增大。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH2-4下相对于人胰岛素溶解度增大。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物可相对于母体胰岛素溶解度增大。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH3-9下相对于母体胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH4-8.5下相对于母体胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH4-8下相对于母体胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH4.5-8下相对于母体胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH5-8下相对于母体胰岛素溶解度增大。在又一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH5.5-8下相对于母体胰岛素溶解度增大。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH6-8下相对于母体胰岛素溶解度增大。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物在pH2-4下相对于母体胰岛素溶解度增大。"在给定pH下溶解度增加"意指相对于与之比较的胰岛素(即人胰岛素或母体胰岛素)，本发明的胰岛素类似物在该溶液的pH下以更大浓度溶解于水溶液或緩冲液中。确定溶液中所含的胰岛素是否溶解的方法为本4页i或已知。在一个实施方案中，可将所述溶液在30,000g下离心20分钟，然后可通过RP-HPLC确定上清液中的胰岛素浓度。若在实验误差之内该浓度与起初用于制备该组合物中的胰岛素浓度相等，则所述胰岛素在本发明组合物中为完全溶解。在另一个实施方案中，本发明中组合物中的胰岛素的溶解度可以仅仅通过肉眼观察其中含有该组合物的容器来确定。若肉眼见到所述溶液澄清且无颗粒物质悬浮或沉淀在该容器的侧面/底部，则该胰岛素可溶。当比较以上测量结果时，本发明的胰岛素类似物相对于母体胰岛素效能和/或生物利用度可得以增加。测量胰岛素效能或生物利用度的标准测定法为本领域技术人员所已知，尤其包括(l)胰岛素放射性受体测定法，该测定中胰岛素的相对效能定义为置换50%与细胞膜(如鼠肝质膜部分)上存在的胰岛素受体特异性结合的1251-胰岛素所需的胰岛素对所需的胰島素类似物的比率；(2)用例如鼠脂肪细胞进行的脂肪生成作用测定法，该测定法中相对胰岛素效能定义为实现[3-3司葡萄糖转化成可有机萃取物(即脂类)的50%最大转化所需的胰岛素对所需的胰岛素类似物的比率；(3)在分离的脂肪细胞中进行的葡萄糖氧化测定法，该测定法中胰岛素类似物的相对效能定义为实现葡萄糖-1-[14。转化成[140)2]的50%最大转化的胰岛素对胰岛素类似物的比率；(4)胰岛素放射性免疫测定法，该方法通过测量胰岛素或胰岛素类似物与1251-胰岛素竟争结合特异性抗-胰岛素抗体的有效性，可以确定胰岛素类似物的免疫原性；和(5)其它测定法，这些测定法测量胰岛素或胰岛素类似物与动物血浆样品中的抗体的结合情况，例如具有特异性胰岛素抗体的ELISA测定法。可任选对本发明的胰岛素类似物作更多蛋白酶位点分析，这些位点可进一步经过将一个以上疏水性氨基酸取代为亲水性氨基酸。本发明胰岛素类似物可为与母体胰岛素相比在蛋白酶位点中具有至少两个亲水性氨基酸的胰岛素类似物(初次修饰胰岛素)，并且可为在初次修饰胰岛素的新蛋白酶位点中具有另外的至少一个氨基酸取代的胰岛素类似物，所述新蛋白酶位点中至少一个疏水性氨基酸被至少一个亲水性氨基酸取代。在一个实施方案中，提供了其中B链C端通过3-15个氨基酸与A链N端连接的胰岛素类似物。这样的胰岛素类似物在本文中称为"单链胰岛素，，或"SCr，具有B-C-A的一般结构，其中B为人胰岛素B链或其类似物或衍生物，A为人胰岛素A链或其类似物或衍生物，C为通常连接B30和Al的3-15个氨基酸残基的连接肽链。若所述B链为desB30链，则该连接肽将连接B29和Al。所述单链胰岛素含有如同在人胰岛素中正确定位的二硫键(三个)，即在CysA7与CysB7之间、CysA20与CysB19之间的二硫键以及CysA6与CysAl1之间的内部二硫键。在一个实施方案中，提供了其中B链C端通过3-7个氨基酸与A链N端连接的胰岛素类似物。本发明还涉及编码要求保护的胰岛素类似物的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及含有这样的核酸序列的载体和含有这样的核酸序列或载体的宿主细胞。在又一个实施方案中，本发明涉及制备胰岛素类似物的方法，所述方法包括(i)培养包含编码胰岛素前体的核酸序列的宿主细胞；(ii)从培养基中分离所述胰岛素前体，和(iii)通过体外酶转化将所述胰岛素前体转化为本发明的胰岛素类似物。在又一个实施方案中，本发明涉及制备胰岛素类似物的方法，所述(i)培养包含编码胰岛素前体的核酸序列的宿主细胞；(ii)从培养基中分离所述胰岛素前体，和(iii)将所述胰岛素前体转化为本发明的胰岛素类似物。本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为酵母宿主细胞，在另一个实施方案中，所述酵母宿主细胞选自酵母CSacc/mram^c&s)属。在另一个实施方案中，所述酵母宿主细胞选自S良酒酵母(Sacc/aramj;cesCW6W57'"6)种。本文所用"胰岛素类似物"意指通过缺失和/或取代在天然存在的胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基和/或通过插入至少一个氨基酸残基，从天然存在的胰岛素的一级结构(例如人胰岛素的一级结构)衍生而来的多肽。所述插入的和/或取代的氨基酸残基可以为可编码的氨基酸残基或其它天然存在的氨基酸残基。本发明的胰岛素类似物可为在一个以上位置突变的人胰岛素或其类似物。在一个实施方案中，基于已确定的蛋白酶切割位点根据蛋白酶稳定性增强来设计所述胰岛素类似物。在一个实施方案中，至少一个经过突变的切割位点在人胰岛素的选自以下的位置中B2-3、B6-7、B9-10、BlO画ll、B13-14、B14画15、B16-17、B22-23、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15和A19-20。在一个实施方案中，至少一个经过突变的切割位点在人胰岛素的选自以下的位置中B2-3、B6-7、B16-17、B22-23、B24-25和/或A19-20。在一个实施方案中，至少一个经过突变的切割位点在B22-23位中。在一个实施方案中，至少一个经过突变的切割位点在选自以下的位置中B9-10、BlO-ll、B13-14、B14-15、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15。在一个实施方案中，经过突变的切割位点在人胰岛素的两个以上选自以下的位置中B2-3、B6-7、B9-10、BlO誦ll、B13-14、B14曙15、B16-17、B22-23、B24-25、B25-26、A13誦14、A14-15和A19-20。在一个实施方案中，经过突变的切割位点在人胰岛素的两个以上选自以下的位置中B2-3,B6-7，B16-17、B22-23、B24-25和/或A19-20。在一个实施方案中，经过突变的切割位点在两个以上选自以下的位置中B9-10、BlO-ll、B13-14、B14-15、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15。在一个实施方案中，获得了本发明的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，所述胰岛素类似物的A链包含至少一个突变而所述胰岛素类似物的B链包含至少一个突变，其中所述A链中的至少一个突变位于一个以上选自以下的切割位点中A13-14、A14-15和A19-20,而所述B链中的至少一个突变位于一个以上选自以下的切割位点中B2-3、B6隱7、B9-10、BlO-ll、B13-14、B14陽15、B16画17、B22-23、B24-25和B25-26。在一个实施方案中，获得了本发明的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，所述胰岛素类似物的A链包含一个突变而所述胰岛素类似物的B链包含至少一个突变，其中所述A链中的一个突变位于切割位点A19-20中，而所述B链中的至少一个突变位于一个以上选自以下的切割位点中B2-3、B6-7、B16-17、B22-23和B24國25。在一个实施方案中，获得了本发明的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，所述胰岛素类似物的A链包含至少一个突变而所述胰鸟素类似物的B链包含至少一个突变，其中所述A链中的至少一个突变位于一个以上选自以下的切割位点中A13-14和A14-15，而所述B链中的至少一个突变位于一个以上选自以下的切割位点中B9-10、BlO-ll、B13-14、B14誦15、B24-25和B25-26。适用于取代的氨基酸残基以消除切割位点为目的来选择。在一个实施方案中，以增大溶解度为另外目的来选择氨基酸。在另一个实施方案中,所述增大的溶解度在pH范围3-9之内。在又一个实施方案中，所述增大的溶解度在pH范围4-8之内。所述胰岛素或胰岛素类似物可在一个以上位置被任何天然氨基酸取代，或任何天然氨基酸可插入母体胰岛素或胰岛素类似物中。为了方便，此处可编码的天然氨基酸名称后接括号内的常用三字母码和单字母码甘氨酸(Gly&G)、脯氨酸(Pro&P)、丙氨酸(Ala&A)、缬氨酸(Val&V)、亮氨酸(Leu&L)、异亮氨酸(Ile&I)、甲硫氨酸(Met&M)、半胱氨酸(Cys&C)、苯丙氨酸(Phe&F)、酪氨酸(Tyr&Y)、色氨酸(Trp&W)、组氨酸(His&H)、赖氨酸(Lys&K)、精氨酸(Arg&R)、谷氨酰胺(Gln&Q)、天冬酰胺(Asn&N)、谷氨酸(Glu&E)、天冬氨酸(Asp&D)、丝氨酸(Ser及S)和苏氨酸(Thr&T)。若由于打字错误而与通常使用的代码有所偏差，则采用通常使用的代码。在本发明胰岛素中存在的氨基酸优选为可以4皮核苷酸编码的氨基酸。在一个实施方案中，胰岛素或胰岛素类似物#皮Gly、Glu、Asp、His、Gln、Asn、Ser、Thr、Lys、Arg和/或Pro所取代，和/或Gly、Glu、Asp、His、Gln、Asn、Ser、Thr、Lys,Arg和/或Pro被插入至胰岛素或胰岛素类似物中。在一个实施方案中，胰岛素或胰岛素类似物被Glu、Asp、His、Gln、Asn、Lys和/或Arg取代，和/或Glu、Asp、His、Gln、Asn、Lys和/或Arg被插入至胰岛素或胰岛素类似物中。所述胰岛素类似物可为这样的胰岛素类似物其中B链的25位可从天然Phe残基修饰成His,并且A14位的天然Tyr取代为Glu、Asp或His。一种以上插入突变可包括desB30且所述胰岛素类似物可通过A链和/或B链的N端延伸或C端延伸来进一步修饰，例如用GGP、GGPP、GP或GPP延伸所述胰岛素类似物的A链N端和/或B链N端。进一步的实例包括但不限于插入突变，其中可插入一个或两个Pro残基至AO和/或B0位，可插入Leu至Bl位和/或可插入Glu至B32位。一种以上插入突变可从以下中选择A8位修饰为His、A21位修饰为Gly、Bl位修饰Glu或Gln、B16位修饰为Glu、B26位修饰为Asp、B27位修饰为Glu和/或B28位修饰为Asp。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物可选自A14E、B25H、desB30人胰岛素；A14H、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B1E、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B16E、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B25H、B28D、desB30人胰岛素;A14E、B25H、B27E、desB30人胰岛素；A14E、B1E、B25H、B27E、desB30人胰岛素;A14E、B1E、B16E、B25H、B27E、desB30人胰岛素;A8H、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A8H、A14E、B25H、B27E、desB30人胰岛素;A8H、A14E、B1E、B25H、desB30人胰岛素;A8H、A14E、B1E、B25H、B27E、desB30人胰岛素;A8H、A14E、B1E、B16E、B25H、B27E、desB30人胰岛素;A8H、A14E、B16E、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B25H、B26D、desB30人胰岛素；A14E、B1E、B27E、desB30人胰岛素；A14E、B27E、desB30人胰岛素；A14E、B28D、desB30人胰岛素；A14D、B25H、desB30人胰岛素；A(-1)P、A(O)P、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B(画1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰岛素；A(國1)P、A(O)P、A14E,B(-1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B25H、B30T、B31L、B32E人胰岛素；A14E、B25H人胰岛素；A14E、B16H、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B10P、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B10E、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B4E、B25H、desB30人胰岛素;A14H、B16H、B25H、desB30人胰岛素;A14H、B10E、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素;A13H、A14E、B10E、B25H、desB30人胰岛素;A13H、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30人胰岛素;A14E、B24H、B25H、desB30人胰岛素;A8H、A14E、B10D、B25H、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A8H、A14E、B10D、B25H-酰胺、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、B25H、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素、A14E、B25H-酰胺、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B26G、B27G、B28G、desB30人胰岛素；A14E、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素、A14E、B25H、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、A18Q、A21Q、B3Q、B25H、desB30人胰岛素;A14E、A18Q、A21Q、B3Q、B25H、B27E、desB30人胰岛素；A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30人胰岛素；A13H、A14E、B1E、B25H、desB30人胰岛素;A13N、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A13N、A14E、B1E、B25H、desB30人胰岛素;A(-2)G、A(曙1)P、A(O)P、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B(-2)G、B(-1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰岛素;A(曙2)G、A(-1)P、A(O)P、A14E、B(-2)G、B(-1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B27R、B28D、B29K、desB30人胰岛素;A14E、B25H、B27R、B28D、B29K、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B26T、B27R,B28D、B29K、desB30人胰岛素;A14E、A18K、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、A22K、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、A22K、B25H、desB30人胰岛素；A14E、desBl、desB2、desB3、B25H-酰胺、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、desBl、desB2、desB3、B25H、desB27、desB28、desB29,desB30人胰岛素；A14E、desBl、desB2、desB3、B16H、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B27R、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B27H、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B27R、desB28-B30人胰岛素；A14E、B25H、B27H、desB28-B30人胰岛素；A14E、B25H、B27E、desB28-B30人胰岛素；A14E、B25H、B27K、desB28-B30人胰岛素；A14E、B27K、desB28-B30人胰岛素；A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30人胰岛素;A13E、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B25H、desB30人胰岛素；A15E、A14E、B25H、desB30人胰岛素；A13E、B25H、desB30人胰岛素；A12E、B25H、desB30人胰岛素；A15E、B25H、desB30人胰岛素；A14E、B25H、desB27、desB30人胰岛素；A14E、B25H、B26D、B27E、desB30人胰岛素;EEAEAEAPK-B(1-29)-B25H-AAK-A(1曙21)-A14E人胰岛素；EEAEPK-B(l-29)-B25H-DGK-A(l-21)-A14E人胰岛素；B(1-29)-B25H-AAK-A(1-21)-Al4E人胰岛素；B(1-29)-B1E、B25H-AAK-A(1國21)-A14E人胰岛素；B(l-29)-B25H、B27E-AAK-A(1-21)-A8H、A14E人胰岛素；B(l-29)-BlE、B25H、B27E-AAK-A(1-21).A8H、A14E人胰岛素；EEAEAEAPK-B(l-29)-B16E、B25H-AAK-A(1-21)-A8H.A14E人胰岛素；B(l-29)-B25H、B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E人胰岛素；B(l-29)-B16E、B25H、B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E人胰岛素；B(l-29)-B25H、B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)画A8H,A14E人胰岛素；A14E、B25H、B27R、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27N、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27D、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27Q、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27E、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27G、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27H、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27K、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27P、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27S、desB30人胰岛素A14E、B25H、B27T、desB30人胰岛素A13R、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13N、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13D、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13Q、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13E、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13G、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13H、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13K、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13P、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13S、A14E、B25H、desB30人胰岛素A13T、A14E、B25H、desB30人胰岛素A14E、B16R、B25H、desB30人胰岛素A14E、B16D、B25H、desB30人胰岛素A14E、B16Q、B25H、desB30人胰岛素A14E、B16E、B25H、desB30人胰岛素A14E、B16H、B25H、desB30人胰岛素A14R、B25H、desB30人胰岛素;A14N、B25H、desB30人胰岛素A14D、B25H、desB30人胰岛素A14Q、B25H、desB30人胰岛素A14E、B25H、desB30人胰岛素;A14G、B25H，desB30人胰岛素；A14H、B25H、desB30人胰岛素；A8H、B10D、B25H人胰岛素和A8H、A14E、B10E、B25H、desB30人胰岛素。胰岛素是由胰脏中P-细胞分泌的多肽激素，由A和B两条多肽链构成，所述A链和B链由两个链间二碌u键连接。此外，所述A链特征为有一个链内二硫键。该激素由单链前体胰岛素原(前胰岛素原)合成，所述前胰岛素原由24个氨基酸的前肽后接包含86个氨基酸的胰岛素原组成，其结构为前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C为31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg为用于从A链和B链切去连接肽的切割位点。主要有三种方法用于在微生物中制备人胰岛素。两种涉及大肠杆菌(Esc/ien'c/n'aco")，其一通过在细胞质中表达大融合蛋白(Frank等(1981)Peptides:Proceedingsofthe7thAmericanPeptideChemistrySymposium(Rich&Gross编辑),PierceChemicalCo.,Rockford,III.第729-739页)，或使用信号肽以使之能够分泌至周质空间(Chan等(1981)PNAS78:5401-5404)。第三种方法利用酿酒酵母CSacc/ara/wj;cMcerev^ae)使胰岛素前体分泌到培养基中(Thim等(1986)PNAS83:6766-6770)。现有技术公开了许多在大肠杆菌(￡".co/Z)或酿酒酵母(&cc/mram;;c&scerev&ae)中表达的胰岛素前体，参阅美国专利第5,962,267号、WO95/16708、EP0055945、EP0163529、EP0347845和EP0741188。通过正如例如美国专利第6500645号中所公开的众所周知的技术，通过在合适的宿主细胞中表达编码所讨论的胰岛素类似物的DNA序列来制备所述胰岛素类似物。所述胰岛素类似物或者直接表达，或者作为在B链有N端延伸部分的前体分子表达。所述N端延伸部分可具有提高直接表达产物产量的功能，并且可具有至多15个氨基酸残基的长度。所述N端延伸部分将在从液体培养基分离后于体外被切割，因此紧邻B1处具有切割位点。适于本发明的这类N端延伸部分在美国专利第5，395，922号和欧洲专利第765，395A号中公开。经过分离的胰岛素类似物可通过熟知的酰化方法在所需位置酰化，这样的胰岛素类似物的实例在例如公布号为EP214826、EP375437和EP383472的欧洲专利申请中已有描述。编码的各胰岛素类似物多肽的核酸序列可由已建立的标准方法通过合成来制备，例如由Beaucage等(1981)TetrahedronLetters22:1859-1869中所描述的亚磷酰胺法(phosphoamiditemethod)、或Matthes等(1984)EMBOJournal3:801-805中描述的方法。根据所述亚磷酰胺法，寡核苷酸经合成(例如在自动DNA合成仪中)、纯化、复性和连接以形成合成DNA构建体。当前制备所述DNA构建体的优选方法是通过聚合酶链式反应(PCR)。所述核酸序列还可为混合的基因组、cDNA和合成起点的核酸序列。例如，可使编码前导肽的基因组序列或cDNA序列与编码A链和B链的基因组序列或cDNA序列连接，之后可依照熟知方法通过插入编码用于同源重组的所需氨基酸序列的合成寡核苷酸来对DNA序列的位点进行修饰，或者优选使用合适的寡核苷酸通过PCR制备所需序列。能够在所选的微生物或宿主细胞中复制且携带有编码所讨论的胰岛素类似物多肽的核酸序列的重组载体中可为自主复制型载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立于染色体复制之外，例如有质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。所述载体可包含任何确保自主复制的元件。或者，所述载体可在引入所述宿主细胞中时整合进基因组并随它所整合的染色体一同复制。此外，可使用单个载体或质粒、或者共同含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两个以上载体或质粒、或者转座子。所述载体可为线型的或闭合环状质粒，优选含有允许栽体稳定整合进宿主细胞基因组或允许所述载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。在一个实施方案中，所述重组表达载体能在酵母中复制。使所述载体能在酵母中复制的序列的实例为酵母质粒2pm复制基因REP1-3和复制起点。所述载体可含有一个以上允许易于选择转化细胞的选择标记。选择标记为基因，该基因产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、原养型转换为营养缺陷型等。细菌选择标记的实例有枯草芽孢杆菌(jBad〃wssi/6rifo)或地衣芽孑包杆菌(5acz7/ws//c/em》rmh)中的t/a/基因、或赋予抗生素抗性如青霉素、庆大霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于丝状真菌宿主细胞中的选择标记包括aw必(乙酰胺酵)、wg万(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶)和(邻氨基苯曱酸合成酶)。适用于酵母宿主细胞的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。非常适用于酵母的选择标记为粟酒裂殖酵母(Sc/n'zosaccAaram少casTPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。在载体中，所述核酸序列可操作地与合适的启动子序列连接。所选包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，且可从编码与宿主细胞同源或异源的胞内或胞外多肽的基因中获得。用于引导细菌宿主细胞转录的合适启动子的实例为从以下基因中获得的启动子大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(&^ptom少cescoe/z'co/or)琼脂糖酶基因(&gj)、枯草芽孢杆菌(^^7/wswZ^'fc)果聚糖蔗糖酶基因Csac5)、地衣芽孢杆菌CSac/〃w"cAem/omH》a淀粉酶基因(amjA)、嗜热脂肪芽孢杆菌C5ad〃船WearaAermo//n7w》麦芽糖淀粉酶基因(aw少A/)、解淀粉芽孑包杆菌(5aa'〃1^am少/o/z々t^/acz.ews)a淀粉酶基因(am少g)、和地衣芽孢杆菌(5ac/〃tw/z'cAem/om^)青霉素酶基因(pe"尸)。用于引导丝状真菌宿主细胞转录的合适启动子的实例从基因为从以下基因中获得的启动子米曲霉(As;^^〃wsoo^ae)TAKA淀粉酶基因、曼赫根毛菌CR/^omwcorm/e/^')天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉04s;wgz7/1^中性a淀粉酶基因和黑曲霉(J^ergZ〃ws酸稳定性a淀粉酶基因。在酵母宿主中，有用的启动子为酿酒酵母OSaccAaram戸scere由ae)Mal、TPI、ADH或PGK启动子。所述核苷酸构建体也通常可操作地与合适的终止子连接。在酵母中，合适的终止子为TPI终止子(Alber等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。用于分别连接表达载体中所含的单独核酸序列(例如编码所需胰岛素类似物多肽的DNA、启动子和终止子)，并将它们插入含有在所选宿主中复制的必需信息的合适载体中的方法已为本领域中技术人员所熟知。应能理解的是，构建所述载体可通过首先制备含有编码本发明胰岛素类似物多肽的全DNA序列的DNA构建体，再将该片断插入至合适的表达载体中；或者通过先后插入含有单独元件(如信号肽、前肽、连接肽、A和B链)遗传信息的DNA片断，并随后连接。包含这样的核酸序列的载体被《1入所述宿主细胞，由此所述载体作为染色体整合体纟皮保留，或作为之前所描述的染色体外自主复制载体被保留。术语"宿主细胞"包含亲代细胞的任何后代，后者由于复制中发生突变而与所述亲代细胞不同。所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。可用的单细胞为细菌细胞，如革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌细胞C8ac"/t^cell)、链霉菌细胞(&^ptom;;c^cell);或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(五.co/0和假单胞菌(尸sewcbmowcws;)。真核细胞可为哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。在优选的实施方案中，所述宿主细胞为酵母细胞。用于本发明方法的酵母生物体可为任何在培养中产生大量本发明单链胰岛素的合适酵母生物体。合适的酵母生物体的实例为选自以下的酵母种酿酒酵母0focc/mra附7casce"vWae)、克鲁弗酵母(Sacc/arawy;cesA:/w_yvw')、粟酒裂殖酵母(/Sc/^msacc/ar簡;;cespom6e)、葡萄汁酵母(Sacc/joram;;ceswvan/m)、乳酸克鲁维酵母(A7w_yveram_yc^s/acris)、多形汉逊酵母(7/a"se"M/a;o(y附or;^")、巴斯德毕赤酵母(尸/c/n'a/a^on》、曱醇毕赤酵母(/Vc/n'ameAa"o/z'ca)、克鲁弗毕赤酵母(尸Zc/^射矽ven')、亚罗解脂酵母(7amnW"/^o/Wc")、假丝酵母(OwJzWas/.)、产朊假丝酵母(Cam/Wawrifc)、可可^(叚丝酵母(Cflm/Wflcacao/)、；也霉((7eo^7'c/mm5^.)和发酵地霉((7eoWc/wmy^7wewtow力的菌林。举例来说可通过制备原生质体，随后用本身已知的方法转化来实施所述酵母细胞的转化。用于培养所述细胞的培养基可为适用于培养酵母生物体的任何常规培养基。被分泌的胰岛素类似物多肽(大部分以恰当加工的形式存在于该培养基中)可利用常规方法从所述培养基中回收，所述常规方法包括以下步骤通过离心、过滤从培养基分离出酵母细胞或者通过离子交换基质或反相吸附基质捕获胰岛素前体；用盐例如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质组分；随后通过诸如离子交换层析、亲和层析等多种层析方法纯化。药物组合物本发明的另一目的是提供包含浓度为0.1mg/ml-500mg/ml的本发明胰岛素类似物的药物制剂，其中所述制剂的pH为2.0-10.0。所述制剂可进一步包含蛋白酶抑制剂、緩冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂为水性制剂，即含水制剂。这样的制剂通常为溶液或混悬液。本发明的另一个实施方案中，所述药物制剂为水溶液。术语"水性制剂"定义为包含至少50%重量比水的溶液。同样地，术语"水溶液"定义为包含至少50%重量比水的溶液，而术语"水混悬液"定义为包含至少50%重量比水的混悬液。在另一个实施方案中，所述药物制剂为医师或患者在^f吏用前向其中加入溶剂和/或稀释剂的冻干制剂。在另一个实施方案中，所述药物制剂为无需预先溶解《更可^f吏用的干燥制剂(例如冷冻干燥或喷雾干燥)。在又一个实施方案中，本发明涉及包含本发明胰岛素类似物的水溶液及緩冲液的药物制剂，其中所述胰岛素类似物的浓度为0.1mg/ml或以上，且其中所述制剂的pH为约2.0-约10.0。意欲用于口服的制剂可依照任何已知方法制备，这样的制剂可含有一种以上选自以下的作用剂甜^^未剂、賴^木剂、着色剂和防腐剂，以便提供药学上精致适口的制剂。片剂可含有与适于制备片剂的、无毒且药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可为例如惰性稀释剂，例如甘露醇、麦芽糊精、高岭土、碳酸钩、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂例如玉米淀粉；粘合剂，例如淀粉、明胶、聚合物或阿拉伯胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。所述片剂可为未包衣片剂，或可通过已知技术包衣以延迟所述药物活性多肽的崩解或释放。口服给药的本发明制剂可根据药物化学上的熟知方法来制备和给予，参见Remington'sPharmaceuticalSciences,第17版(A.Osol编辑，1985)。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物可通过固体剂型如片剂或胶嚢的方式给予。所述片剂可通过湿法制粒、千法制粒、直接压片法或熔融法制粒来制备。可利用常规压片技术制备本发明的片剂。常规制备方法包括将胰岛素类似物、水溶性稀释剂、亲水粘合剂和任选的一部分崩解剂共混。然后该共混物用亲水粘合剂的水溶液或亲水粘合物和表面活性剂的水溶液来制粒，必要时碾磨该混合物。干燥并减小所述颗粒至合适尺寸。其它任何成分，比如润滑剂(例如硬脂酸镁)和附加的崩解剂被加入该颗粒中并混合。然后利用常规压片机如旋转式压片机将该混合物压缩至合适尺寸和形状。所述片剂可通过本领域熟知技术进行膜包衣。口月M吏用的制剂可为硬明胶胶嚢或软明胶胶嚢，其中活性成分与惰性固态稀释剂混合，所述固体稀释剂例如甘露醇、麦芽糊精、碳酸钙、碳酸钠、乳糖、高岭土、磷酸4丐或磷酸钠；或软明胶胶嚢，其中活性成分与水或油性介质混合，所述油性介质如花生油、液态石蜡或橄榄油。可利用常规技术制备本发明的胶嚢。常规制备方法包括将治疗活性肽、藻酸盐、水溶性稀释剂、亲水性粘合剂和任选的一部分崩解剂共混。然后该共混物用亲水性粘合剂的水溶液或亲水粘合剂和表面活性剂的水溶液来制粒，必要时碾磨该混合物。干燥并减少所述颗粒至合适尺寸。其它任何成分比如润滑剂被加入该颗粒中并混合。然后利用常规胶嚢填充机将得到的混合物填入合适大小的硬皮明胶胶嚢中。在本发明的又一个实施方案中，所述緩沖剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氬钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟曱基)氨基曱烷、N,N-二(羟乙基)甘氨酸、麦黄酮、苹果酸、丁二酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定緩冲液中的每一种构成本发明的备选的实施方案。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。所述防腐剂以足以获得防腐效果的含量存在。药物制剂中防腐剂的量为技术人员所熟知且可通过例如本领域的文献和/或例如市售产品中的防腐剂的已知量来确定。这些特定防腐剂中的每一种构成了本发明的备选实施方案。药物组合物在防腐剂中的应用为技术人员所熟知。为了方i更，作出对Remington:77eSdewceam/尸rac"ce0/尸/zamac;;,第19版，1995的引用。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含螯合剂。螯合剂在药物组合物中的应用为技术人员所熟知。为了方便，作出对Remington:5Wewceawc/尸rac"ce0/尸Aaw^c3;，第19片反,1995的引用。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含稳定剂。本文所用术语"稳定剂"意指向含有多肽的药物制剂添加的化学药品，目的为了使所述肽稳定，即为了延长这样的制剂的贮存期和/或使用时间。稳定剂在药物组合物中的应用为技术人员所熟知。为了方便，作出只于.Remington:TAe^SWewceawdi^ac/z'ce。/尸Aanwaqy,第19片反，1995的引用。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含表面活性剂。本文所用术语"表面活性剂"意指由水溶性(亲水)部分(头部)和脂溶性(亲脂的)片断组成的任何分子或离子。表面活性剂优选在界面堆积，在该界面中所述亲水性部分朝向水(亲水相)而所述亲脂性部分朝向油相或疏水相(即玻璃(glass)、大气、油等)。表面活性剂开始形成胶束时的浓度称为临界胶束浓度或CMC。此外，表面活性剂降低了液体的表面张力。表面活性剂也称为两亲化合物。术语"去垢剂"通常用作表面活性剂的同义词。表面活性剂在药物组合物中的应用为技术人员所熟知。为了方便，参见为了方便，作出对Remington:7Tze5Wewce朋J/V。c"ce0/尸/^rmac乂第19版，1995的引用。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含蛋白酶抑制剂。可能的是，本发明胰岛素类似物药物制剂中可存在其它成分。这样的另外的成分可包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度改性剂、螯合剂、金属离子、.油质溶媒(oleaginousvehicle)、蛋白质(如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和兼性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。显然这样的另外的成分不应对本发明的药物制剂的总体稳定性有不利影响。含有本发明的胰岛素类似物的药物组合物可给予到需要这样的治疗患者的若干位点，例如给予到局部位点，例如皮肤和粘膜位点；旁路吸收位点，例如给予到主动脉中、血管中、心脏中；和涉及吸收的位点，例如给予到皮内、皮下、肌内或腹内。本发明的药物制剂的给予可通过几种途径向需要这样的治疗的患者给药，所述途径例如舌部给药、舌下给药、含化给药、口腔内给药、口服给药、胃肠内给药、鼻部给药、肺部给药如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮给药、皮肤给药、透皮给药、阴道给药、直肠给药、眼部给药如通过结膜、输尿管给药和胃肠外给药。本发明的组合物可以以若干剂型给予，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合型乳剂、泡沫剂、药膏、糊剂、硬膏、软膏、片剂、包衣片剂、冲洗剂、胶嚢如硬明胶胶嚢和软明胶胶嚢、栓剂、直肠用胶嚢、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、气溶胶、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用冲洗剂、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏、注射液、原位转化溶液剂如原位胶凝剂、原位沉降剂、原位沉淀剂、原位结晶剂、專命液剂和埋纟直剂。本发明的组合物可进一步如通过共价、疏水和静电相互作用化合或附着于药物载体、药物递送系统和改良药物递送系统，以便进一步增强胰岛素类似物化合物的稳定性，提高生物利用度，增大溶解度，减少不良作用，实现本领域中的技术人员所熟知的按时疗法和提高患者顺应性或其任何组合。本发明组合物的可用于固体制剂、半固体制剂、粉状制剂和溶液制剂，通过使用例如定量吸入器、干粉吸入器和雾化吸入器来肺部给予胰岛素类似物，所有这些仪器都为本领域技术人员所熟知。本发明组合物的可用于受控、持续、延长、延迟和緩慢释放递药系统的制剂。更具体地但不限于，组合物可用于本领域中技术人员所熟知的胃肠外控释系统和緩释系统的制剂(两种系统均导致给药次数成倍减少)。更优选的是，控释系统和緩释系统经皮下给予。在不限制本发明范围下，有用的控释系统和组合物的实例为水凝胶、油凝胶、液晶、聚合物胶束、微球和纳米微粒。制备用于本发明组合物的控释系统的方法包括但不限于结晶、冷凝、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压均质化、包嚢化、喷雾干燥、微胶嚢化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以制备微球、挤压和超临界流体法。对以下文献作出全面参考HandbookofPharmaceuticalControlledRelease(Wise,D.L.编辑MarcelDekker,NewYork,2000)和DrugandthePharmaceuticalSciences第99巻ProteinFormulationandDelivery(MacNally,E.J.,ed.MarcelDekker,NewYork,2000)。胃肠外给药可通过注射器、任选笔型注射器经皮下注射、肌内注射、腹膜内注射或静脉注射来进行。或者，胃肠外给药可以依靠输注泵进行。另一个选择为以下组合物其可为以鼻用喷雾或肺部喷雾形式给予所述胰岛素类似物化合物的溶液剂或混悬剂。作为又一个选择，含有本发明胰岛素类似物化合物的药物组合物还可以适合透皮给药，例如通过无针注射或贴剂(任选离子导入贴剂)来进行；或经粘膜给药，例如口腔含化给药。本发明胰岛素类似物可以在溶媒或载体中作为溶液、混悬液或干粉，通过使用适合肺部递药的任何已知类型i殳备经肺部途径给予。这些肺部途径给药的实例包括但不限于用于肺部递药的三种常规类型的气溶胶发生器，可包括喷射或超声雾化吸入器、定量吸入器或干粉吸入器(Cf.YuJ,ChienYW.Pulmonarydrugdelivery:PhysiologicandmechanisticaspectsCritRevTherDrugCarrSys14(4)(1997)395-453)。在另一个实施方案中，可通过任何已知的雾化技术例如喷雾作用，使气溶胶微粒的MMAD达到少于lO)im，更优选l-5pm，最优选l-3pm，来使该制剂气雾化。优选粒度是基于递药至肺深部的最有效尺寸，在该部位中蛋白吸收最好(参考EdwardsDA,Ben-JebriaA,LangerA,运用多孔性吸入大^[效粒的肺部递药的最新进展(Recentadvancesinpulmonarydrugdeliveryusinglarge,porousinhaledparticles).JApplPhysiol84(2)(1998)379-385)。包含所述胰岛素类似物化合物的肺部制剂在肺深部的沉积可任选通过改良吸入技术来进一步最优化，例如但不限于放慢吸入流速(如30L/min)、闭气和定时刺激。术语"稳定制剂"意指物理稳定性提高、化学稳定性提高或物理和化学稳定性提高的制剂。本文所用术语蛋白制剂的"物理稳定性"意指蛋白形成生物失活和/或不溶性蛋白凝聚物的趋向，所述趋向由以下原因引起所述蛋白暴露在热-机械压力下和/或与去稳定的界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用。水性蛋白制剂的物理稳定性依靠以下方法来评估使装在合适容器(如药筒或小瓶)内的所述制剂在不同温度下接受不同时间的机械/物理压力(如搅动)后目测和/或测定浊度。所述制剂的目测在暗背景下集中的锐光中进行。制剂的浊度是通过目测评定混浊程度的等级来表征，例如按0-3的等级(不显示混浊的制剂与目测得分0相对应，而在日光下显示可见混浊的制剂与目测得分3相对应)。当制剂在曰光下显示出可见混浊时，其归类为与蛋白质凝聚有关的物理不稳定。或者，制剂的浊度可通过技术人员所熟知的简单浊度测定法来评估。水性蛋白制剂的物理稳定性还可以通过使用所述蛋白构象态的光谱因子或探针来评估。所述探针优选为优先与蛋白的非天然构象异构体结合的小分子。蛋白结构的小分子光谱探针的实例为碌J黄素T。减磺素T是荧光染料，已广泛用于^r测淀粉状原纤维。在原纤维的存在下，以及还有可能存在其它蛋白构型下，当疏磺素T与原纤维蛋白结构结合时，在约450nm处产生新的激发最大值，并在约482nm处激发增强。未结合的磁磺素T在所述波长基本无焚光。其它小分子也可用作蛋白结构从天然状态至非天然状态变化的探针。举例来说，"疏水补丁"探针优先与外露的蛋白疏水补丁结合。所述疏水补丁通常包埋在天然状态蛋白的三级结构中，但当蛋白开始展开或变性时变得外露。这些小分子光镨探针的实例为芳香族疏水性染料如蒽、吖啶或菲咯啉等。其它光谱探针为金属-氨基酸络合物，如疏水性氨基酸的钴金属络合物、所述氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、曱硫氨酸和缬氨酸等。本文所用术语蛋白制剂的"化学稳定性"意指蛋白结构的化学共价变化，导致形成相对于天然蛋白结构潜在生物效能降低和/或潜在免疫原性增强的化学降解产物。各种化学降解产物的形成取决于天然蛋白的类型和性质以及该蛋白所暴露的环境。消除化学降解几乎不可能完全避免，在蛋白制剂储藏和使用中往往见到化学降解产物量的增加，这正如本领域中技术人员所熟知。大部分蛋白容易脱酰胺，即谷氨酰胺酰基残基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基被水解形成游离羧酸的过程。其它降解途径包括高分子量转化产物的形成，其中两个以上蛋白分子彼此通过转酰胺作用和/或二硫键相互作用共价结合，导致共价结合的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物形成0Sto&7^q/"尸TOW"。氧化作用(例如曱硫氨酸残基的氧化作用)可被认为是化学降解的另一变体。蛋白制剂的化学稳定性可通过以下方法来评估，经暴露于不同环境条件(降解产物的形成可通常由于如温度的增加而加快)后，测量在不同时间点的化学降解产物的量。各种单独降解产物的量通常通过运用各种色谱技术(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)依照分子大小和/或电荷分离降解产物来确定。因此，如上文所概述，"稳定制剂"意指物理稳定性提高、化学稳定性提高或物理和化学稳定性提高的制剂。通常，制剂在使用和储藏期间(遵照推荐的使用和储藏条件)，直到有效期前必须保持稳定。在本发明的一个实施方案中，包含所述胰岛素类似物化合物的药物制剂在超过6周的使用期和超过3年的储藏期内稳定。在本发明的另一个实施方案中，包含所述胰岛素类似物化合物的药物制剂在超过4周的使用期和超过3年的储藏期内稳定。在本发明的另一个实施方案中，包含所述胰岛素类似物化合物的药物制剂在超过4周的使用期和超过两年的储藏期内稳定。在本发明的又一个实施方案中，包含所述胰岛素类似物化合物的药物制剂在超过2周的使用期和超过两年的储藏期内稳定。水性混悬剂可含有与适用于制备水性混悬剂的赋形剂混合的活性化合物。油性混悬剂可通过使活性成分悬浮在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；或矿物油如液体石蜡中来配制。所述油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂腊、固体石蜡或鲸蜡醇。可添加如上文所述的甜味剂以及矫味剂以提供适口的口服制剂。这些制剂可通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。适用于通过加入水制备水性混悬剂的可分散粉剂和颗粒剂提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种以上防腐剂混合的活性化合物。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂已通过上述的来举例说明。还可存在附剂、矫味剂和着色剂。包含本发明化合物的药物制剂还可以以油包水型乳剂的形式。油相可为植物油如橄榄油、花生油；或矿物油如液状石蜡；或其混合物。合适的乳化剂可为天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或西黄蓍胶；天然存在的磷脂如大豆磷脂、卵磷脂；和酯类或衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏S旨，例如脱水山梨醇单油酸酯；和所述偏酯与乙二醇的縮合产物，如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。所述乳剂还可含有甜味剂和矫味剂。糖浆剂和酏剂可用甜味剂来配制，所述甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。这样的制剂也可包含緩和剂、防腐剂、矫味剂和着色剂。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含渗透促进剂。胆盐和脂肪酸最常被认为用以增大胃肠道中上皮细胞衬里的脂质双层膜的口服渗透性。一般而言，渗透促进剂通过可逆改变膜整体性以增加大分子的细胞旁路运输(paracellulartransport)和跨细胞运输。所述胆盐选自胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、熊去氧胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐和鹅去氧胆酸盐。所述脂肪酸选自短、中和长链脂肪酸，例如正辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和硬脂酸等。其它增强剂可为表面活性剂例如单酸甘油酯、聚氧乙烯酯、山梨坦表面活性剂(非离子型)和硫酸盐(阴离子型)。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含粘膜粘附聚合物(mucoadhesivepolymer)。通过使用这样的粘膜粘附聚合物，可使得所述递药系统与胃肠道粘膜紧密接触。剂型与所述膜的紧密接触似乎是有利的，因为可避免在递送系统和吸收膜途中治疗活性多肽受酶解。此外，可以提供吸收膜上的阶段浓度梯度以向药物的被动吸收带来驱动力。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂进一步包含蛋白水解酶抑制剂，以进一步克服酶的障碍并实现所述治疗活性多肽的递送，所氨肽酶抑制剂、阿马他定(amastatin)、贝他汀(bestatin)、硼亮氨酸(boroleusine)和嘌呤霉素(puromycin)。蛋白酶抑制剂的实例为羟乙酸钠、曱磺酸卡莫司他(camostatmesilate)、杆菌肽(bacitracin)、大豆胰蛋白酶抑制剂和抑肽酶(aprotinin)。包埋和包嚢化是用于治疗活性多肽的递药系统以优化递送性质(包括针对酶解的保护作用)的技术。包埋或包嚢化的形式可以为聚合物释药制剂系统例如水凝胶和纳米胶嚢/微球体，和脂类递药系统如脂质体和微乳剂。本发明的制剂可以几种剂型给予，例如作为溶剂剂、混悬剂、微米级和纳米级混悬剂、乳剂、微乳剂、复合型乳剂、泡沫剂、药膏、糊剂、软膏、片剂、包衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、颊含片、胶嚢如硬明胶胶嚢和软明胶胶嚢、粉剂、颗粒剂、原位转化溶液剂如原位胶凝剂、原位沉降剂、原位沉淀剂、原位结晶剂、胃漂浮制剂如漂浮混悬剂、漂浮片剂等。在另一个实施方案中，本发明涉及用作药物的本发明胰岛素类似物。在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物用作制备治疗或预防以下疾病的药物高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖症、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、冠心病和其它心血管病症、肠炎综合症、消化不良和胃溃疡。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物用作延迟或预防II型糖尿病病程的药物。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物用作起以下作用的药物减少食物摄入、减少(3-细胞凋亡、增强(3-细胞功能和增大卩-细胞群和/或用于恢复(3-细胞的葡萄糖敏感性。在本发明的一个实施方案中，提供了用作以下药物的本发明衍生物用于治疗或预防以下疾病的药物高血糖症、II型糖尿病、葡萄、I型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病症、肠炎综合症、消化不良和胃溃疡；或者用于延迟或预防n型糖尿病病程的药物；或者用于起以下作用的药物减少食物摄入、减少(3-细胞凋亡、增强(3-细胞功能和增大p-细胞群和/或恢复p-细胞的葡萄糖敏感性。在本发明的又一个实施方案中，提供了用于治疗或预防以下疾病的方法高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、月巴胖症、高血压、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病症、中风、肠炎综合症、消化不良和胃溃疡；或用于延迟或预防II型糖尿病病程的方法；或起以下作用的方法减少食物摄入、降低(3-细胞凋亡、增强(3-细胞功能和增大卩-细胞数量、和/或恢复提供的p-细胞葡萄糖敏感性，所述方法包括向需要这样治疗的患者给予有效量的用于这种治疗的本发明胰岛素类似物。本发明胰岛素类似物的治疗还可与第二种或更多种有药理活性的物质联合，例如所述物质选自抗糖尿病药、抗肥胖症药、食名欠调节药、抗高血压药、用于治疗和/或预防由糖尿病引起或与之相关的并发症的药物和用于治疗和/或预防由肥胖症^1起或与之相关的并发症和病症的药物。这些有药理活性的物质的实例为GLP-1和GLP-1衍生物及类似物、GLP-2和GLP-2衍生物及类似物、Exendin-4和Exendin-4衍生物及类似物、胰岛素淀粉样多肽和胰岛素淀粉样多肽衍生物及类似物、磺脲、双胍类、氯茴苯酸类、葡糖苷酶抑制剂、高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽酰肽酶IV)抑制剂、参与葡萄糖异生和/或糖原分解刺激的肝酶抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、修饰脂类代谢作用的化合物例如抗高血脂药物(如HMGCoA抑制剂(他汀类药物))、减少食物摄入的化合物、RXR激动剂和作用于p-细胞中ATP依赖性钾通道的药物；考来烯胺(Cholestyramine)、考来替泊(colestipol).氯贝丁酯(clofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普罗布考(probucol)、右旋曱状腺素(dextrothyroxine)、那格列奈(neteglinide)、瑞格列奈(repaglinide);P-阻断剂诸如阿普洛尔(alprenolol)、阿替洛尔(atenolol)、瘗吗洛尔(timolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)和美托洛尔(metoprolol);ACE(血管紧张素转换酶)抑制剂例如贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖i若普利(lisinopril)、alatriopril、p奎那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril);锌通道阻断剂例如硝苯地平(nifedipine)、非洛地平(felodipine)、尼卡地平(nicardipine)、j尹拉地平(isradipine)、尼莫地平(nimodipine)、；也尔石危草(diltiazem)和维才立帕米(verapamil);和a曙阻断剂诸如多沙峻口秦(doxazosin)、乌拉地尔(urapidil)、旅哇口秦(prazosin)和特拉峻溱(terazosin);CART(可卡因安非他明调节转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、阿立新拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)激动剂、CRFBP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮素激动剂、P3激动剂、MSH(促黑素细胞激素)激动剂、MCH(黑素细胞聚集激素)拮抗剂、CCK(胆嚢收缩素)激动剂、血清素重再摄取抑制剂、血清素和去曱肾上腺素再摄取抑制剂5-羟色胺和去曱肾上腺素化合物的混合物、5HT(血清素)激动剂、铃蟾肽激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促曱状腺素释放激素)激动剂、UCP2或3(解偶联蛋白2或3)调节物、瘦蛋白激动剂、DA激动剂(溴隐亭(bromocriptine)、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类视黄醇X受体)调节剂、TRP激动剂、组胺H3拮抗剂、胃泌素和胃泌素类似物及书1"生物。应能理解的是，具有一种以上上述化合物的本发明的衍生物与任选一种以上有药理活性的物质的任意适合组合被认为落入本发明范围之内。本x/y举^摩才參者jt妖r逸括力^參、爭W诈请关>爭,以^奎谬力容遞i2^/^7潜合到本jt#，^提凌就如吝參孝Jt妖卓^舁谬^;《效遞^//^7潜合封本^:—并i^全命^容^本X^被激迷〈法/，摩译^T^處义程^j。本jt摩^^摩f标趟和^标众乂^才4'虔對本发效。众众力7爿if必賴迷该发银而^不炎A力^:发'效志厲W虔斜，餘#^说效。说效力'*芋不^理y^成《努举要求'^W力,为本发'效^婆减'摩必;T。本jt^爭《/jt伴^/y举^^/^众^^7便^/,而并不义键这些爭W义伴^/^^^"效^、^"昔^y授农'/么和/4'资賴^應^。本发'效白括在摩餘欢;^^^/举^趟迷的摩才/#欢^爭^7力容。实施例实施例1:B25H、A14E、A14E—B25H和人胰岛素对胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A的蛋白水解稳定性(半衰期)的比较分别在lOOmMNH4HC03,pH8.1或10mMHC1，pH2.0和25°C下lOOitiL的终体积中温育后，测量人胰岛素和胰岛素类似物(0.06mM,10pL)对胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶(0.34-3.4吗)的蛋白水解稳定性。在不同时间(O、5、15、30和60min)用等体积的0.5%TFA或0.1MTrisHCl，pH8.0(终pH7.7)淬灭样品，将其转移至5°C。立即通过RP-HPLC于214nm处对人胰岛素和胰岛素类似物进行分析，确定相应于完整蛋白的峰面积。在5mMNaP、140mMNaCl、70ppmTween20、pH7.4和37。C下400|iL的终体积中温育后，测量人胰岛素和胰岛素类似物(0.06mM,13.9pg)对羧肽酶A(工作液6.8jiL、20mg/ml、53单位/mg、Sigma、30、60min)用等体积的0.2%TFA淬灭样品，将其转移其至5。C。制备没加入酶的参比样品(Omin)。立即通过RP-HPLC在中性緩冲体系中于214nm处对人胰岛素和胰岛素类似物进行分析，确定相应于完整蛋白的峰面积。以相同的保留时间对人胰岛素和desB30进行观察。根据曲线可确定半衰期(T！/2)，计算出相对于人胰岛素的倍增/减时间(稳定性相对倍数)。人胰岛素，T1/2=6.9min和desB30人胰岛素，T1/2=6.7确定到相近的半衰期。人胰岛素的突变位点T,。[Min](倍)胃蛋白酶T1/2(Min)Af#胰凝乳蛋白酶T1/2(Min)/倍羧肽酶AB25H17.8(16.2)25.7(5.1)25.7(2.1)无U(1.0)5.0(1.0)6.9(1.0)A14E、DESB303.7(3.4)33.2(6.6)15.7(2.3)无U(1.0)5.0(1.0)6.9(1.0)A14E、B25H、DESB3042.4(38.5)62.4(12.5)61.9(9.0)无1.1(1.0)5.0(1.0)6.9(1.0)实施例2:通过MS分析和酶特异性鉴定胰岛素内的蛋白酶切割位点通过LC-MS利用胰岛素和胰岛素类似物被各种酶类(胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A)限制性蛋白水解的时程分析，来对蛋白酶切割位点进行鉴定。产生的肽片段由MS或MS/MS鉴定，并在214nm处定量以确定次要和主要切割位点(热点)。在人胰岛素中鉴定出以下热点胃蛋白酶(B24-25、B25-26、B26-27)和胰凝乳蛋白酶(B16-17、B24-25、B25-26、B26-27、A14-15和A19-20)。有趣的是，所述热点与胰岛素降解酶(IDE)(见下文)和组织蛋白酶D(HanneRefsgaard,NovoNordiskA/S,私人通信)重叠。还基于胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胰岛素降解酶(IDE)的酶特异性对胰岛素序列内的切割位点进行预测，如以下实施例3所示。以下蛋白酶的切割位点已在若干生物化学手册中描述胰蛋白酶(碱性残基，C端至Lys、Arg)、弹性蛋白酶(月旨肪族残基，C端直Ala、Val、Gly、Ser)、羧肽酶A(广特异性，但不包括Arg、Lys&Pro)、胃蛋白酶A(芳香族残基，N端至Trp、Tyr、Phe和Leu和各种其它残基)、和胰凝乳蛋白酶(芳香族残基，C端至Trp、Tyr、Phe和Leu，但不包括Xxx-Pro)。胰岛素内IDE的切割位点最近已公开B9-10、B10-11、B13-14、B14-15、B24隱25、B25-26、A13-14、A14-l5(Duckworth等，2006)，有报道显示以下取代抑制IDE对胰岛素的降解作用B10D和B4E—B16Q一B17F(Bennett等，2003)。实施例3:A14E、B25H、desB30人胰岛素内的热点鉴定的重复循环(repeatedcycle)根据实施例2中描述的方法鉴定A14E、B25H、desB30人胰岛素中胰凝乳蛋白酶切割的主要热点(B16-17、B24-25、A19-20)和次要切割位点(Bl-2、B6-7)。基于根据酶特异性所鉴定的切割位点和所预测的切割位点来设计胰岛素类似物。选择用以被取代的氨基酸残基以去除切割位点并增大溶解度。胰凝乳蛋白酶，根据由LC-MS法所鉴定的A14E、B25H、desB30人胰岛素水解液中的热点对类似物的设计A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B16X6B24X8A19X11XI-E/D/H/Q扁/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸注释人胰岛素中B24和/或A19的取代可能显著降低受体亲和A14X1B25PdesB30X12HIB1X2B6X3B16X6B24X8A19X11Xl=E/D/H/Q/N/S/窗/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸注释B25取代为Pro可能显著减少胰凝乳蛋白酶在B24-25的切割。胰凝乳蛋白酶，根据所鉴定和预测的热点设计A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B11X4B15X5B16X6B17X7B24X8A13X9A16X10A19X11XI-E/D/H/Q/N/S/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X4=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X7=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X9=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸注释人胰岛素中Bll、B15、B24、A13、A16和/或A19的取代可能显著降低受体亲和力。胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶，根据所鉴定和预测的热点设计A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B11X4B15X5B16X6B17X7B24X8A13X9A16X10A19X11B22X13Xl=E/D/H/Q纖/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X4=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X7=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X9=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X10=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q扁/T/M/P/天然氨基酸XI2=desB30/天然氨基酸XI3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶+胰岛素降解酶(IDE)，根据所鉴定和预测的热点设计A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B11X4B15X5B16X6A19X11B22X13B4X14B9X15B10X16B13X17B14X18Xl=E/D/H/Q鹿/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X4=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X7=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X9=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI0=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸X13=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X14=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X17=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸实施例4:人胰岛素类似物对胰凝乳蛋白酶的蛋白水解稳定性(半衰期)在稳定性测定中检验胰岛素类似物，根据实施例1中所描述的方法通过半衰期增加来鉴定类似物所表现的对蛋白水解抗性的增强。结果表明了进一步改良的胰岛素类似物由于对蛋白水解的抗性增强以及溶解度增大所导致的生物利用度增强的潜在性。已对下列胰岛素类似物相对于人胰岛素的对胰凝乳蛋白酶的稳定性进行了测试<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>实施例5:胰岛素类似物对鼠肠(十二指肠腔)提取物的蛋白水解稳定性根据胰岛素类似物在肠提取物中对于蛋白分解的稳定性来对其进行测试。所述提取物通过洗出空腹动物的腔内容物来制备。在37°C，pH=7.4下使胰岛素类似物与稀释的提取物温育，经过20h的温育后，通过RP-HPLC确定所述完整化合物的浓度。比较完整胰岛素类似物和完整人胰岛素的相对量。发现人胰岛素与类似物A14EB25HdesB30人胰岛素之间在稳定性上有约5-10倍的差异。权利要求1.胰岛素类似物，所述胰岛素类似物中相对于母体胰岛素有至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代，其中所述取代位于所述母体胰岛素的两个以上蛋白酶切割位点内部或与其紧密邻近处，其中这样的胰岛素类似物任选进一步包含一个以上插入突变。2.权利要求1的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，所述胰岛素类似物的A链包含至少一个突变，所述胰岛素类似物的B链包含至少一个突变。3.权利要求1或2中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物相对于母体胰岛素表现出对一种以上蛋白酶的稳定性提高。4.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物包含式1的A链氨基酸序列XaaA(.2)-XaaAy)-XaaAo-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys曙XaaAi2-XaaAi3-XaaAi4-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2i-Xaa22式(1)(SEQIDNo:1)和式2的B链氨基酸序列XaaB(-2)-XaaBw)-XaaBo-XaaBi-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB3(rXaaB31-XaaB32式(2)(SEQIDNo:2)式中XaaA(.2)不存在或为Gly;Xaa八(—i)不存在或为Pro;XaaAQ不存在或为Pro;XaaA8独立选自Thr和His;XaaA!2独立选自Ser、Asp和Glu;XaaAu独立选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaAw独立选自Tyr、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^5独立选自Gln、Asp和Glu;Xaa雄独立选自Asn、Lys和Gln;XaaA21独立选自Asn和Gin;Xaaw不存在或为Lys;XaaB(.2)不存在或为Gly;XaaB(.!)不存在或为Pro;Xaa加不存在或为Pro;XaaB1不存在或独立选自Phe和Glu;Xaas2不存在或为Val;XaaB3不存在或独立选自Asn和Gin;XaaB4独立选自Gin和Glu;Xaawo独立选自His、Asp、Pro和Glu;Xaa引6独立选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;XaaB24独立选自Phe和His;XaaB25独立选自Phe和His;XaaB26不存在或独立选自Tyr、His、Thr、Gly和Asp;XaaB27不存在或独立选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaB28不存在iU虫立选自Pro、His、Gly和Asp;XaaB29不存在或《虫立选自Lys和Gin;XaaB3。不存在或为Thr;XaaB31不存在或为Leu;XaaB32不存在或为Glu;C端可任选衍生为酰胺；其中所述A链的氨基酸序列和所述B链的氨基酸序列通过所述A链7位半胱氨酸与所述B链7位半胱氨酸之间的二硫键，以及所述A链20位半胱氨酸与所述B链19位半胱氨酸之间的二硫键连接，且其中所述A链6位和11位的半胱氨酸由二硫键连接；其中任选所述A链氨基酸序列N端通过含3-7个氨基酸的氨基酸序列与所述B链氨基酸序列C端连接，以形成单链胰岛素分子，其中任选所述B链N端延伸1-10个氨基酸；其中若XaaA8为Thr且XaaA12为Ser且XaaA13为Leu且XaaA14为Tyr,则XaaA15为Glu或Asp;且其中若XaaB24为Phe且XaaB25为Phe且XaaB26为Tyr且XaaB27为Thr且XaaB28为Pro,则XaaB29为Gln。5.药物组合物，所述药物组合物包含生物活性量的权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物和药学上可接受的载体。6.治疗、预防或緩解对象中以下疾病的方法高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖症、X综合征或脂血障碍，所述方法包括给予对象权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物或权利要求5中任一种的药物组合物。7.权利要求6的方法，所述方法为口服给药。8.权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物用作治疗或预防以下疾病的药物高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖症、X综合征和脂血障碍。9.权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物用作延迟或预防II型糖尿病病程的药物。10.权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物用作起以下作用的药物减少食物摄入、减少P-细胞凋亡、增强(3-细胞功能和增大P-细胞群、和/或用于恢复(3-细胞的葡萄糖敏感性。11.编码权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物的核酸序列。12.制备权利要求5的药物组合物的方法，所述方法包括将权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物与药学上可接受的物质和/或赋形剂混合。全文摘要本发明涉及对蛋白酶表现出抗性的新型胰岛素类似物，该胰岛素类似物中相对于母体胰岛素分子，有至少两个氨基酸被取代和/或缺失。本发明还提供了制备这样的胰岛素类似物的方法，制备包含本发明胰岛素类似物的胰岛素制剂的方法以及应用这些胰岛素类似物治疗糖尿病的方法。文档编号C07K14/62GK101541830SQ200780043130公开日2009年9月23日申请日期2007年9月20日优先权日2006年9月22日发明者F·休巴莱克,I·劳特鲁普-拉森,P·K·尼尔森,P·巴尔施米特,P·诺加尔德,S·卢德维格森,S·哈夫伦,U·里贝尔-马德森申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司