一种用于延迟发光测量的圆柱式光斩波器的制作方法

本发明涉及一种光斩波器，该光斩波器可以用于延迟发光的测量和成像。属于光学仪器制造领域。

背景技术：

在光致发光现象中，分子受光照激发跃迁到激发态，激发态的分子可通过释放光子回到基态，即分子的荧光或磷光。分子的激发态存在寿命，即激发态的分子要在过一段时间之后才释放光子回到基态，且不同分子的激发态寿命各不不同，分子激发态寿命越长，其发光持续时间越长。通常情况下，分子的荧光寿命在纳秒级，磷光寿命可以达到微秒级以上。延迟荧光分子，其寿命也可以达到微秒级甚至毫秒级。近些年发展的一些磷光分子，寿命可以达到秒级。此外一些无机纳米材料，其寿命在毫秒级以上。这些长寿命的发光统称为延迟发光，也被称为辉光。

在荧光和磷光的测量中，一般需要构建两个光路：光路一是激发光照射样品的光路，即从光源发出的光经过透镜、光栅等部件后会聚到样品上，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测器探测样品发光的光路，即样品发光经过透镜、光栅等部件后到达探测器。在稳态的测量过程中，光路一和光路二同时打开，即激发光一直照射样品的条件下测量，这种方式可以获得样品发光光谱和强度的信息，但是不能得到样品激发态寿命的信息。

随着科学的发展，分子的激发态研究在基础科学和检测应用中越来约重要。为了获得分子激发态寿命的信息和时间分辨的光谱，人们发展了瞬态光谱仪。瞬态光谱仪，包括瞬态吸收和瞬态荧光光谱仪，在光物理光化学的研究中有重要应用。（参考专利公开说明书CN201310392018.6、CN200510092520.0、CN201180017387.6、CN201110005032.7等。）为了实现时间分辨的测量，可采用脉冲光源激发样品，同时利用具有高时间分辨率的光电倍增管、单光子计数器或具有门控功能的CCD测量其延迟的吸收或者发光信号，以获得分子激发态的寿命等信息。然而为了实现高的时间分辨率，这类光谱仪通常需配备价格昂贵的脉冲激光器和CCD。而且激光器是单一波长，不能实现全波段的测量。配置不同波长的激光器可以部分解决这个问题，然而却导致仪器的成本大大增加。为了降低成本，人们将光斩波器应用到瞬态光谱的测量中。

光斩波器简称斩光器，可以把连续光源发出的光，调制成脉冲或交变的光信号。（参考专利公开说明书CN200710025960.3、CN201310342971.X、CN200410093016.8，中国专利申请号201520771676.0等。）传统斩光器主要部件之一是斩光盘，也叫斩光片，斩光盘上分布着几个或多个通光孔，通常这些通光孔以轴心为中心成中心对称分布。当电机控制斩光盘，在一定转速下，连续光源经过斩光盘上的通光孔后，即被调制成一定频率的周期性脉冲光。

在一些应用中，可在光谱仪的激发光的光路后加一个斩波器，这样就将稳态的光源变成了模拟的瞬态光源，同时在探测器的前面再加一个斩波器，用来调节延迟时间和快门时间，以实现时间分辨的测量。同样的方案可以用于时间分辨的荧光显微镜的设计。（参考文献Anal. Chem. 2011, 83, 2294-2300。）并在生物成像领域中有重要应用。

然而在上述解决方法中，需要对两个斩波器进行协同控制，或者协同控制脉冲光源和斩波器，由于现有的斩波器一般采用电机机械调制，其精度受电机转速影响较大，其调制出的脉冲光源本身带有一定的时间误差，加上要对两个斩波器同步控制，必然使误差加大，降低了整体测量的时间分辨率。提高单个斩波器的精度可以提高整体测量的时间精度，但是斩波器的成本随之增加。

中国专利（申请号201520771676.0）公开了一种光学斩波器，将两个斩光盘的转动通过齿轮或传送带耦合，使一个电机同时控制两个斩光盘，避免了电机转速不稳导致的散射光干扰，专利CN106066317A公开了将光学斩波器用于延迟发光测量的方法，利用反光镜或棱镜反射，以控制测量光路的方向，使用一个斩光盘也可以用于延迟发光的测量。

上述两种方法具有较广泛的适用性。然而使用两个斩光盘或者改变光路方向，都增加了仪器的复杂程度。此外，在测量延迟时间非常短的发光信号时，需要斩光盘高速转动，以达到快速斩光的目的，这必然会加剧齿轮啮合处的磨损。

技术实现要素：

为了解决上述问题，降低散射光干扰，并简化仪器，本发明设计了一种光斩波器，该斩波器使用电机调制，其斩光盘由圆柱的底面和侧面构成，圆柱的底面和侧面分别分布有通光孔，当该光斩波器绕圆柱轴转动的时候，可以同时对垂直于圆柱底面和侧面的光路进行斩光控制。

将上述斩波器应用于延迟发光的测量方法为：测量中有两条光路：光路一是激发光照射样品的光路，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测器探测样品发光的光路，即样品发光到达探测器。将样品放置于合适的位置，使两条光路不分先后，分别经过圆柱式斩波器的侧面和底面，当斩波器绕圆柱的轴转动，其侧面和底面可以分别对两条光路进行斩光，即实现两次斩光：对光路一的斩光相当于把稳态光源转变成脉冲光源；对光路二的斩光相当于探测器快门的开合。两次斩光就实现了脉冲信号发生和延迟探测的协同控制。

该斩波器不需要齿轮啮合，结构简单，并且适用于许多荧光仪和成像系统。

按照上述方法将上述斩波器装载在荧光光谱仪或荧光成像装置中，构建合适的光路，可以实现样品延迟发光的测量或成像。在这样的装置中，其含有光源、样品架或样品室、探测器等一般稳态荧光仪或成像装置的基本零部件，还含有一个上述斩波器。此外，该装置的光路为：光源发出的光经过斩波器的侧面或底面，作为激发光照射样品，然后样品的光经过斩波器的底面或侧面，到达探测器。

在光路上，还可以搭配狭缝、光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜、反光镜或光纤以改变光路的方向。只要测量中，光源照射样品之前先经过了斩波器，样品的发光经过斩波器后再到达探测器，则测量延迟发光的原理都是一样。

本发明的斩波器非常适合于含有二向色镜的荧光成像系统中，将二向色镜置于圆柱斩波器的内部，可以将垂直于圆柱侧面的入射光反射到圆柱底面的方向，处于该方向的样本受激发后，其发光延反方向透过二向色镜，并穿过圆柱另外一个底面，即可实现两次斩光。

上述延迟发光的测量或成像中，当光源发光通过斩波器的侧面通光孔照射到样品上的时候，斩波器的底面正好挡住了样品到探测器的光路；当斩波器转动使光源到样品的光路被斩波器的侧面挡住的时候，斩波器的底面正好也绕轴转过了一个角度，使得样品的发光可以通过斩波器底面的通光孔的到达探测器，相当于快门开启并收集光信号。由于一次照射所收集的信号较弱，可以使斩光盘匀速转动，反复上述测量过程，并累积多次测量的信号，以获得理想的信号强度。

该装置用于时间分辨的成像（时间门的成像，又或者延迟成像），其原理与前面延迟发光的测量的原理一致，都是通过一个斩波器对光源和样品发光同时进行斩光：对光源斩光，可以将光源转化为脉冲光源；对样品发光斩光，相当于控制延迟时间和快门时间。由于两次斩光是由一个斩波器进行，放置好样品的位置，使入射光和出射光不在同一时间经过通光孔，即可以确保两次斩光在时间上完全错开。因而在这个方法中，即使电机转速稍有不稳定，使频率出现偏差，进行多次测量也不会出现漏光现象，即完全排除了背景散射光的干扰。相对于分别使用两个斩波器控制脉冲光和快门，极大提高了检测的信噪比。此外，由于该方法将快门控制与斩光控制同步，因而在延迟光谱及时间分辨的成像应用中，无需再配备脉冲发生器、延迟发生器和快门附件等，简化了仪器装置并降低了成本。

从该测试的原理可知，该光谱仪可以搭配任意的稳态光源使用，如汞灯、氙灯等，相对于使用单一波长的脉冲激光器，其激发波长可以使用光栅调节，范围覆盖广，可以测试不同激发波长的物质，大大降低了成本。该方法也可以搭配大功率的近红外激光器，如980nm、808nm等，可以用于上转化材料或近红外发射材料的时间分辨的成像。

附图说明

图1为圆柱式斩波器用于测量延迟发光的结构示意图，101为斩波器，102为侧面通光孔，103为底面通光孔，104为样品池。

图2为一种可分离式斩波器。

图3为正置的延迟发光成像装置结构示意图，201为斩波器，202为侧面通光孔，203为底面通光孔，204为二向色镜，205为物镜，206为样品台，207为样品，208为透镜，209为探测器。

图4为倒置的延迟发光成像装置结构示意图，各零部件与图3相同。

图5为圆柱式斩波器与激发模块联用的结构示意图，301为斩波器，302为底面通光孔，303为侧面通光孔，304为激发模块，305为滤光片，306为二向色镜，307为滤光片。

具体实施方式

为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。 在实际应用中，可以根据具体情况实施最合适的方案。

实施实例1 ，斩波器用于测量延迟发光。

如图1所示，为圆柱式斩波器测量延迟发光的示意图，圆柱式斩波器101上具有侧面通光孔102和底面通光孔103，激发光通过侧面照射到样品池104上，样品受激发后发出荧光或者磷光经过底面射出，之后被探测器检测。

该装置测量延迟发光的原理如下：当斩波器绕圆柱轴转动的时候，侧面通光孔102对入射光进行斩光，将入射光变为脉冲光，在某一时刻，入射光照射到样品上的时候，样品的发光被斩波器的底面挡住，当斩波器转过一个角度，使侧面挡住了入射光，此时底面的通光孔103正好转到了样品池的上方，使样本的延迟发光射出。斩波器匀速转动，如此循环，可以累积多次测量的信号。只要样品发光通过底面通光孔103的时候，斩波器的侧壁挡住了入射激发光，就可以实现样本延迟发光的测量。

从上述过程可知，脉冲、延迟、快门均由一个斩波器控制，多周期测量的过程中，即使斩光盘转速不稳，而使频率有所抖动，也可以确保脉冲、延迟、快门依次发生，使样品散射光被阻挡在外，降低了非延迟发光的干扰。

按同样的原理，斩波器侧面和底面的通光孔数量不限于2个，其它孔数的斩波器也可以用于上述延迟发光的测量，在具体的测试中，可以根据样品的激发态寿命选择合适孔数的斩波器。

在这种测量方式中，斩波器转速、侧面通光孔和底面通光孔的大小和相对位置决定了测量的大致延迟时间和快门时间。

假设斩波器转速为x转/秒，侧面和底面分别均匀分布了y个通光孔，以转轴为圆心，侧面通光孔对应的弧度为2π/m，底面通光孔对应的弧度为2π/n，当入射光被挡住后，斩波器需要再转过2π/l的弧度才使样本发光从斩波器射出，则脉冲频率为xy赫兹，周期为1/(xy)秒，脉宽为1/(xm)秒，快门时间为1/(xn)秒，延迟时间为1/(xl)秒。

如果x=200，y=10，n=50，m=l=500，则周期为1000微秒，快门为100微秒，延迟时间为10微秒。可以测量许多物质的延迟发光，这些样品有磷光金属配合物，长寿命的延迟荧光分子，稀土纳米材料等。

要测量寿命更短的样品，可以提高斩波器的转速或频率。如果斩波器的频率为200千赫兹，则周期为5微秒，调节侧面通光孔和底面通光孔的大小，及相对位置，可以使脉宽、延迟和快门时间总和在5微秒以内，可以测量大部分延迟荧光分子和磷光分子的延迟发光。

在上述光路中，还可以增加透镜，使激发光集中于样品上，或者使样品发光集中到探测器上，以增强信号强度。

此外，该斩波器可以设计成可分离式，如附图2所示，底面和侧面可以拆开、重新组合，这样就可以调节底面和侧面通光孔的相对位置，达到调节延迟时间的目的。其中底面和侧面的组合方式不限于附图中的方式，其它的组合方式以及一些常用的紧固件也可以用于这类斩波器中。

该斩波器可以搭配任意的稳态光源使用，也可以搭配大功率激光器，用于上转换发光的时间分辨光谱的测量。

实施实例2 ，斩波器用于延迟发光的成像。

成像设备的结构示意图如附图3和附图4所示，激发光经过圆柱式斩波器201的侧面转变为脉冲光源，再经过二向色镜204反射，经过物镜205后照射样品台206中的样品207，样品发光依此经过物镜205、二向色镜204，再经过斩波器的底面、透镜208后到达探测器209。

斩波器转动过程中，激发光必须经过斩波器201的侧面通光孔202才能照射样品，样品发光也必须经过底面通光孔203才能到达探测器，但是这两次光经过通光孔的时间不同，存在先后次序，因而探测器可以可以拍摄样品的延迟发光照片。延迟测量的原理与实施实例1相同。

图3和图4采用了相同的元件，区别在于，图3是正置成像系统，图4是倒置成像系统，分别适用于不同的检测用途。

省略物镜205和透镜208，该装置也可以用于延迟发光成像，只是成像的焦平面不同。

二向色镜204也可以换成分光片、长波通、短波通、带通、带阻滤光片或颜色滤光片，以实现反射和透射光谱的分离，可以根据激发光光谱和样品发光颜色选择合适的滤光片。

选择合适的物镜和透镜，该装置可以用于延迟发光的显微成像。相对于一般的荧光显微镜，其优势在于，测量延迟发光，可以简化滤光系统，显著降低成本。相对于其它的时间分辨的显微镜，该装置不需要专门的脉冲光源，也不需要延迟控制器，带有门控功能的CCD探测器，因而成本低廉。此外，可以搭配各种稳态光源，包括氙灯汞灯LED，大功率近红外光源，用于上转换的时间分辨成像。

实施实例3，斩波器用于荧光显微镜的时间分辨成像。

市面上现有的荧光显微镜大多采用二向色镜的激发模块，如图5所示，304为激发模块，其中含有三块滤光片，其中二向色镜306与滤光片305和307呈45度夹角放置，这类激发模块在荧光显微镜中广泛使用，入射光经过滤光片305过滤再被二向色镜306反射至样品处，样品的荧光透过二向色镜和滤光片307后再到达探测器，该光路与图3和图4中的光路类似，因而，本发明的斩波器可以结合激发模块装载在这些荧光显微镜上，实现时间分辨的荧光成像。图5为斩波器301和激发模块304联合使用的示意图，入射光必须经过斩波器的侧面通光孔303才能进入激发模块304，从激发模块射出的荧光必须经过底面通光孔302才能被探测器检测。因而当斩波器301匀速转动的时候，入射光和出射光交替通过斩波器和激发模块，从而屏蔽了散射光，实现时间分辨的荧光成像。

此外，实例1到实例3中的所有装置中，可以使用其它孔数的斩光盘，以改变斩光频率。还可以根据被测物发光的性质，在光路上添加狭缝、光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜、反光镜或光纤以改变光路的方向，以增强检测的信噪比。