物镜附件的制作方法

本发明涉及一种物镜附件，特别是涉及一种包括单个微球物镜的物镜附件。该物镜附件可用于超分辨率显微镜、成像或制造。本发明还涉及该物镜附件的制造和使用。

发明背景

由于远场衍射极限的存在，传统的光学显微成像分辨率在可见光光谱范围内的理论极限约为200nm。因此，传统的光学显微镜成像不适合结构小于这一极限的成像对象，例如活病毒(一般为5-150nm，有的可达300nm)。为了对这种在光学衍射极限之外的结构进行成像，还使用了其他技术。

透射电子显微镜(tem)和扫描电子显微镜(sem)经常用于在真空中以非常高的分辨率(10nm)对特别制备的死病毒结构进行成像。这些技术需要复杂的样品制备，不适合体内成像和测量(电子束影响活细胞、病毒等)。

原子力显微镜(afms)通过接触探针对小特征样品提供了良好的成像。但是，样品很容易被afm的尖端损坏。而且，该技术提供不是真实的图像，而是重建成像。

受激发射损耗(sted)荧光显微术是最近建立的一种用于对超过光学衍射极限的细胞结构、细菌和病毒进行成像的方法，分辨率可达6nm。该技术是基于当荧光试样受到特定波长的激光激发时其发射出的光的检测并采用另一种不同波长的激光关闭荧光区的一部分。sted荧光显微镜提供了更好的分辨率，但样品需要复杂的准备(荧光标记)，这可能并不总是适合活体生物成像。荧光成像技术主要对有机样品有较好的成像效果。然而，对于高分辨率，这种技术面临着照片漂白的挑战，它将曝光的最小曝光时间限制到了几十秒内。

最近，使用放置在物镜和样品之间的微球阵列证实了超分辨率成像。阵列中使用的微球的直径通常为10μm量级。利用微球可以捕捉到在“远场”区域具有不同折射率的两种不同介质边界处出现的倏逝波。这些倏逝波携带着高空间频率的亚波长信息，并随距离呈指数衰减。因此，靠近表面的微球比传统的物镜更能有效地探测到这种倏逝波。

cn102305776b公开了一种直径为1-9um用作透镜的微球，该微球用于成像时，与目标物接触或与目标物的距离小于100nm。成像目标物必须是金属的或镀金的(对于半导体材料)。其测量机理是基于对发生在金属与非金属之间的表面等离子体的检测。微球支撑结构有两种类型：一种是设置在硅上的锥形孔，该锥形孔顶部为8μm、底部为2.8μm，使用uv固化胶粘剂固定微球；另一种是透明的玻璃尖端，该尖端使用紫外线固化粘合剂固定微球。这样的布置方式并不是特别坚固或适合于现有的显微镜。此外，微球没有附接在物镜上，因此不能保证与物镜的光轴对齐。

wo2015/025174a1公开了一种嵌入在基体材料(弹力体、玻璃或塑料)中并放置在工件上的微球阵列。这种透镜片可以重复用于成像。但是，微球阵列很难制造，而且非常脆弱，容易损坏。使用这样的小微球还会增加图像的失真和视野的限制。此外，微球没有附接在物镜上，因此不能保证与物镜的光轴对齐。

超分辨率成像设备也可用于激光微加工。在这种技术中，制造分辨率受聚焦激光束光斑尺寸的限制。由于其是激光波长的一半的量级，因此加工一些亚波长的特征是困难的。先前的研究已经证明了在目标表面散布的微球可以用于超分辨率成像或亚波长激光加工。但是，对于实际的加工技术，微球不能放置在加工目标上。因此，这类技术还需要一种简单、牢固、能够精确定位并易于安装在现有显微镜上的安装装置。因此，本发明的目标是使超分辨率显微镜和/或微加工至少部分地克服或减轻上述一些问题。

技术实现要素：

本发明的第一个方面，提供了用于显微镜的物镜附件，该附件包括：可相对于物镜的外壳体定位的盖；固定在所述盖上的支撑板；设置在所述支撑板上的粘附层；以及通过所述粘附层固定至所述支撑板的微球透镜，所述微球透镜与所述物镜的光轴对齐。

上述物镜附件使显微镜可用于超分辨率显微镜和激光微加工。所述支撑板和粘附层允许所述微球精确定位在距离所述物镜固定距离的位置上，并在使用中与所述光轴对齐，以获得最佳性能。使用所述粘附层将所述微球固定在适当的位置，提供了一个简单而坚固的附接结构。该系统适用于金属和非金属靶材料，尤其适用于生物样品(如细胞)的成像和加工。

所述微球透镜可包括微球或截断的微球。使用微球而不是截断的微球，可以提高分辨率，但也会增加失真。为消除疑问，该截断的微球包括由垂直于所述光轴的平面截断的微球。

所述微球透镜的直径范围可以为30-1000μm。在一个实施例中，所述微球透镜的直径范围可以为90-106μm。特别地，所述微球透镜的直径可以在100μm左右。

所述微球的折射率可在1.5-4之间。在一个实施例中，所述微球透镜的折射率可在1.55-2.4范围内。特别地，所述微球透镜的折射率可以在1.9-2.2左右。所述微球透镜可由任何合适的材料制成，包括但不限于钛酸钡(batio3)、聚苯乙烯、二氧化硅(sio2)、金刚石、蓝宝石(al2o3)、二氧化钛、立方氧化锆、氧化锌、硅、锗、磷化镓、和砷化镓等。

所述盖可包括顶部和基本上呈管状的本体。该管状体可具有与所述物镜外壳相对应的横截面。所述盖可以可释放地附接到所述物镜的壳体上。可释放的附接可通过在所述管状体内表面上设置附接结构来促成。在一个实施例中，所述附接结构可包括螺纹，该螺纹用于与所述物镜壳体的外表面上设置的相应螺纹啮合。

沿光轴方向，所述盖与物镜之间的相对位移可以调整。在这些实施例中，所述盖可以通过调整装置连接到底座上。所述底座可调整以附接到位于固定位置的物镜壳体上。该底座可包括具有可靠附接装置的套环。所述调整装置可操作，以能够调整所述盖和安装环的相对位移。调整所述盖和所述安装环的相对位移，就可以调整所述盖与所述物镜沿光轴方向的相对位移。在某些实施例中，所述调整装置可包括压电驱动器。在其他实施例中，所述调整装置可包括细长螺纹元件。在这些实施例中，所述调整装置可进一步包括步进电机，该步进电机可操作成沿着所述细长螺纹元件驱动调整。

在某些实施例中，可以将所述盖安装到扫描台上。在这些实施例中，可以将所述盖安装在设置在所述扫描台上的专用承窝中。所述扫描台可操作，以控制所述盖相对于所述物镜的位置。具体地说，所述扫描台可以提供沿光轴方向对所述盖相对于所述物镜的相对位移和/或在垂直于光轴的平面上对所述盖相对于所述物镜的相对位移的快速调整。

在所述盖与物镜的相对位移沿光轴方向可调的实施例中，可在所述支撑板和所述物镜之间设置渐变折射率光学元件(gradedindexopticalelement)。或者，在此类实施例中，所述支撑板可包括渐变折射率光学元件的端面。所述渐变折射率光学元件可以是任何合适的元件，其中该元件的折射率随着与该元件光轴的径向距离的增加而减小。特别地，该元件可以是光纤、透镜、玻璃棒、聚合物棒、半导体棒或类似的东西。所述渐变折射率光学元件可以为所述盖和所述微球透镜之间分离距离的变化提供补偿，这是因为由于沿径向变化的折射率所有的光路(折射率乘以距离)都是相同的。

在使用过程中要浸泡在液体中的物镜，所述盖可设置有密封件，以便在所述支撑板和所述物镜之间保留所述液体。在某些实施例中，所述液体可以是水。在其他实施例中，所述液体可以是油。在这些实施例中，所述盖可以配置允许在所述盖和所述物镜之间引入液体和/或在所述盖和所述物镜之间去除液体的阀门。

所述盖的顶部可设置有孔。该盖孔的大小可以与所述物镜相同，也可以大于所述物镜。所述盖孔可设置在周围的接触面内。所述支撑板可以固定在所述接触面上。在一些实施例中，所述接触面可设置在所述盖孔周围的凹槽内。所述支撑板可以用任何合适的方法安装到所述盖上。特别是，所述支撑板可以用胶粘剂固定在所述盖上。在一个实施例中，可以用noa81、my-132、my132a或类似的紫外线固化粘合剂将所述支撑板固定在所述盖上。这种粘合剂通常用于连接光纤。显然，所述粘合剂应具有良好的透光性。在优选实施例中，所述粘合剂的折射率可低于所述微球透镜材料。

所述盖和凹槽可使得所述支撑板邻接或基本上邻近所述物镜表面的至少一部分。这使得所述微球透镜和所述物镜之间的分离能够保持在一个理想的距离，并且所述物镜和所述样品之间的分离能够保持在一个理想的距离。所述物镜与所述微球之间的理想分离距离以及所述物镜与所述样品之间的理想分离距离取决于所述物镜的功率、所述物镜的数值孔径、所述微球物镜的特性和周围介质。所述物镜与所述微球之间的分离距离是成像的关键。所述分离距离可选择成使得聚焦位置位于组合光学系统的虚拟成像平面上。这通常远低于(典型的大约所述微球的一个直径)目标表面。

成像平面位置和由所述微球引入的额外的图像放大因子可通过考虑球面透镜效应和球面像差确定：

其中，f是微球从球体中心的焦距，d是与光轴的横向距离，r是微球半径，n0是环境折射率，n1是微球的折射率，s是从微球的中心到虚拟成像平面的距离，m是微球图像放大因子，δ为从目标到微球表面的距离。

因此，物镜与微球透镜的距离为：

d＝s–f-r(4)

其中，d为物镜与微球透镜之间的距离；s为在没有微球的情况下物镜的标准最优工作距离，于此位置，目标位于物镜焦平面上，当透镜和目标表面之间的介质折射率变化时，这个距离可能会改变。

本发明的另一个关键实施例是物镜上的微调节机构与微球附件的结合，使得物镜与微球透镜之间的距离可以调节。

所述盖可以用任何合适的材料制成。在某些实施例中，所述盖可以由金属形成。在其他实施例中，所述盖可以由塑料材料或树脂形成。

所述支撑板可以由任何合适的透明材料制成。在一个实施例中，所述支撑板由玻璃形成。在替代实施例中，所述支撑板可包括替代性的透明材料，如聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚二甲基硅氧烷(pmds)或类似材料。所述支撑板为所述微球透镜提供了一个稳定的安装座。所述支撑板还为所述盖提供附加的结构刚度。

所述支撑板的厚度可以在50-200μm的范围。在一个实施例中，所述支撑板的厚度范围为80-100μm。特别地，支撑板的厚度可以大约为100μm。

所述粘附层可包括光学粘合剂，该光学粘合剂应用于间隔层并旋转至所需厚度。在这些实施例中，所述粘附层可包括noa81、my-132、my132a或类似的紫外线固化粘合剂。可以对形成所述粘附层的物质进行选择，以匹配所述支撑板和/或微球的光学特性。或者，所述粘附层可包括施加于所述间隔层的已知厚度的光学透明双面胶带。使用已知厚度的胶带简化了所述附件的结构。适用胶带包括但不限于oca8146-2、oca8146-3等。

所述粘附层的厚度范围可以为30-150μm。在一个实施例中，所述粘附层的厚度范围可以为50-75μm。特别地，所述粘附层的厚度约为75μm。

所述附件可包括表面涂层。所述表面涂层可涂覆于所述粘附层和所述微球透镜上。所述表面涂层为所述附件提供额外的结构稳定性。所述表面涂层也可以增强所捕获的图像。在一个实施例中，所述表面涂层为粘合剂。在这些实施例中，所述表面涂层可包括noa81、my-132、my132a或类似的紫外线固化粘合剂。在另一个实施例中，所述表面涂层可以是金属的。适合的金属包括但不限于金或银。两者可以结合使用。

所述表面涂层可比所述粘附层薄得多。在一个实施例中，所述表面涂层的厚度范围可以为1nm-20μm。特别是，表面涂层，对于金属涂层，厚度可以约5-10nmμm。在另一个实施例中，对于使用紫外光固化粘合剂的表面涂层，厚度约5-20μm。

所述盖上可设置密封突起，用于保持所述微球透镜和所述样品之间的流体。所述密封凸起可以由弹性变形材料形成。所述流体可以是水或油。

本发明的第二方面，提供了一种构造显微镜物镜附件的方法，其包括以下步骤：将支撑板附接到盖上，所述盖可附接到物镜外壳上；在所述支撑板上设置粘附层；及将微球透镜固定至所述粘合层。

本发明第二方面的方法可以根据需要或适当情况，纳入本发明第一方面的任何一个或所有特征。

上述方法提供了用于超分辨率显微术的有效物镜附件的简单构造。

所述盖由金属制成的，提供所述盖可包括铸造或以其他方式加工金属的步骤。所述盖由塑料制成的，提供所述盖可涉及成型或以其他方式加工塑料的步骤。提供所述盖可包括使用适当的打印树脂对所述盖进行3d打印的步骤。

将所述支撑板固定到所述盖上可以通过在所述盖的接触面上涂粘合剂并将所述支撑板压向所述粘合剂来实现。如果所述粘合剂是可固化粘合剂，则固定可包括固化所述粘合剂。如果所述粘合剂是一种紫外光固化粘合剂，则固定可包括用紫外光照射来固化所述粘合剂。

将所述粘附层涂在所述支撑板上可能涉及到将所需量的粘合剂溶液涂在所述支撑板上，并旋转所述支撑板，直到形成所需厚度的均匀层。如果所述粘合剂是可固化粘合剂，则固定可包括固化所述粘合剂。如果所述粘合剂是一种紫外光固化粘合剂，则固定可包括用紫外光照射来固化所述粘合剂。

将所述粘附层涂在所述支撑板上可能涉及将所需厚度的胶带层施加到所述支撑板上。使用已知厚度的胶带简化了所述附件的构造。

在一个实施例中，所述微球透镜是在将所述支撑板固定至所述盖上并将所述粘附层施于所述支撑板上之后进行固定的。将所述微球透镜固定至所述支撑板上可包括将所述微球放置在干净的显微镜载片上；用所述支撑板的粘附层接近所述微球透镜。固定所述微球透镜可包括使所述显微镜载片相对于显微镜的物镜居中。通常，居中操作可以使用低倍率物镜完成。使用所述粘附层接近所述微球透镜可通过将所述盖附接至显微镜物镜的壳体上，并利用显微镜的调节装置来接近所述微球透镜来实现。

所述方法可包括在所述粘附层和所述微球透镜上涂覆表面涂层。可将所需量的粘合剂溶液涂敷于所述支撑板和微球透镜上，并旋转所述支撑板直至形成所需厚度的均匀层，来实现所述表面涂层的涂敷。如果所述粘合剂是可固化粘合剂，则固定可包括固化所述粘合剂。如果所述粘合剂是一种紫外光固化粘合剂，则固定可包括用紫外光照射来固化所述粘合剂。

所述盖包括渐变折射率光学元件的，所述方法可包括将所述渐变折射率光学元件固定至所述支撑板和/或所述盖的附加步骤。这可通过使用粘合剂来实现。特别是，这可以通过使用光学粘合剂来实现。

根据本发明的第三个方面，提供了一种超分辨显微镜装置，包括：显微镜；附接至物镜或显微镜外壳的盖；固定至所述盖上的支撑板；设置在间隔板上的粘附层；及通过所述粘附层固定至所述支撑板的微球透镜，所述微球透镜与所述物镜的光轴对齐。

本发明第三方面的装置可以根据需要或适当地包括本发明前两个方面的任何一个或所有特征。

所述装置可包括照明装置，该照明装置可操作产生照亮样品的光。所产生的光可根据需要或期望是单色或宽光谱。所述照明装置可操作成以反射或透射模式照亮所述样品。在所述照明装置可操作成以反射模式照亮所述样品的实施例中，所述超分辨显微镜装置可在所述照明装置和所述物镜之间设置受限光圈。所述受限光圈可操作提供窄光束照明，从而提高分辨率。

所述照明装置可操作产生偏振光。或者，所述超分辨显微镜装置可以配置偏振滤光片。当成像样品的多个特征在特定的方向对齐，偏振方向基本上垂直于特征对齐的方向时，偏振可以提高分辨率。

所述超分辨显微镜装置可设置有成像装置，该成像装置可操作成捕获透过物镜所观察到的所述样品的图像。通常，所述成像设备可以包括光学传感阵列，如ccd(电荷耦合器件)阵列。

所述成像装置可以连接到图像处理装置，所述图像处理装置可操作处理所捕获的图像。该处理可包括消除朝着所述微球透镜的边缘径向(枕形)失真的处理。附加地或替代地，所述处理可以包括诸如过滤、阴影去除、边缘检测、反转等其他步骤。

所述超分辨显微镜装置可包括样品座，样品可置于其上使得其可透过物镜观察到。所述样品座可操作成可控制地改变所述物镜与所述样品之间的分离距离。所述样品座可操作成可控地改变在垂直于物镜光轴的平面上所述样品相对于所述物镜的位置。在这种情况下，所述样品座可以包括扫描台。这样可以实现相对于所述物镜扫描所述样品，以便增加样品的成像面积。

所述超分辨显微镜装置可包括多个物镜。在这种情况下，所述显微镜装置可包括用于在所述物镜之间切换的装置。

所述超分辨显微镜装置可设置有加工激光束源。所述加工激光束可对准通过所述物镜和所述微球透镜。这可以使显微镜装置用于目标表面的微加工。特别是，这可以实现目标表面的亚波长激光加工。

根据本发明的第四个方面，提供了一种超分辨率显微方法，该方法使用根据本发明第三方面提供的显微镜或者设有根据本发明第一个方面的附件的显微镜，该方法包括：提供样品；将所述物镜和物镜附件相对于所述样品进行定位，及捕捉所述样品的一个或多个图像。

本发明的第四个方面的方法可以根据需要或适当包括本发明以前各方面的任何一个或所有特征。

所述方法可包括照亮所述样品。照明光可根据需要或期望是单色或宽光谱。照明光可以为偏振光。照明光可以反射或透射模式照亮所述样品。

所述方法可包括改变所述物镜与所述样品之间的分离距离。所述方法可包括在垂直于所述物镜光轴的平面上改变所述样品相对于所述物镜的位置。特别是，所述方法可涉及相对于所述物镜扫描所述样品。这可以增加样品的成像面积。

所述方法可包括在所述物镜附件和所述样品之间引入液体。所述流体可通过样品的应用引入。

附加地或替代地，所述方法可以包括在所述物镜和所述物镜附件之间引入液体。

所述方法可包括对所捕获图像的处理。特别是，所述方法可以包括消除径向畸变的处理。附加地或替代地，所述方法可包括诸如过滤(filtering)、阴影去除、边缘检测、反转(inversion)、图像拼接等其他步骤。

所述方法可包括加工样品的附加步骤。加工可以通过提供加工激光束源(对该加工激光束源进行对准使得加工激光束穿过物镜和微球透镜)及通过将样品暴露于所述加工激光束对所述样品的目标表面进行加工来实现。加工可以在成像的同时进行。

根据本发明的第五方面，提供一种使用根据本发明第三方面的显微镜或设有根据本发明第一方面的附件的显微镜进行加工的方法，该方法包括：提供样品；相对于所述样品定位所述物镜及所述物镜附件；提供加工激光束源，对其对齐使得加工激光束穿过所述物镜和所述微球透镜；及通过将所述样品暴露在所述加工激光束下加工所述样品的目标表面。

本发明第五方面的方法可以根据需要或视情况包括本发明先前各方面的任何一个或全部特征。

附图说明

为了更清楚地理解本发明，现仅通过示例，参照附图来描述本发明的实施例，其中：

图1为本发明实施例显微镜物镜附件图；

图2所示为图1的物镜附件为附接在显微镜物镜上保持就位的示意图；

图3所示为图1的物镜附件附接在显微镜物镜上的示意图；

图4示出了根据本发明的另一实施例的显微镜物镜附件；

图5是根据本发明一实施例的物镜附件的光学元件相对于物镜的定位示意图；

图6是根据本发明一实施例的物镜附件的光学元件相对于样品的定位示意图；

图7是本发明物镜附件的光学元件相对于显微镜和样品的定位示意图，还示出了可选的用于机械加工应用的激光装置；

图8示出了以下图像：(a)使用本发明的物镜附件及图7中所示的针孔光圈获得的加工硅晶片图像；(b)使用本发明的物镜附件而不使用图7中所示的针孔光圈获得的加工硅晶片图像；(c)使用本发明的物镜附件而不使用图7中所示的针孔光圈的荧光染色convallariamajalis花瓣硅片图像；及(d)使用本发明的物镜附件及图7中所示的针孔光圈的荧光染色convallariamajalis花瓣硅片图像；

图9示出了(a)使用本发明的物镜附件获得的图像的枕形失真，及(b)对枕形失真的校正；

图10示出了(a)本发明的物镜附件用于加工的示意图；(b)微球透镜对加工激光束的影响的展开图；(c)加工操作期间在基板上创建的图案的示例图；

图11示出了根据本发明一实施例的显微镜物镜附件的示意图，其中物镜和物镜附件之间的分离距离沿光轴可调；

图12示出了根据本发明的替代实施例的显微镜物镜附件的透视图(a)和分解图(b)，其中物镜和物镜附件之间的分离距离沿光轴可调；及

图13示出了根据本发明的替代实施例的显微镜物镜附件的分解图(a)和透视图(b)、(c)，其中物镜和物镜附件之间的分离距离沿光轴可调。

具体实施方式

如图1-3所示，本发明的物镜附件10的一个实施例，用于安装在显微镜(未示出)物镜2的壳体3上。在一个实施例中，透镜可以是带校正环的rms60x-pfc-60x奥林巴斯平面萤石物镜，0.9na，工作距离为0.2mm。

使用中的附件10将微球透镜13放置在物镜2和样品之间。特别地，附件10适于将微球透镜置于距离物镜2期望的位置处，以提供最佳的超分辨率成像性能。

物镜附件10包括盖14，盖14具有基本上为管状的本体15和顶部16。壳体3设有端部4，端部4内装有物镜2。壳体3配有旋转调节环5，能够相对于显微镜本体调整物镜位置。壳体3还包括接头6，用于将该壳体固定到显微镜本体上。

盖14是塑料制成的，带有狭缝15a。狭缝15a有助于确保盖14与物镜壳体3紧密配合。物镜设计成使用时浸在液体中的，盖14可适于保留液体。特别地，管状体的内部可设置密封件以帮助保留所述流体，和/或便于引入或移除所述流体的阀。

在一些实施例中，盖14可由模压塑料形成。也可以使用合适的树脂通过3d打印来制作。在该些实施例中，可在异丙醇中清洁盖并且需要时可以进行抛光。管状体15的内部可适于辅助将盖14固定到物镜壳体3上，这可以通过提供夹紧结构和/或螺纹来实现。或者，可通过在管状体15内部涂抹粘合胶来实现此目的。

顶部16具有围绕孔18的接触面17。当盖14安装到物镜壳体3上时，孔18与物镜对齐。

支撑板11固定在盖14上。支撑板11由玻璃制成，也可以由任何其他合适的光学透明材料制成。用于支撑板11的合适材料的一个示例是由agarscientific制造的玻璃载玻片，产品编号为agl46r10-0。

通过使用接触面17上提供的粘合剂将支撑板11固定到盖14上。在一个实施例中，粘合剂可以是诺兰产品提供的noa81紫外线固化粘合剂。可使用4w(光功率)、365nm波长的紫外线灯将粘合剂固化30分钟。

在支撑板11上提供粘附层12。粘附层可由光学透明胶带形成。合适的胶带是目录号为oca8146-3×3m的光学透明双面胶带。通过使用特定厚度的胶带，可以很容易地获得所需厚度的粘附层。在替代实施例中，可通过将光学粘合剂涂至支撑板11以便形成期望厚度的层来形成粘附层12。这可以通过涂抹一滴光学粘合剂并旋转支撑板直到粘附层达到所需厚度来实现。使用光学粘合剂而非光学胶带的好处在于，与使用同时包含粘合剂和基板的胶带相比，更容易确保粘附层12和支撑板11和/或微球体13的折射率匹配。

粘附层12设置在至少支撑板11的中心。这样，当盖连接到物镜壳体时，粘附层12与物镜中心对齐。

附着在粘附层12上的是由钛酸钡(batio3)形成的微球透镜13，折射率约为1.93。微球透镜与物镜2的中心对齐。

在本实施例中，微球透镜13的直径约为100μm。在替代实施例中，可以使用直径在30μm-1000μm范围内的batio3微球透镜。

为了确保微球透镜13与物镜2的中心精确对准，将盖安装到壳体3后，再将微球透镜13固定到粘附层上。相反，将微球透镜13放置在干净的显微镜载玻片上，然后对显微镜上的控制装置进行操作，使微球透镜13在视野范围内居中。这个初始阶段可以使用第二个较低放大率的物镜(如x10或x20)来完成，而该物镜上不附接所述盖。当微球透镜13适当定位后，装配有附件10的物镜2朝着玻片前进，直到粘附层12接触到微球透镜13。由于这种接触，微球透镜13被粘贴到粘附层12上。当物镜随后移离载玻片时，微球透镜13仍固定在粘附层12上。

为了进一步将微球透镜13固定到位，可在微球透镜、粘附层12和支撑板11上施加表面涂层12a(见图10b)。表面涂层12a可包含光学粘合剂。在一个实施例中，表面涂层可包含40％noa81紫外线光学粘合剂溶液(2份粘合剂，3份丙酮)。将一滴上述溶液倒在支撑板上。然后旋转附件10(或物镜壳体3和附件10)，直到表面涂层12a达到所需的均匀厚度。在一个实施例中，表面涂层的厚度约为10微米。随后，可在适宜的紫外线光照下将表面涂层12a固化1小时左右。

图4显示了附件10的替代实施例。在本实施例中，盖14由金属制成，其设计用于替换物镜壳体3的现有前部5。在其他方面，附件10与图1-3的附件10基本相同。

图5显示了本发明附件的横截面示意图。如图5所示，支撑板11基本上紧靠物镜2。选择支撑板11的厚度和粘附层12的厚度，使得其组合厚度等于微球透镜13和物镜2的所需分离的距离。这样，微球透镜13可以简单、牢固和准确地定位在与物镜2所需的分离位置。在本发明所述的实施例中，粘附层12由已知厚度(75μm)的胶带形成，因此，选择支撑板11的厚度以实现最佳分离。在所述示例中，玻璃载玻片的厚度可在80-100微米的区域内。如果在商业上没有合适厚度的支撑板片材，则可以将片材加工成所需的厚度。

根据物镜2的功率和微球透镜13的性质，选择微球透镜13和物镜2的特定分离距离。根据微球大小、材料、物镜功率、数值孔径和周围介质的不同，这种距离通常在50-400微米之间。在某些情况下，如图4中的附件10，有调整附件位置的设置，以增加支撑板11与物镜的分离距离。这可以补偿支撑板11的厚度或微球透镜13特性的差异，以及纠正聚焦中的微小误差。

现在讨论成像操作，微球透镜13在成像操作中的使用示意图如图6和7所示。为清楚起见，这些图示省略了支撑板11和粘附层12。如图6所示，在xyz扫描台21上提供用于成像的样品20。扫描台21可操作成相对于物镜2进行可控移动。特别地，扫描台21可以沿z方向(与显微镜的光轴对准)朝着或远离微球透镜13移动。这样，可以改变微球透镜13和样品20之间的分离距离a，以获得最佳成像性能。在一些实施例中，可以根据物镜2的功率和微球透镜13的特性预选分离距离。通常，在本实施例中，分离距离可在305μm–325μm的范围内。在其他实施例中，可手动调整分离距离以获得最佳结果。

扫描台21也可以在垂直于显微镜光轴的xy平面上移动。这可以通过透过微球透镜13扫描样品20来实现样品的更宽成像。

当然，技术人员会理解，通过相对于固定样品座移动显微镜或物镜，同样可以实现微球透镜13和样品20之间的分离距离的调节或相对于微球透镜样品的扫描。

在图6和图7中，样品20由穿过物镜2的光9以反射模式照亮。然而，本领域技术人员应理解，鉴于提供有合适的样品安装座或扫描台21也可以在透射照明下使用本发明。

在图6和图7中，在微球透镜13和样品20之间提供流体8，其通常为蒸馏水或去离子水。由于折射率、目标上的光强度和焦平面距离的调整，提供这种流体可以提高成像性能。液体可直接施加在样品表面。在一些实施例中，盖14的顶部16可设有额外的密封突起，以保持流体相对于样品20的位置。

更具体地说，如图7所示，照明9由光源30产生。光源30产生的光34由透镜31-33和光圈35聚焦和准直。成像是通过使用成像设备40来实现的，成像设备40通常包括ccd阵列等。提供分束器41，例如近红外热镜，以使来自光源30的照明能够被引导到样品，并使来自样品的反射光传递到成像设备40。如有必要，成像设备可配备额外的透镜42以改善聚焦或视野，还可以配备低通滤波器43。

为了进一步提高图像的分辨率，可在照明光透镜的路径中提供一个附加的光圈(狭缝调制器(slitmodulator))50，以产生暗场并照亮目标样品。该光圈会拒绝聚焦光外的光线，否则会到达探测器，导致模糊。光圈50越小，分辨率增加得就越高，尽管会降低视场。最佳缝宽在0.2mm-2mm范围内。附加光圈50的效果如图8中的图像所示，其中：图8a为使用附加光圈50的加工硅片的捕获图像；图8b为不使用附加光圈50的相同硅片的捕获图像；图8d为使用附加光圈50的荧光染色convallariamajalis花瓣硅片的捕获图像；图8c为未使用附加光圈50的荧光染色convallariamajalis花瓣硅片的捕获图像。在物镜2和样品之间使用微球透镜13对使用本设置方式捕获的图像引入了一些径向失真。这种失真(称为枕形失真(pincushiondistortion))的本质是点在远离光轴的径向方向上位移。这导致直线被成像为曲线。图9a拍摄的图像说明了这种失真。

如本领域所知，可以使用枕形失真图像处理算法来校正这种失真。由图像处理算法生成的图9a图像的校正版本如图9b所示。

附加地或替代地，微球透镜可以由截断的微球而不是全微球形成。在这种情况下，微球在垂直于光轴且基本上平行于样品平面的平面上被截断。提供一个平面对着来自样品的光，可以减少捕获图像的失真，但会降低分辨率。

图7中还显示了能够实现使用该设备进行机加工的其它组件。这些组件及其操作如图7和图10a-10c所示。具体来说，这些组件包括激光60，它可以是带尾纤的二极管激光器(光功率高达1w，例如在925nm处)，可操作成产生用于加工样品20表面的激光束65。为了实现加工(纳米光刻)，激光束65传输通过光纤61和红外激光光纤耦合器62。随后，光束65通过透镜63进行准直，然后通过二向色镜64(定位成45度)导向到物镜2中。该二向色镜64将激光60与成像系统耦合。激光束穿过物镜2、支撑板11和粘附层12，到达聚焦光束65的微球透镜13。光束65由微球13在距离“a”(取决于球体直径)处聚焦。使用z定位台21调整该距离。根据在计算机软件中绘制的图案，使用xy载物台21移动样品。微球13可可选地浸入液体中(取决于微球13的折射率)。在一个示例中，使用该设备可绘制图案的最小点态特征为30nm(例如：使用5um二氧化硅微球和钨基板)。图案22的深度可以通过调整激光60的功率级来调整。图案22的深度和分辨率当然也取决于样品20的性质。虽然聚合物不能提供很好的分辨率，但金属可以提供30纳米以下的分辨率。图10c示出了使用由二氧化硅(sio2)形成的直径为5um的微球透镜13在gestte基板上形成的图案22的示例。

如果需要，可以在加工的同时对样品20进行成像。为此，使用光源30将白光34注入物镜2。形成一个传输到相机40上的虚拟图像。可以使用狭缝50调整图像分辨率，以拒绝来自样品20的不需要的反射光。红外激光束65的多余反射在到达相机40之前通过低通滤波器43被拒绝。

对于无需加工的成像，激光器60关闭。利用光源30将光34注入系统中的微球透镜13。形成一个传输到相机40上的虚拟图像。可以使用狭缝50调整图像分辨率，以拒绝来自样品20的不需要的反射光。红外激光束65的多余反射在到达相机40之前通过低通滤波器43被拒绝。

现参见图11，其显示了本发明的另一实施例。在本实施例中，与前面实施例一样，物镜附件10包括盖14，盖14具有基本上为管状的管状体15和顶部16。除盖14外，附件10还包括底座100，其为套环形式，适于牢固地附接到物镜2的壳体3上。底座100包含步进电机，并通过螺纹元件101连接到盖14上。因此，操作电机可以精确地控制盖14和底座100的相对位移。因此，这也可以控制物镜2和微球透镜13之间的相对位移。

为了补偿位移的这种变化，可以在微球13和物镜2之间提供渐变折射率光学元件102，该元件102具有随与其光轴的径向距离增加而减小的折射率。在一些实施例中，渐变折射率光学元件102可直接固定到支撑板11上。在其他实施例中，支撑板11可有效地包含渐变折射率光学元件的端面。

图11的实施例可用于将物镜附件直接放置在物镜壳体3上时、或通过渐变折射率光学元件102将内窥镜探头光学连接到物镜2上时的成像。

现请参见图12，其示出了本发明的替代实施例，其能够实现物镜2和微球透镜13之间的相对位移的控制。如图11所示，与前面实施例一样，物镜附件10包括盖14，盖14具有大体呈管状的本体15和顶部16。除盖14外，附件10还包括底座100，其为套环的形式，适于通过固定螺钉103牢固地附接到物镜2的壳体3上。在本实施例中，底座100是通过压电驱动器104而不是螺纹101连接到盖14。将适当的输入应用于该些压电驱动器，能够实现物镜2和微球透镜13之间的相对位移的可控调节。

现请参见图13，其示出了本发明的又一实施例。在本实施例中，物镜附件10固定在扫描台200提供的承窝(socket)201内。物镜附件10配有扩展底座110，该底座适合于插座201。通常，这可以通过使用穿过底座110边缘111的销、螺钉或类似物来实现。扫描台200可操作，以控制盖14相对于物镜2的位置，以及提供沿光轴方向盖14相对于物镜2的相对位移和/或在垂直于光轴的平面上盖14相对于物镜2的相对位移的快速调整。

以上实施例仅以示例的方式描述。在不脱离所附权利要求书中所定义的本发明范围的情况下，可能有许多的变化。