光学阻挡结构的制作方法

本申请要求2017年3月7日提交的美国临时申请号62/468,355的权益，该专利申请特此通过引用被全部并入本文。本申请还要求2017年5 月5日提交的荷兰专利申请号N2018854的优先权，该专利申请特此通过引用被全部并入本文。

技术领域

本实用新型涉及但不限于成像系统和光学阻挡结构。

背景技术：

在生物领域中的许多进步已经从改进的成像系统和技术(诸如，例如在光学显微镜和扫描仪中使用的成像系统和技术)中受益。使用这些成像系统在成像过程中获得准确的焦点对于成功的成像操作可能很重要。另外，减少与将系统聚焦在样品上相关联的时延提高了系统可以操作的速度。

许多早已存在的扫描系统使用多光束聚焦跟踪系统来确定对于给定样品的焦点距离。多光束系统使用物镜将两个光束聚焦到样品上。聚焦光束从样品的表面反射，且反射光束指向图像传感器。反射光束在图像传感器上形成光斑，且在光斑之间的距离可用于确定焦点距离。

早已存在的系统的设计者不断地努力提高聚焦准确度和系统可确定聚焦设置的速度。提高准确度可能很重要，因为它可以允许系统实现更好的结果。减少时延可能是一个重要的考虑因素，因为它可以允许系统更快地实现焦点确定，从而允许系统更快地完成扫描操作。

技术实现要素：

本文公开的技术的各种示例提供了用于提高光学系统中的聚焦跟踪的准确度的系统和方法。另外的示例提供了用于减少与光学扫描仪中的聚焦跟踪相关联的时延的系统和方法。在一些示例中，提供用于改进或减少与光学扫描仪中的聚焦跟踪相关联的时延的系统和方法。

在一些示例中，光学阻挡结构包括：界定孔径的框架；第一和第二细长结构构件，每个细长结构构件包括第一和第二端，使得第一和第二细长结构构件在它们的第一端处连接到孔径的相对侧，且进一步使得第一和第二细长结构构件从框架平行于彼此并在与彼此相同的方向上延伸；以及光学不透明阻挡构件，其定位成在第一和第二阻挡构件的各自的第二端之间延伸。

仅作为另一示例，阻挡构件的前表面可形成阻挡面，该阻挡面被设计尺寸以阻挡来自在成像系统中的样品容器的第一表面的反射光束且不阻挡来自样品容器的第二表面的反射光束。此外，仅作为另一示例，光学阻挡结构可被设计尺寸以布置成相邻于光束分离器，以及阻挡构件的后表面布置在相对于框架的平面成角度的平面中，进一步使得角度被选择，其中阻挡构件的后表面实质上平行于光束分离器的面。在一些实例中，阻挡构件的后表面的宽度可以在大约2mm和7mm之间。此外，仅作为示例，阻挡构件的后表面可以具有被选择来阻挡来自样品容器的第二表面的反射光束而不与从S2和S3表面反射的光束干涉的宽度。在另外的示例中，阻挡构件的后表面的宽度是被选择来阻挡来自样品容器的第二表面的反射光束而不与从表面S2、S3反射的光束干涉的宽度。

此外，在另外的示例中，光学阻挡结构可被设计尺寸用于与扫描系统协作来使用，所述扫描系统使被包含在可包括四个反射表面的多层样品容器中的样品成像，并进一步使得阻挡构件的后表面形成阻挡面，阻挡面被设计尺寸以阻挡来自在成像系统中的样品容器的第一表面的反射光束且不阻挡来自样品容器的第二和第三表面的反射光束。仅作为另一示例，光学阻挡结构可被设计尺寸以具有三角形横截面。

在其他示例中，光学阻挡结构可包括界定孔径的框架，使得孔径被设计尺寸以在宽度上从大约20mm到40mm和在高度上从大约15mm到30 mm；第一结构构件可包括界定细长主体的第一端和第二端，该细长主体被设计尺寸以在长度上在大约20mm和30mm之间；第二结构构件可包括界定第二细长主体的第一端和第二端，该细长主体被设计尺寸以在长度上在大约20mm和30mm之间，使得第一和第二结构构件在它们的第一端处连接到孔径的相对侧，其中第一和第二结构构件从框架平行于彼此并在与彼此相同的方向上延伸；以及光学不透明阻挡构件，其定位成在第一和第二阻挡构件的各自的第二端之间延伸，光学不透明阻挡构件被设计尺寸以在宽度上在大约1mm和20mm之间。

仅作为示例，阻挡构件的前表面可形成阻挡面，该阻挡面被设计尺寸以阻挡来自在成像系统中的样品容器的第一表面的反射光束且不阻挡来自样品容器的第二表面的反射光束。此外，仅作为另一示例，光学阻挡结构可被设计尺寸以布置成相邻于光束分离器，以及阻挡构件的后表面布置在相对于框架的平面成角度的平面中，进一步地，其中角度被选择，使得阻挡构件的后表面实质上平行于光束分离器的面。

在一些示例中，阻挡构件的后表面的宽度可以是被选择来阻挡来自样品容器的第二表面的反射光束而不与从S2和S3表面反射的光束干涉的宽度。在一些实例中，仅作为示例，光学阻挡结构可被设计尺寸用于与扫描系统协作来使用，所述扫描系统使被包含在可包括四个反射表面的多层样品容器中的样品成像，并进一步使得阻挡构件的后表面可形成阻挡面，该阻挡面被设计尺寸以阻挡来自在成像系统中的样品容器的第一表面的反射光束且不阻挡来自样品容器的第二和第三表面的反射光束。此外，光学阻挡结构可被设计尺寸以具有三角形横截面。

在一些示例中，也可公开一种成像系统，其中成像系统包括激光光源；差分分离窗口，其将从光源发射的光分成多个平行光束；样品容器，其可包括布置在基底上处于接触关系中的第一、第二和第三层，这些层包括在样品容器的第一层处的第一反射表面、在第一和第二层之间的第二反射表面、在第二和第三层之间的第三反射表面以及在第三层和基底之间的第四反射表面；物镜，其定位成将来自光源的光聚焦到第二和第三反射表面的至少一个上并接收从样品容器反射的光；图像传感器，其包括定位成接收从样品容器反射的光的多个像素位置；第一阻挡结构，其定位成阻止来自第一表面的反射到达图像传感器；以及第二阻挡结构，其定位成阻止来自第四表面的反射到达图像传感器。

作为示例，成像系统还可包括布置在成像系统的在物镜和图像传感器之间的光学返回路径中的分离器，进一步使得第二阻挡结构定位在返回光学路径中以在分离器的输出处阻挡来自第四表面的反射。

在额外的示例中，第二阻挡结构还可包括：界定孔径的框架；第一和第二细长结构构件，每个细长结构构件包括第一和第二端，使得第一和第二细长结构构件在它们的第一端处连接到孔径的相对侧，且进一步使得第一和第二细长结构构件从框架平行于彼此并在与彼此相同的方向上延伸；以及光学不透明阻挡构件，其定位成在第一和第二阻挡构件的各自的第二端之间延伸。此外，在一些实例中，阻挡构件的前表面可形成阻挡面，该阻挡面被设计尺寸以阻挡来自在成像系统中的样品容器的第一表面的反射光束且不阻挡来自样品容器的第二表面的反射光束。在额外的实例中，仅作为另一示例，第二阻挡结构可被设计尺寸以布置成相邻于光束分离器，以及阻挡构件的后表面可布置在相对于框架的平面成角度的平面中，进一步使得角度被选择，其中阻挡构件的后表面实质上平行于光束分离器的面。

仅作为示例，第二阻挡结构的后表面的宽度可以在大约2mm和7mm 之间。此外，仅作为另一示例，第二阻挡结构可被设计尺寸用于与扫描系统协作来使用，所述扫描系统使被包含在可包括四个反射表面的多层样品容器中的样品成像，并进一步使得阻挡构件的后表面形成阻挡面，该阻挡面被设计尺寸以阻挡来自在成像系统中的样品容器的第一表面的反射光束且不阻挡来自样品容器的第二和第三表面的反射光束。

此外，第一阻挡结构可包括孔径，其被设计尺寸以阻挡来自样品容器的第一表面的反射光束并允许从样品容器的第二和第三表面反射的光束通过孔径。

从结合附图采用的下面的详细描述中，所公开的示例的其它特征和方面将变得明显，附图作为示例示出根据本实用新型的示例的特征。该概述并非旨在限制本实用新型的范围，本实用新型的范围仅由其所附的权利要求限定。

附图说明

参考以下附图详细描述根据一个或更多个示例实现的本文公开的技术。这些附图被提供以便于读者理解所公开的技术，并且没有被规定为穷尽的或将本公开限制到所公开的精确形式。实际上，在附图中的图仅为了说明的目的而被提供，并且仅描绘所公开的技术的示例实现。此外，应注意，为了说明的清楚和容易，附图中的元件不一定按比例绘制。

本文包括的一些附图从不同的视角示出所公开技术的各种示例。尽管附随的描述性文本可以将这样的视图称为“顶”、“底”或“侧”视图，但这样的参考仅仅是描述性的，并且不暗示或要求所公开的技术在特定的空间定向上被实现或使用，除非另外明确地说明。

图1示出图像扫描系统的一个示例的简化框图，本文公开的系统和方法可以使用该图像扫描系统来实现。

图2A和图2B示出用于聚焦跟踪的示例光学系统。特别地，图2A示出根据本文描述的系统和方法的一个示例实现的用于聚焦跟踪的示例光学设计。图2B是示出在图2A中显示的光学系统的一部分的可选视图的示意图。

图3A示出包括多个层的被配置为容纳一个或更多个待成像的样品的样品容器的示例。

图3B是示出在一些环境中来自多层样品容器的多个表面的期望和不需要的反射的创建的示例的图。

图3C是示出在图像传感器上的不需要的反射的影响的示例的图。

图3D是示出根据本文公开的技术的示例应用的、作为阻挡结构的放置的结果的在图像传感器处的噪声的减少的图。

图4A示出根据本文描述的系统和方法的一个示例性实现的、包括聚焦跟踪光束被引导到其上的多个像素(为了图示的清楚而未示出)的图像传感器的一部分。

图4B是示出使用被调整以沿着聚焦跟踪光束的光路定位光束腰的准直透镜，以不同聚焦设置从S2和S3表面反射到图像传感器上的左和右聚焦光束的强度的图。

图4C是示出使用被调节以沿聚焦跟踪光束的光路更优化地定位在光束腰处的准直透镜在不同聚焦设置下从S2和S3表面反射到图像传感器上的左和右聚焦光束的强度的图。

图5A是示出被实现为使聚焦跟踪光束会聚在样品平面上并被聚焦到图像传感器上的透镜的示例的图。

图5B是示出被实现为使聚焦跟踪光束会聚到图像传感器上的屋脊棱镜的示例的图。

图6是示出包括定位成将聚焦跟踪光束的光束腰放置在选定位置处的透镜的示例配置的图。

图7是示出聚焦跟踪系统的示例的图，本文所述的系统和方法可使用该聚焦跟踪系统来实现。

图8和图9是示出在一个示例中的反射聚焦跟踪光束的空间关系的图。

图10是示出阻挡来自S4表面的左和右聚焦跟踪光束的反射的光束阻挡器的示例放置的图。

图11和图12是示出在图7的示例配置中的光束分离器处的反射聚焦跟踪光束的空间关系的图，光束阻挡器如图10所示被放置。

图13和图14示出在一个示例中从顶部潜望镜和光束分离器反射的光束。

图15A是示出自物镜返回并指向分离器的从表面S2和S4反射的聚焦跟踪光束的示例的自顶向下视图。

图15B是图15A的特写视图，其示出如何可以通过阻挡构件在分离器的后表面处阻挡S4反射光束。

图15C是示出位于分离器的后表面处的阻挡构件的示例的自顶向下视图的图。

图15D是示出在分离器处的反射聚焦跟踪光束的光束路径中的4mm 宽阻挡结构的表示的图。

图16A和图16B是示出根据参考图8-10描述的示例实现的、可用于阻挡在滤波器/分离器处的S4反射的光束阻挡器的示例的图。

图17A呈现在一个示例中安装在光束分离器处的光束阻挡器的剖视图。

图17B呈现安装在光束分离器处的光束阻挡器的后视图。

图18A示出可用于阻挡从S1表面反射的光束的孔径的示例。

图18B示出在垂直于光束轴的光束分离器前面的孔径的示例放置。

图19示出来自顶部潜望镜处的用于聚焦在样品的顶部处的光束的光斑。

图20示出来自顶部潜望镜处的用于聚焦在样品的底部处的光束的光斑。

图21示出当聚焦于S2时用于在捕获范围的顶部处成像的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。

图22示出当聚焦于S2时用于在捕获范围的底部处成像的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。

图23示出当聚焦于S3时用于在捕获范围的顶部处成像的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。

图24示出当聚焦于S3时用于在捕获范围的底部处成像的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。

图25A示出在一个示例中在激光二极管在激光发射模式中操作的情况下的、图像传感器上的光束光斑中的光斑边缘变化。

图25B示出在一个示例中在激光二极管在低功率模式中操作的情况下的、图像传感器上的光束光斑中的光斑剖面。

图26是示出在ASE模式中操作的激光二极管的示例的图。

图27是示出在激光发射模式中操作的激光二极管的示例的图。

图28是示出在混合模式中操作的激光二极管的示例的图。

图29示出当激光二极管被提供动力以在激光发射模式中操作时光斑尺寸的不稳定性。

图30A示出在激光二极管在混合模式中操作的情况下的光斑移动的示例。

图30B示出在激光二极管在混合模式中操作的情况下的光斑移动的示例。

图31是示出被测试以确定在5％处的光谱宽和设定功率之间的关系的各种激光源的光谱宽的示例的图。

应该理解，所公开的技术可以在修改和变更的情况下被实施，并且所公开的技术仅由权利要求及其等同物限制。

具体实施方式

本文公开的技术的各种示例实现提供了用于增加或减少与在光学扫描仪中的聚焦跟踪相关联的时延的系统和方法。各种附加示例提供了用于提高在光学扫描仪中的聚焦跟踪系统的准确度的系统和方法。又一些另外的示例组合这两者的方面。例如，在一些示例中，提供系统和方法以阻止由来自样品容器的不需要的反射引起的杂散光到达图像传感器并阻碍聚焦跟踪光束的检测。在一些应用中，用于扫描系统的样品容器可以包括夹在两个或更多个其他层之间的样品层。在这样的应用中，由多层样品容器呈现的表面可以每个使反射光束回到物镜并进入扫描系统的返回路径中。在一些情况下可能比来自样品层的反射强得多的不需要的反射可降低在图像传感器处的信噪比，使其难以在所有其他光学噪声中检测实际聚焦跟踪光束。不需要的反射或散射光束也可能与在图像传感器处的聚焦跟踪光斑重叠并与聚焦跟踪光斑相干干涉，并使边缘出现，从而降低聚焦跟踪的准确性。本文公开的系统和方法的示例可以在沿着返回信号路径的一个或更多个点处放置孔径、阻挡条或其他阻挡构件，以提供光学不透明结构以阻止从其他表面反射的不需要的光束到达图像传感器。

作为另一示例，另外的配置可以包括光学结构，诸如在光路中的透镜或其他弯曲或部分弯曲的光学元件，以使聚焦跟踪激光束成形。在各种示例中，这可以通过将光学元件插在物镜之前的光路中以将光束腰定位在系统内来实现。更具体地，在一些实现中，光学元件定位于在离光纤的输出端确定的距离处的光路中，以便将一个或更多个聚焦跟踪光束的光束腰放置在沿着光路的期望定位处。光束腰沿着光路的位置可以被选择使得来自从样品容器的多个感兴趣表面反射的聚焦跟踪光束的因而产生的光斑在图像传感器平面处是彼此相同尺寸或实质上相同的尺寸以提高聚焦跟踪准确度和时延。在另外的实现中，可以提供调整机构来调整光学元件的定位以用于沿着光路的光束腰的最佳放置。

作为又一个示例，其他实现包括用于聚焦跟踪光束的光源的配置和调整。更具体地，一些示例可以被配置为调整和设置激光二极管源操作的功率水平，以减少在图像传感器上的聚焦跟踪光束光斑的边缘通量并提供更稳定和一致的光斑放置。可以设置激光器的功率水平，使得激光二极管在准激光发射模式或混合模式中操作，组合ASE操作模式和激光发射操作模式的方面。功率水平可以被设置在如下范围内：其高端低于激光二极管在其处发射具有单个主谱峰和可忽略的副峰的、通常被认为是高度相干的光的功率，且其低端高于激光器在其处完全发射也称为放大式自发辐射(ASE) 的暂时不相干的光的功率。

在描述本文公开的系统和方法的另外的示例之前，描述示例环境是有用的，系统和方法可以使用该示例环境来实现。一个这样的示例环境是诸如图中所示出的图像扫描系统的环境。示例成像扫描系统可以包括用于获取或产生区域的图像的设备。在图1中概述的示例显示了背光设计实现的示例成像配置。

如在图1的示例中可以看到的，受试者样品定位于样品容器110上，该样品容器110位于在物镜142下方的样品台170上。光源160和相关联的光学器件将光(诸如激光)的光束引导到在样品容器110上的选定样品定位。样品发荧光并且因而得到的光被物镜142收集并被引导至光检器140 以检测荧光。样品台170相对于物镜142移动，以将在样品容器110上的下一个样品定位放置在物镜142的焦点处。样品台110相对于物镜142的移动可以通过移动样品台本身、物镜、整个光学台或前述项的任何组合来实现。另外的示例还可以包括在静止样品之上移动整个成像系统。

流体输送模块或设备100将试剂(例如，荧光核苷酸、缓冲液、酶、裂解试剂等)的流引导至(并穿过)样品容器110和腰阀(waist valve)120。在特定的示例中，样品容器110可以被实现为包括在样品容器110上的多个样品定位处的核酸序列簇的流动池。待测序的样品可以连同其他可选组分一起附着到流动池的基底上。

该系统还包括温度站致动器130和加热器/冷却器135，其可以可选地调节在样品容器110内的流体的条件的温度。可以包括摄像机系统140以监测和跟踪样品容器110的测序。摄像机系统140可以例如被实现为CCD 摄像机，其可以与在滤波器切换组件145内的各种滤波器、物镜142和聚焦激光器/聚焦激光组件150相互作用。摄像机系统140不限于CCD摄像机，并且可以使用其他摄像机和图像传感器技术。

可以包括光源160(例如，在可选地包括多个激光器的组件内的激发激光器)或其他光源，以经由通过光纤接口161(其可以可选地包括一个或更多个再成像透镜、光纤装备等)的照明来对在样品内的荧光测序反应进行照明。低瓦特灯165、聚焦激光器150和反向二色性镜185也呈现在所示示例中。在一些示例中，聚焦激光器150可以在成像期间关闭。在其他示例中，可选的聚焦配置可以包括第二聚焦摄像机(未示出)，该第二聚焦摄像机可以是象限检测器、位置敏感检测器(PSD)或类似的检测器以与数据收集并行地测量从表面反射的散射光束的定位。

虽然被示为背光设备，但是其他示例可以包括来自激光器或其他光源的光，其通过物镜142被引导到在样品容器110上的样品上。样品容器110 可以最终安装在样品台170上，以提供样品容器110相对于物镜142的移动和对准。样品台可以具有一个或更多个致动器，以允许它在三个维度中的任何一个维度中移动。例如，从笛卡尔坐标系方面来说，可以提供致动器以允许台相对于物镜在X、Y和Z方向上移动。这可以允许在样品容器 110上的一个或更多个样品定位被放置成与物镜142光学对准。

在该示例中，聚焦(z轴)部件175被示为被包括以控制光学部件在聚焦方向(被称为z轴或z方向)上相对于样品容器110的定位。聚焦部件175可包括物理地耦合到光学台或样品台或两者的一个或更多个致动器，以使样品台170上的样品容器110相对于光学部件(例如物镜142)移动，以对于成像操作提供适当的聚焦。例如，致动器可以诸如例如通过机械、磁性、流体或者直接或间接地到台的其他附着或与台的其他接触来物理地耦合到相应的台。一个或更多个致动器可以被配置为在保持样品台在同一平面内(例如，保持垂直于光轴的等高或水平姿态)的同时在z方向上移动台。一个或更多个致动器也可以被配置为使台倾斜。例如，这可以被完成，使得样品容器110可以动态地变水平以处理在它的表面中的任何倾斜。

系统的聚焦通常指将物镜的焦平面与在所选样品定位处待成像的样品对准。然而，聚焦还可以指对系统的调整以获得用于样品的表示的期望特性，例如诸如对于测试样品的图像的期望水平的锐度或对比度。由于物镜的焦平面的可用景深非常小(有时在约1μm或更小的数量级上)，因此聚焦部件175紧密跟随正在成像的表面。因为样品容器当固定在仪器中时是不完全平坦的，所以聚焦部件175可以被设置为在沿着扫描方向(被称为y轴)移动的同时遵循该剖面。

从在被成像的样品定位处的测试样品发出的光可以被引导至一个或更多个检测器140。检测器可以包括例如CCD摄像机。可以包括并定位孔径以允许只有从聚焦区域发出的光传到检测器。可以包括孔径以通过滤掉从聚焦区域以外的区域发出的光的分量来提高图像质量。发射滤波器可以被包括在滤波器切换组件145中，该滤波器切换组件145可以被选择来记录所确定的发射波长并且去除任何杂散激光。

在各种应用中，样品容器110可以包括一个或更多个基底，在其上提供样品。例如，在分析大量不同的核酸序列的系统的情况下，样品容器110 可以包括待测序的核酸被结合、附着或关联到其上的一个或更多个基底。在各种实现中，基底可以包括核酸可被附着到的任何惰性基底或基质，例如诸如玻璃表面、塑料表面、乳胶、葡萄聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅晶片。在一些应用中，基底在遍及样品容器110的矩阵或阵列中形成的多个定位处的通道或其他区域内。

尽管未示出，但控制器可以被提供来控制扫描系统的操作。控制器可以被实现为控制系统操作的方面，例如诸如聚焦、台移动和成像操作。在各种实现中，可以使用硬件、机器可读指令或算法或前述项的组合来实现控制器。例如，在一些实现中，控制器可以包括具有相关联的存储器的一个或更多个CPU或处理器。作为另一个示例，控制器可以包括硬件或其他电路来控制操作。例如，该电路可以包括下列项中的一个或更多个：现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、可编程逻辑器件(PLD)、复杂可编程逻辑器件(CPLD)、可编程逻辑阵列(PLA)、可编程阵列逻辑 (PAL)或其他类似的处理设备或电路。作为又一个示例，控制器可以包括该电路与一个或更多个处理器的组合。

通常，对于聚焦操作，由聚焦激光器生成的聚焦光束从样品定位反射以测量所需焦点，并且样品台相对于光学台移动以将光学台聚焦到当前样品定位上。通常将样品台相对于光学台的移动以进行聚焦描述为沿着z轴或在z方向上的移动。术语“z轴”和“z方向”被规定为与它们通常在显微镜和成像系统的技术领域中的使用一致地被使用，其中z轴指焦轴。因此，z轴平移导致增加或减少焦轴的长度。例如，可以通过相对于光学台移动样品台(例如，通过移动样品台或光学元件或两者)来执行z轴平移。因此，可以通过驱动物镜、光学台或样品台或前述项的组合来执行z轴平移，其中的任何一个部件都可以通过启动一个或更多个伺服系统或电动机或与物镜或样品台或两者进行功能通信的其他致动器来被驱动。在各种实现中，致动器可以被配置成使样品台相对于光学台倾斜，以例如有效地使样品容器在垂直于光学成像轴的平面上变平。在执行这种动态倾斜以有效地使样品容器上的样品定位变平的情况下，这可以允许样品容器在x方向和y方向上移动，用于根据需要在z轴上有很少或没有移动的情况下进行扫描。

图2A和图2B示出用于聚焦跟踪的示例光学系统。特别地，图2A示出用于聚焦跟踪的一个示例光学设计。图2B是在图2A中显示的光学系统的一部分的可选视图的示意图。为了避免混乱和便于读者的理解，在图2A 中所示的示例被示为具有单个光束，其在这种情况下是中心光束。该系统可以使用多于一个光束(诸如例如用3个光束)来操作。例如，三光束系统可以提供前瞻和后视聚焦跟踪。

现在参考图2A，激光器270生成用于聚焦光束并且光学地耦合到系统中的光。来自激光器270的光可以例如经由光纤耦合到光束分离器棱镜272，诸如横向位移光束分离器。如果需要，可以包括滤波器，例如用于源选择。棱镜272将发射光束分成大致相等强度的两个实质上平行的光斑。这可以被包括以在聚焦模型中提供差分测量。

衍射光栅274生成输入光束的多个副本。在其他配置中，可以使用光束分离器立方体或多个激光源来生成多个光束。在三光束系统的情况下，衍射光栅274可以为两个输入光束中的每一个生成三个输出光束。在图2B 处示出的是对于一个输入光束的示例。因为衍射光栅可以生成发散的光束 (如也在图2B所示的)，所以平顶或道威棱镜(dove prism)276重定向多个光束。在一些实现中，棱镜被配置为使得光束会聚在物镜142的光瞳处，所以在样品容器处的光束垂直于样品容器。在图2B中为三输出光束配置示出此的示例。来自样品容器的所接收的信号通过光束分离器277返回并且从反射镜279反射。因为每个光束对发散，所以接收棱镜280和282将光斑结合到图像传感器284的焦平面上。在一些示例中，这些可以被实现为道威和屋脊棱镜以折射并瞄准离开显微镜物体的射线以在图像传感器阵列上配合。可以使用屋脊棱镜来折射返回光束，以将在光斑对内的光斑结合到图像传感器的焦平面上，以及道威棱镜使前/后光斑对折射以将所有光斑对结合到焦平面上。使用三光束前瞻，三个光束穿过屋脊棱镜的两个棱镜半部分中的每一个。但是，在另一个轴上，光束发散，这就是为什么道威棱镜被包括以纠正这些问题。

在上面参考图2A和图2B描述的各种示例中，使用棱镜来实现各种光学部件。这些中的一些或全部可以使用透镜来实现，然而棱镜可能是合乎需要的，因为与它们的透镜对应物相比，这些部件通常对未对准较不敏感。棱镜也可能比透镜系统更合乎需要，因为棱镜通常更紧凑并且包括更少的元件。

在图1、图2A和图2B的示例中的物镜142提供了在样品容器上的大致圆形的视场。在一个实现中，视场的中心是正在成像的当前样品定位。在该视场内的扫描方向是x或y轴。为了讨论的目的，扫描的方向将被假定为在y方向上。光源(诸如LED或激光光源)生成聚焦光束。在所示示例中，使用三个光束来提供三点差分离轴预测性焦点估计，一个光束用于当前样品定位，而两个附加光束用于前瞻和后视聚焦跟踪。这两个附加光束用于确定在光学台与在样品容器上的样品定位之间沿z轴的焦点距离。

在图1、图2A和图2B中描述的系统示出示例系统，本文描述的系统和方法可以使用该示例系统来实现。尽管本文可能在此示例系统的上下文中不时地描述系统和方法，但这只是一个示例，这些系统和方法可以使用这个示例来实现。本文描述的系统和方法可以用这个和其他扫描仪、显微镜和其他成像系统来实现。

早已存在的扫描系统使用用于聚焦操作的准直光。在这种系统中，在光束的整个长度上保持相当一致的直径的准直光被引导到物镜。这个的示例在图2A中示出(以上描述的)，其中准直光束被传送到物镜。物镜将准直光聚焦到样品上。从样品反射的光通过物镜返回，并被重新准直。然后将反射的准直光束引导至系统的图像传感器(例如在图2A的示例中的图像传感器284)。为了聚焦的目的，确定在图像传感器上的反射光束的定位。例如，使用双光束系统，测量在图像传感器上的光斑定位之间的距离以确定聚焦。

虽然准直光是已知的光源和扫描系统，但是发明人已经发现准直光可以不利地影响在各种应用中的聚焦跟踪操作。一种不利影响与从使用对于聚焦跟踪光束的准直光产生的光斑尺寸有关。因为准直光在整个光路中保持相对一致的直径，所以聚焦跟踪光束在图像传感器上使相对大的光斑尺寸成像。较大的光斑尺寸包括在图像传感器上的较大数量的像素，这增加了需要测量的图像传感器的像素的行数。这增加了对于聚焦跟踪操作所需的时间量。

另一个不利影响可能出现在系统中，其中物镜可用于在多个不同的表面处聚焦，但不以等于在这些不同表面之间的距离的量移动。在这种情况下，在图像传感器上可出现从不同表面反射的聚焦跟踪光束的不同光斑尺寸，影响聚焦跟踪操作。图3A是示出这样的现象的示例的图。更特别地，图3A示出其中包含待成像的一个或更多个样品的样品容器包括多个层的示例。现在参考图3A，样品容器330包括3个层334、338和336。在这个3层示例中，在层之间有四个表面。这些在表面S1、S2、S3和S4处示出。在该示例中还示出物镜332，其将聚焦跟踪光束333、335(在2光束系统中有2个)聚焦到样品容器330上用于聚焦操作。

对于聚焦跟踪操作，在一些实例中将成像光束聚焦到表面S2以及在其他实例中将成像光束聚焦表面S3可能很重要。假设在表面S2和S3之间的间隔固定在距离X。在一些应用中，根据物镜332的操作，当改变在表面S2和S3之间的焦点时，物镜可移动大于或小于距离X的距离。因此，从表面S2和S3反射的聚焦跟踪光束333、335可以在不同的直径处被重新准直，使S2光束呈现与S3光束不同的光斑尺寸。

在图4A中示出此的示例。更特别地，图4A示出图像传感器362的一部分，该图像传感器362包括聚焦跟踪光束被引导到其上的多个像素(为了清楚起见未示出)。在情形360中的图的左手侧上，这示出具有来自在双光束系统中的两个聚焦跟踪光束中的每一个的光束光斑34、36的图像传感器部分362。光斑34来自从两个成像表面中的一个成像表面(在本例中假设为S2)反射的左和右光束，并且光斑36来自由两个成像表面中的另一个表面(在这个示例中假设为S3)反射的左和右光束。如在该示例所示的，基于物镜的移动，都被准直并且在进入物镜之前都具有实质上相同的光束直径的两个聚焦跟踪光束现在具有不同的直径并因此在图像传感器上产生不同的光斑尺寸。光斑中的较大的两个各自包括较多数量的像素，且因此增加了需要测量的图像传感器的像素的行数。这增加了对于聚焦跟踪操作所需的时间量。由于这些原因，期望实现诸如在图4A的右手侧所示的情形361的情形，其中来自分别从表面S2和S3反射的左和右光束的光斑34、36实质上是相同的光斑尺寸并且相对较小。

早先存在的系统可以使用聚焦透镜来使聚焦跟踪光束会聚在图像传感器上，并减小或最小化它们在传感器上的光斑尺寸。然而，由于透镜在光学系统中引入曲面，因此在透镜的对准中的微小变化(包括可通过在系统中的热变化引起的变化)可能导致在传感器上的聚焦跟踪光束的放置的不准确。透镜的移动或变化可能导致横向平移，其不同地影响多个聚焦跟踪光束。因此，如上面参考图2A和图2B所述的，在一些示例中，聚焦透镜用屋脊棱镜代替。

图5A是示出被实现为使聚焦跟踪光束会聚到图像传感器上的聚焦透镜的示例的图。现在参考图5A，来自光源(例如图2A的激光二极管270) 的光通过光纤(激光器和光纤未示出)传送到准直透镜400。准直光诸如通过光束分离器棱镜382(例如图2A的光束分离器棱镜272)分成两个光束。为了避免在图示中的不必要的混乱，在透镜370和图像传感器398处示出两个反射聚焦跟踪光束394、395；然而，在图5A的其余部分中仅示出两个聚焦跟踪光束中的一个。

来自光束分离器棱镜382的聚焦跟踪光束穿过光束分离器384并且被反射镜386反射通过物镜390。物镜将光束聚焦到样品容器392(例如图 3A的样品容器330)中的样品上。在该示例中，聚焦跟踪光束从样品容器 392的S2表面反射。反射光束(仍然仅示出一个光束394)通过物镜390 返回，从反射镜386和光束分离器384反射，并且被引导到透镜370。由于返回光束394、395在这个点处发散，所以透镜370被实现以使返回光束394、395会聚到图像传感器398上。而且，由于聚焦跟踪光束394、395 是准直光，所以透镜370提供将光束聚焦成在图像传感器398上的较小光斑尺寸的附加功能。然而，因为透镜370的横向放置中的改变影响了在图像传感器398上的光束的定位，所以这些改变引入了聚焦跟踪误差。

图5B是示出其中透镜370用屋脊棱镜396代替以避免由透镜370的横向放置中的变化引起的问题的示例的图。用屋脊棱镜396代替透镜减少或消除了系统对透镜的横向位置的敏感性。由于热和其他变化引起的棱镜的变化不影响在图像传感器398上的聚焦跟踪光束394、395的间距。因此棱镜的角度偏差完全由玻璃的角度决定，所以屋脊棱镜396的横向位移不影响光束。

代替透镜370来包括屋脊棱镜396可以提高聚焦跟踪系统的准确度。由于在光斑之间的间隔用于测量从物镜到样品容器的距离，因此当光束的间隔仅取决于到样品容器的距离时，更高水平的准确度被达到。影响光束间隔的其他变量(诸如，由透镜370的放置中的横向不精确度引入的变量) 消极地影响聚焦跟踪系统的准确度。因此，包括屋脊棱镜(其甚至在存在某个横向位移的情况下也呈现与聚焦跟踪光束的相同角度)可以极大地有益于系统的准确度。

移除透镜有一个缺点。因为透镜被消除，所以聚焦跟踪光束(在这个示例中是光束394、395)没有聚焦在传感器上。因此，在各种示例中，不是如早先存在的扫描系统进行的那样使用准直光，聚焦跟踪光束被聚焦以将腰放置在沿光路的给定点处。这在图像传感器上呈现较小的光斑尺寸。例如，在一个应用中，准直透镜400比它以其他方式被放置的从光纤输出端移动得更远，以准直来自光纤的光。沿准直透镜400被放置于的光路的点规定光束腰沿光路放置的位置。准直透镜400可被定位成提供腰，使得尽管用屋脊棱镜396代替透镜370，反射聚焦跟踪光束394、395能够以减小的光斑尺寸聚焦到图像传感器398上。

移动准直透镜400以将光束腰放置在光路中的另一益处在于，这可以有助于减小或消除上面参考图4A讨论的光斑尺寸中的不平衡。透镜400 可以被提供并定位在光路中，使得通过物镜以及通过光路的其余部分从样品返回的光以与在情形361中所示的实质上相同的光斑尺寸撞射在传感器上。更特别地，在一些实例中，将透镜定位在距光纤输出端一定距离处，以将光束腰放置在距准直仪的预定距离处，以平衡从样品容器的上表面和下表面传播到图像传感器的光束的直径。

在一个应用中，光束腰位于距准直仪690mm-700mm的距离处，以平衡和减小撞击在图像传感器上的光束的直径。在一些示例中，光斑尺寸可以减小到大约400μm。在其他示例中，光斑尺寸可以在300μm至500μm 的范围内。在又一些其他示例中，可以使用其他光斑尺寸。

另外，准直透镜400将光束腰放置在光路中的移动可以有助于平衡撞击在图像传感器上的光的强度。图4B是示出使用被调节以在非最佳定位处提供光束腰的准直透镜在不同聚焦设置下从S2和S3表面反射到图像传感器上的左和右聚焦光束的强度的图。在该图中，光斑亮度在垂直轴上，并且聚焦台的位置在水平轴上。在一个示例实现中，在图的左手侧上的垂直蓝线示出对于S2反射的最佳聚焦位置。类似地，在该示例实现中，在图的右手侧上的垂直蓝线示出对于S3反射的最佳聚焦位置。如该图所示，在S2聚焦位置处，对于S2光束的平均光斑亮度约为170，而在优化S3 聚焦位置处，对于S3光束的平均光斑亮度约为85。因此，对于S2和S3 光束的光斑强度不平衡。

图4C是示出使用被调节以沿聚焦跟踪光束的光路更优化地定位在光束腰处的准直透镜在不同聚焦设置下从S2和S3表面反射到图像传感器上的左和右聚焦光束的强度的图。在这里，当光束腰沿光路定位时，S2和 S3反射光束的强度更加平衡。特别地，该图示出在S2最佳聚焦位置处左和右S2光束具有大约125的平均光斑亮度。这也说明在S3最佳聚焦位置处，左和右S3光束具有大约130的平均光斑亮度。作为图4B和4C的比较，示出沿光路的光束腰的放置可影响S2和S3聚焦跟踪光束的强度的平衡。

图6是示出包括定位成将聚焦跟踪光束的光束腰放置在选定位置处的透镜的示例配置的图。在该示例中，来自诸如激光光源(例如光源270) 的光源(未示出)的光由光纤电缆432携带，该光纤电缆432经由套圈434 连接到透镜壳体组件。套圈434安装在固定地附接到插入件436的安装块 435中。给定焦距的透镜440被放置在距光纤432的输出端确定的距离处，并且可以通过透镜壳体组件保持在该距离处。在该示例中，来自光纤的光行进穿过安装在主体部分438中的插入件436中的孔径。选择透镜440的焦距及它离光纤432的输出端的距离以将光束腰放置在沿着光路的期望位置处。如上面提到的，在光纤的输出端与透镜440之间的距离被选择为将光束腰放置在期望位置处，如下面更充分描述的。

在这个示例中，在透镜440和光纤输出端之间的间隔是14.23mm，其为在透镜表面和光纤之间的工作距离。15.7mm是透镜的有效焦距(其比透镜的后焦距更高，因为它是相对于透镜主平面)。因为在准直器中的透镜的后焦距为13.98mm，其为在光轴上的从透镜顶点到透镜的焦点的距离，所以后焦距短于14.23mm。

在所示的示例中，插入件436可滑动地安装在由主体部分438限定的腔内，使得在光纤输出端和透镜440之间的距离可由可滑动地安装在主体部分438的腔内的插入件436调整。可以包括定位螺钉442或其它锁定机构以将插入件436锁定在主体部分438内地方。使用可滑动的插入件436 允许系统被调整以调节或优化在图像传感器上的光斑尺寸。这可以允许最终的系统配置调整或现场调节。图6所示的示例中，透镜440是平凸透镜。然而，在阅读了本描述之后，本领域中的普通技术人员将理解，可以使用其他透镜结构，包括例如双凸透镜。

在一些应用中，透镜被配置为使得光束腰位于物镜内。更特别地，在一些应用中，透镜被配置为使得在光束撞击在样品上之前光束腰被定位在物镜内，而在其他应用中，透镜被配置为使得在光束从样品反射之后光束腰被定位在物镜内。在其他应用中，透镜被配置成使得光束腰出现在物镜之前、在反射光束离开物镜之后或在物镜与样品之间。透镜的放置可以通过迭代过程、诸如通过建模软件的使用来确定以实现在图像传感器上的期望光斑尺寸和平衡。

除了平衡光斑尺寸之外，通常利用更小的光斑尺寸来提高聚焦可以被确定的速度。从图像传感器读取信息所需的时间影响聚焦跟踪系统的时延。更特别地，对于具有给定像素密度的传感器，较大的光斑尺寸覆盖更多的像素，并且需要更多的时间来从在光斑直径内的每个像素读取数据。因此，如上面讨论的，用于平衡光束直径的透镜也可以用于减小撞击在图像传感器上的光斑的尺寸，从而减少为了聚焦操作而确定光斑定位(或用于多光束聚焦的定位)所需的时间量。

如上面参考图3A所讨论的，在一些应用中，可以使用多层样品容器来携带将由扫描系统成像的样品。如在那个示例中所讨论的，待成像的样品可以被包含在层338中的溶液中。为了使成像发生，至少层334必须对用于成像的光束是光学透明的。层336也可以是光学透明的。因此，表面 S1、S2、S3和S4通常是反射性的。同样，因为成像光束在层338处到达样品很重要，所以在表面上使用抗反射涂层是不合乎需要的。因此，在聚焦跟踪和成像操作期间来自表面S1和S4的不需要的反射可以在系统中产生不需要的光学噪声，并且可以使来自S2和S3的反射光束变得模糊，该反射光束是在图像传感器处收集的光束。

图3B是示出在一些环境中产生离开多层样品容器的多个表面的不需要的反射的示例的图。如在本例中看到的，三层样品容器包括表面S1、S2、 S3和S4。为了清楚起见，示出单个聚焦跟踪光束465。但是，在其他应用中，可以使用多个聚焦跟踪光束。例如，下面的示例描述了其中描述了两个聚焦跟踪光束的系统。也如在该示例中看到的，光束从表面S1、S2、S3 和S4中的每一个反射。由于样品在表面S2和S3之间，因此这些表面是系统被设计成聚焦于其上的表面。因此，离开表面S1的反射光束467和离开表面S4的反射光束469不返回任何有用的信息并且是不需要的反射。聚焦跟踪的感兴趣反射是离开表面S2和S3的反射。相应地，如果来自离开表面S1和S4的反射的光到达检测器，则这可能引入可能干扰聚焦跟踪光束反射的检测的噪声。

图3C是示出在图像传感器上的不需要的反射的影响的示例的图。如在该示例中看到的，除了由聚焦跟踪光束呈现的光斑482之外，还有在图像传感器上出现的相当大数量的噪声，作为不需要的反射的结果。在其他示例中，不需要的反射也可以作为在图像传感器上的附加光斑出现。图3D 是示出根据下面讨论的示例的作为阻挡结构的放置的结果的在图像传感器处的噪声的减少的图。

这个问题在其中离开表面S1和S4的反射具有比离开样品的反射更大强度的情况下加剧。因为重要的是样品容器是光学透明的，所以在样品容器上不提供抗反射涂层。同样，离开玻璃表面的反射往往比离开生物样品的反射更强。另外，在其中样品容器在表面S2和S3上包含纳米井或其他类似图案的应用中，这可以进一步减少离开这些表面的反射。因此，来自表面S1和S4的不需要的反射倾向于具有比离开表面S2和S3的反射更大的强度。例如，在一些应用中，离开表面S1的反射可以多达离开表面S2 和S3的反射的强度的100倍(或更大)。为了补救这个问题并且除去来自聚焦跟踪操作的这些不需要的反射的影响，可以实现各种示例以在沿着在样品和图像传感器之间的光路的所确定的定位处包括阻挡结构，以阻止这个不需要的光到达图像传感器。

图7是示出扫描系统的另一示例的图，本文所述的系统和方法可使用该扫描系统来实现。现在参考图7，该示例包括光源(未示出)，诸如激光光源。例如，在一个应用中，光源可以被配置为使用光纤耦合器以及透镜结构耦合到系统的激光二极管，诸如图6所示的示例。作为另一个示例，光源可以被配置为具有准直器的激光二极管，以提供用于聚焦跟踪操作的准直光。

在这个示例中，来自激光器的光被引入到横向位移棱镜522中以将光分成两个平行光束。其他配置可以用单个聚焦跟踪光束或用多于两个聚焦跟踪光束来实现。在操作中，聚焦跟踪光束通过光束分离器524被发送并且从上部潜望镜526和下部潜望镜528反射。聚焦跟踪光束通过潜望镜窗口530和光束分离器532(其也可以被实现为二向色滤波器)被传送。然后光束从反射镜536反射并且通过物镜538聚焦到样品容器540上。来自样品容器的反射通过物镜返回，并沿着相同的路径行进，直到它们从光束分离器524反射为止。因为光束可以从彼此稍微发散，所以屋脊棱镜546 可以被包括以将光束重新引导到平行定向或者甚至到略微会聚的配置，使得它们都可以被引导到相对较小面积的图像传感器。在该示例中，摄像机转向镜548将聚焦跟踪光束引导至图像传感器550。虽然本文描述的示例阻挡结构是从该示例配置方面来描述的，但是本领域中的普通技术人员在阅读本描述之后将认识到可以如何在不同地配置的系统中使用阻挡结构的不同几何形状或放置以阻挡来自多表面样品容器的不需要的反射。

图7的示例系统被建模以确定从系统中的S1-S4表面反射的光束的路径，以识别沿着返回路径的点，在这些点处来自S1和S4表面的不需要的反射可以被阻止到达图像传感器。作为这种建模的结果，在沿着路径的各个点处的光束的空间关系在图8、图9、图11、图12、图19、图20、图21、图22、图23和图24中示出。如这些图所示的，从表面S1-S4反射的光束的空间关系在系统的整个返回路径中变化。光束定位沿其返回路径的长度相对于彼此改变，并且定位也根据样品容器相对于物镜的放置而改变。增加复杂性在于存在在前向方向和返回方向上延伸的聚焦光束，并且还存在也在两个方向上延伸的成像光束。因此，在避免对期望的聚焦跟踪和成像光束的干涉的同时，在光路内在适当的地方配置阻挡结构并不是不重要的任务，该阻挡结构有效地阻止不需要的反射在图像传感器上传递噪声。

图8和图9是示出在使用多层样品容器(诸如图3B所示的多层样品容器)的图7的示例配置中在光束分离器532处的反射聚焦跟踪光束的空间关系的图。图8和图9显示在21mm x 21mm面积内的光束。图8示出当系统被配置为聚焦在表面S2处的样品井的顶部时在光束分离器532处的光束的空间关系，而图9示出在系统被配置为聚焦在表面S3处的样品井的底部上的情况下在光束分离器532处的光束的空间关系。这些图示出在光束分离器532处在系统聚焦在S2和S3处的情况下反射光束以三个空间组撞击在表面上：离开表面S1、S2和S3的左聚焦跟踪光束的反射在第一组中；离开表面S1、S2和S3的右聚焦跟踪光束的反射在与第一组物理地分离的第二组中；并且从表面S4反射的左和右聚焦跟踪光束在这两组之间的区域中。利用在光束当中的这种空间关系，使用孔径配置来有效地阻止表面S1的左和右反射同时允许离开表面S2和S3的期望反射不受抑制地通过将很难。然而，因为存在离开表面S4的反射相对于其他反射的良好的空间分离，所以来自S4表面的反射可能在沿着返回路径的这个点处被阻挡。

图10是示出根据一个示例实现的阻挡来自S4表面的左和右聚焦跟踪光束的反射的光束阻挡器的示例放置的图。这个示例显示来自表面S4的反射424在光束分离器532处彼此会聚，如在图8和图9中看到的。这个示例还示出阻挡结构可如何被包括以阻挡来自表面S4的这些反射而不干扰来自S2和S3表面的期望反射。这可以在所示出的示例中使用在光束分离器532的聚焦跟踪模块侧上的4mm宽遮蔽来实现。

图11和图12是示出在使用多层样品容器(诸如在图3B中所示的多层样品容器)的图7的示例配置中在光束分离器532处的反射聚焦跟踪光束的空间关系的图。图11和图12显示在25mm×25mm面积内的光束。图11显示了当系统被配置为聚焦在表面S2处的样品井的顶部上时在顶部潜望镜526处的光束的空间关系，而图12显示了在系统配置成聚焦在表面S3处的样品井的底部上的情况下在顶部潜望镜526处的光束的空间关系。因为在这个示例中离开S4表面的聚焦跟踪光束的反射在到达返回路径中的这个点之前在光束分离器532处被阻挡，所以没有来自表面S4的光斑。更重要的是，这表明来自表面S1的反射光束具有与离开S2和S3 表面的期望反射的良好的空间分离。

使用光束的这个空间放置，孔径可以用于阻挡S1反射，同时允许来自S2和S3表面的反射光束穿过并最终到达图像传感器。图13和图14示出从顶部潜望镜526和光束分离器524反射的光束。如这个所示，如果光束没有在顶部潜望镜526处被阻挡，则它们将从光束分离器524反射并撞击在屋脊棱镜546的边缘上。如该建模所示的，可以通过在上部潜望镜526 处放置20mm×20mm孔径来阻挡来自表面S1的反射光束。可选地，可以将上部潜望镜526的尺寸减小到20mm×20mm的尺寸，使得来自S1 表面的反射光束不返回到图像传感器。在其他应用中或对于孔径的其他放置定位，所实现的孔径的尺寸可以基于S1光束的位置而变化。在另一个示例实现中，孔径为20.8mm宽。选择这个宽度以适应在大约-20μm到+30 μm(在一个应用中大约是对于S2的最佳焦点)处的S2图像和在约-25μm 到+25μm(在一个应用中大约是对于S3的最佳焦点)处的S3图像。

图15A提供示出通过物镜538从样品反射并指向光束分离器532的聚焦跟踪光束的自顶向下视图。尽管在图15A中未示出反射镜536，但这示出反射聚焦跟踪光束朝着光束分离器532被反射。这个示例还示出S4反射光束被位于光束分离器532的背面处的光束阻挡器阻挡。尽管在图15A 中未示出光束阻挡器，但一个例证性示例在图16A和图16B中被提供。

图15B提供了图15A的特写视图，示出在光束分离器532的背面处从表面S4反射的聚焦跟踪光束的示例。如该示例所示的，从表面S4反射的聚焦跟踪光束被阻挡构件562阻挡。如该示例也示出的，阻挡构件562的正面被定向为与光束分离器532的背面实质上平行。在一个示例实现中，阻挡构件562布置在系统中以与光束分离器532的背面分开50μm。在其他示例中，可以提供其他分离间距。例如，在一些实现中，间距可以在25 μm-100μm的范围内。尽管该示例将阻挡构件562示为具有矩形横截面，但阻挡构件562可以使用其他形状或几何形状来实现，其示例在下面参考图16A和图16B被示出。

图15C是示出定位在成像系统的一部分内的阻挡构件和分离器的示例的自顶向下视图。在该示例中，阻挡构件562定位在光束分离器532的背面处以阻挡从S4表面反射的光束。从物镜538出射的反射光束朝着光束分离器532被反射镜536反射。阻挡构件562被定位成阻挡从S4表面反射的光束并且具有足够小的宽度，以便不干扰从S2和S3表面反射的光束。

在所示的示例中，阻挡构件562是4mm宽且长度为2mm，并从物镜 538的光轴稍微偏离。然而，它与安装在壳体565中的下部潜望镜528的中心对齐。更具体地，在一个示例实现中，阻挡构件562与物镜光轴的左侧偏移1.1毫米以确保它相对于从S4表面反射的光束居中。

图15D是示出在分离器处反射聚焦跟踪光束的光束路径中的4mm宽的阻挡结构的表示的图。如这个示例所示的，4mm宽的阻挡结构(由矩形631表示)具有足够的宽度以阻挡从表面S4反射的聚焦跟踪光束，其在图的中心中示出。如该示例也示出的，阻挡构件的宽度被选择为足够宽以阻挡不需要的反射光束，但仍为S2和S3成像提供最大可能的捕获范围。因为在聚焦中的微小变化可以有在光束分离器处的光束的位置中的相应的变化，所以可以将阻挡构件的宽度选择为稍宽于在完美聚焦条件下阻挡光束所必需的宽度。换句话说，阻挡构件可以足够宽以适应在聚焦系统中的不精确度的所确定的程度。

图16A和图16B是示出根据参考图8-10描述的示例实现的可用于阻挡在光束分离器532处的S4反射的光束阻挡器的示例的图。图17A至图 18B是示出在图16A和图16B中所示的光束阻挡器的示例性放置的图。图 16A的左手侧示出光束阻挡器620的后视图(从光束的角度看)；以及右手侧示出光束阻挡器620的透视图。光束阻挡器620包括限定反射束可以穿过的孔径624的框架部分622。包括阻挡面630的光束阻挡构件626由延伸臂628支撑在适当的位置上以阻挡来自S4的不需要的反射光束。在所示的示例中，延伸臂628是附着、固定、接合或以其他方式连接到框架部分622的相对侧的细长结构构件，并且光束阻挡构件626越过延伸臂628 的远端延伸。

框架部分622和延伸臂628提供安装结构，通过该安装结构，光束阻挡构件626可以安装在光束分离器532处的适当位置上而不干扰来自表面 S2和S3的反射。光束阻挡器620可以被铸造、模制、用机器加工或以其他方式制造为整体结构。在其他示例中，构成光束阻挡器620的元件可以是被附着、接合、紧固或以其他方式连接在一起以形成作为结果的组件的单独部件。光束阻挡器620可以使用光吸收不透明表面来实现，以避免在系统内的其他不需要的反射。例如，光束阻挡器620可以使用黑色阳极氧化铝或其他光吸收或光吸收涂覆材料制成。光束阻挡器620可以针对特定的应用被设计尺寸。在一个示例应用中，光束阻挡器620被设计尺寸以提供：30mm的孔径宽度和21mm的高度；25mm长的延伸臂628；以及2.8 mm宽和21mm长的阻挡表面。

现在参考图16B，视图682示出光束阻挡器620的自顶向下视图，并且视图683示出在光束阻挡器620的A处的横截面侧视图。延伸臂628的前边缘逐渐变细以符合光束分离器532的角度，如在图17A和图17B(下面描述)中进一步所示的。光束阻挡构件具有三角形横截面并且被定向为将平坦阻挡面630呈现给入射光束。虽然可以使用光吸收材料来制造光束阻挡器620，但是向不需要的光束呈现三角形横截面可以具有从返回路径反射任何未被吸收的光的效果。

图17A示出安装在光束分离器532处的光束阻挡器620的剖视图。现在参考图17A，在操作中，来自表面S1、S2、S3和S4的聚焦跟踪光束的反射从物镜向上行进，从反射镜536反射并且指向光束分离器532。阻挡构件626的阻挡面630(见图16A和图16B)阻止S4反射继续穿过光束分离器532。在该示例中示出，延伸臂628被设计尺寸以便将阻挡构件626 放置在光束分离器532的表面处或附近。该图还示出延伸臂628的锥形前锥角，以允许阻挡构件626的阻挡面630被放置为与光束分离器532相邻并且在与光束分离器532实质上相同的角度处。在一些示例中，阻挡构件 626被定位成使得阻挡面630与光束分离器532处于接触关系中。在其他示例中，阻挡构件626被定位成使得阻挡面630与光束分离器532的面分开小的数量，诸如例如50μm至500μm。

在可选的示例中，阻挡元件可以布置在光束分离器532的背侧上，而没有图16A至图17B所示的结构。例如，在一些实例中，可以将不透明材料带附接到光束分离器532的背面。在其他实例中，不透明或光学吸收性涂层能够以窄条纹施加到光束分离器532的后部。

对于扫描操作，成像光束(其例如可以是红色和绿色成像光束)从右手侧进入系统，如箭头690所示的。这些光束从光束分离器532的正面朝着反射镜536反射。反射镜536将成像光束向下反射到物镜中。因此，也选择阻挡构件626的位置，以便不干扰朝着样品反射的成像光束(通过光束分离器532的正面)。

该示例还示出阻挡构件626呈现三角形横截面，其中阻挡构件626的后边缘逐渐变细以在锐角处交会。可以使用对于阻挡构件626的其他横截面几何形状，假定阻挡面630适当地被设计尺寸以阻挡或实质上阻挡来自表面S4的反射。然而，减小朝着阻挡构件626的后部的横截面的几何形状(诸如所示的几何形状)可以使阻挡构件626可能以其他方式提供对期望光束的不需要的干涉的机会最小化。

图17B呈现安装在光束分离器532处的光束阻挡器620的后视图。这示出使用螺栓732安装在适当位置上的框架部分622。这示出由孔径624 提供的窗口，该窗口允许从表面S2和S3(以及稍后在路径中被阻挡的S1) 反射的光通过，而阻挡构件626在它离开光束分离器532之前阻挡来自表面S4的光。

图18A示出可用于阻挡从S1表面反射的光束的孔径的示例。在一个示例中，这可以放置在潜望镜孔径处的聚焦跟踪模块的内壁上。如上面提到的，在一个示例实现中，孔径为20.8mm×20.8mm，但在其他示例中可以提供其他孔径尺寸。与阻挡构件一样，可以选择孔径的尺寸以阻挡不需要的反射，同时相对于“最佳聚焦”考虑因素提供对S2和S3反射光束可能的最大捕获范围。图18B示出在垂直于光束轴的光束分离器524前面的孔径694的示例放置740。

图19和图20显示了阻挡S4反射的附加光束阻挡器620和阻挡S1反射的20.8mm×20.8mm孔径的结果。图19显示了来自在用于在样品的顶部(表面S2)处聚焦的顶部潜望镜526处的光束的光斑，以及图20显示了来自在用于在样品的底部(表面S3)处聚焦的顶部潜望镜526处的光束的光斑。

虽然上述内容使用在表面S2和S3处聚焦的物镜来被说明，但完美聚焦并不总是被实现，且因此示例可以被实现以解释在上部和下部样品之上和之下的捕获范围。例如，上述建模也被执行，假设有适应在距上部和下部样品表面+/-25μm内聚焦的“最佳聚焦”。这种“最佳聚焦”建模确认上述结构足以阻挡在最佳聚焦操作下来自S1和S4表面的不需要的反射。

图21-24是示出在示例“最佳聚焦”捕获范围的顶部和底部处的图像传感器处的光斑放置的图。在这个实例中，以+/-25μm的捕获范围执行建模。这些图示出11.26mm x 11.26mm的图像传感器面积。图21示出用于在捕获范围的顶部处成像以用于使用离S2的物镜位置1.064mm聚焦在S2上的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。图22示出用于在捕获范围的底部处成像以用于使用离S2的物镜位置1.014mm聚焦在S2上的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。图21和图22示出离理想聚焦位置的+/-25μm 的变化。图23示出当在S3上聚焦时用于在捕获范围的顶部处成像的S2、 S3反射光束的在摄像机处的光斑。图24示出当在S3上聚焦时用于在捕获范围的底部处成像的S2、S3反射光束的在摄像机处的光斑。

如上所述，在利用多光束系统的聚焦跟踪操作中，测量在图像传感器上的聚焦跟踪光束的光斑之间的光斑间隔或距离，以确定聚焦。因此，光斑间隔的稳定性可能是在实现准确的测量的重要因素。光斑间隔稳定性可能被诸如作为时间的函数的聚焦阶段(有时被称为Z阶段)的光斑质量/ 形状的移动以及用于解析光斑间隔的质心算法的分辨率的因素影响。对光斑间隔稳定性的一个挑战在于光斑固有地包括边缘。由于激光器的模式跳变，边缘图案可改变，这随着时间的推移而引起光斑剖面的变化，其影响聚焦跟踪模块的光斑间隔稳定性。在图25A中示出这个的示例，图25A示出光斑边缘变化。这个示例显示了在12mW的功率下、以250μs的曝光时间、使用在适当位置上的OD 1.0ND滤光器操作的激光器的光斑边缘变化。

在通常被称为放大式自发辐射(ASE)的模式中操作激光器往往提供更干净的光斑剖面。在图25B中示出这个的示例。这个示例是针对以500 μW、250us曝光(无ND滤光器)操作的相同激光二极管。在这种模式下，源发射时间非相干光，更像LED而不是激光器一样运转，并具有5至10nm FWHM(半高全宽强度)的宽光学带宽。然而，在ASE模式下操作有几个缺点，这就是为什么一般早先存在的成像系统不在这种模式中操作。首先，ASE模式不是用于激光二极管的激光发射模式，因此输出功率非常低。它通常被定义为低于其中没有激光发射出现的激光发射阈值的模式。因此，它的输出是时间非相干的，并且包括跨越宽光谱的频率分量。

图26是示出在ASE模式下操作的激光二极管的示例的图。在这个示例中，激光二极管在0.17mW处操作，并且展示具有跨越宽范围的波长的频率分量的相对平坦的光谱(当与在激光发射模式下操作的二极管相比时)。没有单一的操作模式，且输出是不相干的。在光源中的不相干可导致不希望有的效应，诸如相消干涉和色差。另外，在ASE模式下操作可能根本是不切实际的，因为没有被发射来产生足够强度的光束的足够的功率。然而，存在其中激光器可以在ASE模式中操作的其他应用。在这种模式下，激光二极管倾向于更像LED运作，且因此它可能对某些应用是有用的。

图27是示出在激光发射模式中操作的同一激光二极管的示例的图。图27的上半部分的图示出在0.96mW处操作的同一激光二极管，并且图 27的下半部分的图示出在1.22mW处操作的同一激光二极管。在这两种情况下，输出都与在工作频率处的单个主峰和几乎忽略的副峰有效地高度相干。这与没有主峰的ASE模式明显相反。

图28是示出在混合模式中操作的激光二极管的示例的图。图28显示了在该示例中的激光器在0.43mW处操作。在这个功率水平处，几个主峰开始形成，但仍有强的副峰。如该图所示，激光二极管不在强激光发射模式中，然而它也不在完全的ASE模式中。功率水平可能仍然被定义为高于激光发射阈值，但输出不完全相干。

由于ASE模式可在没有足够的功率下产生输出，因此在ASE模式下的操作在操作上不切实际。如上面参考图25A提到的，然而，在激光发射模式中操作扫描系统产生时间变化的边缘，其提供在光斑测量中的不稳定性。

在图29处示出这个的示例，图29显示了根据本文描述的系统和方法的一个示例的、当激光二极管被供电以在激光发射模式中操作时在光斑的形态中的不稳定性。如在该图中所示，在图像传感器上的左光束光斑的标准偏差为1.619像素，而在图像传感器上的右光束光斑的标准偏差为0.518 像素。但是，如对于左和右光斑的曲线图所示的，对于每个光束的光斑的运动可从一个帧到下一帧是显著的，并且实际上可能移动几个像素。对于左光斑的两个相邻帧的光束剖面显示在图的右手侧上的剖面图像中。这些剖面图像说明光束光斑放置的偏差如何随着时间的推移而产生。

由于焦点通过测量在图像传感器上的左和右光斑之间的距离来确定，因此在光斑放置中的变化可导致聚焦跟踪的不准确性。如在图29的顶部两个曲线图中所示的左和右光束的运动的影响在图的底部曲线图中示出。该曲线图显示了在相同数量的帧上在左和右光斑之间的距离变化(在此被称为Delta X)。这显示1.178像素的标准偏差，其导致具有95％置信区间 (对于高斯群体，～2*StDev)的+/-139nm的光斑间隔稳定性。这如图所示被计算为(1.178*1.96)/16.36＝+/-139nm。16.36因子表示以像素/μm 为单位的聚焦跟踪增益。它表示对于物镜到样品距离的每1μm移动获得多少个光斑间隔的像素。它用于光斑间隔中的增量(像素)到在z方向上的空间中的增量(nm)的转换。

本发明人已经发现，干涉边缘图案由于样品容器的多级结构而出现，如图3A所示。本发明人还发现，这是在多层玻璃样品容器内的多个光束和/或散射光的叠加的结果。没有其他变化的样品容器的位置(例如在X 和Y方向上)的变化可以导致边缘的移动。

图30A和图30B示出在激光二极管在混合模式中操作的情况下的光斑移动的附加示例。特别地，图30A和图30B示出具有不是模式跳变的稳定激光器的更优化的情形。如图30A所示，左光斑的标准偏差下降到0.069 像素，而右光斑下降到0.064像素。如在图上的上部两个曲线图所示，从一个帧到另一帧的光斑移动通常小于一个像素。由于运动可以是加性的，因此在左和右光斑之间的Delta X差异可能有0.122像素的标准偏差。这将光斑间隔稳定性降低至+/-15.2nm((0.122*1.96)/16.36nm＝+/-15.2nm)。在这里，16.36是以像素/μm为单位的FTM增益。这是当物镜在Z轴上移动1μm时获得的像素中的Delta X的量。这可用于将Delta X中的像素转换为Z空间中的μm，反之亦然。此外，1.96是对于标准偏差的倍增因子，以表示分布(假设它是高斯分布)的误差的95％置信区间。

在图30B的示例中，左光斑的标准偏差下降到0.069像素，并且右光斑也下降到0.069像素。如在图上的上面两个曲线图所示，从一个帧到另一帧的光斑移动通常小于一个像素。由于运动可以是加性的，因此在左和右光斑之间的Delta X差异可能有0.127像素的标准偏差。这将光斑间隔稳定性降低至+/-14.6nm((0.127*1.96)/16.36nm＝+/-14.6nm)。

如上面提到的，在早先存在的ASE模式中运行激光器是不切实际的。如也刚刚描述的，使用在高于激光发射阈值的功率水平下运行的激光二极管，准确度受到损害，并且如果出现模式跳变(例如，诸如经由功率变化) 则尤其如此。然而，本发明人已经发现，在ASE模式和完全激光发射模式之间的混合模式中操作激光器为在图像传感器处的测量提供足够的光束强度且为提高的测量精度提供增加的光斑放置稳定性。这种模式在一些实例中可以通过稍微在激光二极管的激光发射阈值之上操作来实现。例如，这可能稍微超过激光发射曲线的拐点而出现，但仍然足够低，以至于相当一部分功率在ASE状态中。这产生了输出，其中大量的光仍然具有更宽的光谱宽度，导致显著降低的相干性。

与可能用于尝试实现相同效果的其他光源相比，在这种混合模式中操作激光器可能是有利的。激光二极管往往是理想的光源，因为由于在该领域中的不同公司对这种类型的设备的高产量制造，激光二极管展示高可靠性和低成本。在这种较低功率模式下操作激光二极管甚至可以提高激光二极管可实现的典型高MTBF额定值。因此，能够实现具有非常高的寿命和 MTBF额定值(激光二极管特性和非常低的操作功率的组合)、低制造成本和足够短的相干长度以消除由样品容器的多层结构引起的干涉边缘的设备的结果。

表1是说明在各种可选的解决方案被实现的情况下的光斑间隔稳定性的图。第一组测量假定12mW的激光功率以在激光发射模式中操作，ND 滤光器的存在以使光衰减，以及250μs曝光。在这里，质量中心或光斑间隔稳定性对于本底噪声1为396.02nm，以及对于本底噪声2为146.0nm。如表格所示的，如果添加2D或1D高斯滤波，则稳定性提高。可以添加高斯滤波器来减轻边缘的影响，并提供更均匀的光斑剖面。也如这个表所示的，将激光二极管的功率降低至0.5mW减少质心误差，这意味着更大的稳定性。特别地，在本示例中，质心误差对本底噪声1减小到14.6nm而对本底噪声2减小到15.2nm。

表1

在这个示例中，在0.5mW而不是12mW处操作激光二极管意味着激光器并不真正在激光发射模式中。然而，这个功率水平足够高，以至于激光二极管也不在ASE模式下操作。相反，在这个功率范围内，激光器可以被称为在混合模式或准激光发射模式中操作。这对激光器操作来说很不寻常。在通常情况下，预期在清楚地可识别的激光发射模式中运行激光器，并且早先存在的系统在激光发射阈值之上舒适地操作激光二极管和功率水平。在这种混合模式下操作激光器是违反直觉的和非典型的激光器操作。

图31是示出5％全光谱宽(在5％处的FW)与各种激光光源的激光功率的关系的示例的图。如在该图中看到的，当设定功率下降时，在5％处的FW增加。因此，各种示例被配置有被设置成在该混合模式中操作激光器的激光功率，以在合理的时间量内为在图像传感器处的检测提供足够的光斑强度，但仍然足以限制激光功率以便不产生在光斑放置中引入不需要的不稳定性的边缘图案。由于较低的强度对于在图像传感器处的充分的读出需要较长的曝光时间，因此降低激光功率可不利地影响聚焦跟踪系统的时延。因此，在确定是否提供足够的强度时，考虑完成聚焦跟踪测量所需的时间量以及是否充分实现系统的时延目标可能是有用的。施加到激光器以实现前述内容的功率的量取决于指定的激光二极管、图像传感器的灵敏度和速度(对于时延考虑因素)、系统的时延要求以及系统的准确度要求。

其它示例可以用被设置来操作激光器的激光功率来实现，使得在给定频率处在激光二极管输出中的主峰具有比在激光二极管输出中的任何副峰大15％-100％的归一化强度。在又一些其它示例中，激光二极管光源被操作的功率水平被选择为使得在给定频率处在激光二极管输出中的主峰具有比在激光二极管输出中的副峰的归一化强度大15％-25％的归一化强度。在又一些其他示例中，选择激光二极管光源被操作的功率水平，使得在给定频率处在激光二极管输出中的主峰具有比在激光二极管输出中的副峰的归一化强度大15％-100％的归一化强度。在另外的示例中，选择激光二极管光源操作的功率水平，使得在给定频率处在激光二极管输出中的主峰具有比在激光二极管输出中的副峰的归一化强度大15％-200％的归一化强度。

可以用于设置光源被操作的功率的另一个度量可以是系统在满足预定聚焦跟踪时延要求的同时可以容忍的最大曝光时间。一般而言，当激光器被操作的功率减小时，光斑边缘通量的量也减少，提高聚焦跟踪准确度。然而，在图像传感器处提供低于某个功率量的不足的强度以实现光斑的检测，或者以使在足够短的曝光时间中的检测能够满足时延要求。因此，可以将功率设置降低到其中所需的相应曝光时间在对聚焦跟踪操作中的系统时延允许的最大曝光时间处或附近的点。在上面提供的示例中，对于在 0.5mW处操作的光源的曝光时间为250μs。

虽然在上面描述了所公开的技术的各种示例，但是应该理解，它们仅作为示例而非限制的方式被呈现。同样，各个图可以描绘对于所公开的技术的示例架构或其他配置，其被完成来帮助理解可以被包括在所公开的技术中的特征和功能。所公开的技术不限于所示的示例架构或配置，而是期望特征可以使用各种可选的架构和配置来实现。实际上，对于本领域中的技术人员将明显，可以如何实现可选的功能、逻辑或物理分块和配置以实现在本文公开的技术的期望特征。而且，除了在本文描绘的那些之外的许多不同的组成模块名称可以被应用于各种分块。另外，关于流程图、操作描述和方法权利要求，步骤在本文被呈现的顺序不应强制所公开的技术被实现为以相同顺序执行所列举的功能，除非上下文另有规定。

尽管上面从各种示例配置和实现方面描述了所公开的技术，但是应当理解，在一个或更多个单独的示例中描述的各种特征、方面和功能在它们的应用性中不限于它们被描述所使用的特定示例，而是可以单独地或在各种组合中应用于所公开的技术的一个或更多个其他示例，而不管这样的示例是否被描述以及这样的特征是否被呈现为所描述的示例的一部分。因此，本文所公开的技术的广度和范围不应受任何上述示例的限制。

除非另有明确说明，否则在本文档中使用的术语和短语及其变形应被解释为开放式的，而非限制性的。作为前述内容的示例：术语“包括”应理解为意指“包括但不限于”等；术语“示例”用于提供在讨论中的项目的示例实例，而不是其详尽的或限制性的列表；术语“一个(a)”或“一个(an)”应被理解为意指“至少一个”、“一个或更多个”等；以及诸如“早先存在的”、“传统的”、“正常的”、“标准的”、“已知的”以及类似含义的术语的形容词不应被解释为将所描述的项目限制到给定时间段或到给定时间为止时可用的项目，而是应该被理解为包括早先存在的、传统的、正常的或标准的技术，这些技术可能是现在或在将来的任何时间可用的或已知的。在本文中术语“包括”被规定为是开放式的，不仅包括所列举的元件，而且还包括任何另外的元件。同样，在本文档提到对本领域中的普通技术人员明显或已知的技术的情况下，这样的技术包括现在或在将来的任何时间对技术人员明显或已知的那些技术。

术语“耦合”是指直接或间接接合、连接、紧固、接触或链接，并且可以指各种形式的耦合，例如物理、光学、电气、流体、机械、化学、磁性、电磁、光学、通信或其他耦合或前述项的组合。在一种形式的耦合被指定的情况下，这并不暗示其他形式的耦合被排除。例如，物理地耦合到另一部件的一个部件可以指在两个部件之间的(直接或间接)物理附接或接触，但不排除在部件之间的其他形式的耦合，诸如例如也通信地耦合这两个部件的通信链路(例如RF或光学链路)。同样，各种术语本身并没有被规定为是相互排他的。例如，流体耦合、磁性耦合或机械耦合等可以是物理耦合的形式。

在一些实例中，扩展词和短语(诸如，“一个或更多个”、“至少”，“但不限于”或其他类似短语)的存在不应被理解为意指较窄的情况在这样的扩展短语可能缺乏的实例中是预期的或需要的。术语“部件”的使用并不暗示被描述或要求保护作为部件的一部分的元件或功能都被配置在共同的封装中。实际上，部件的各种元件中的任一个或所有(包括结构元件) 可以被组合在单个封装中或单独地被维护，并且可以进一步分布在多个组或封装中。

应认识到，前述概念(假定这样的概念不是相互不一致的)的所有组合被设想为本文所公开的实用新型主题的部分。特别是，出现在本公开的末尾处的所要求保护的主题的所有组合被设想为本文所公开的实用新型主题的部分。

在整个本公开(包括权利要求)中使用的术语“实质上”和“大约”用于描述并解释诸如由于在处理中的变化而引起的小波动。例如，它们可以指小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。

另外，本文阐述的各种示例是从示例图和其他图示方面来描述的。如在阅读本文档后对本领域中的普通技术人员变得明显的，所示出的示例及其各种可选方案可以在没有对所示示例的限制的情况下实现。例如，框图及其附随的描述不应被解释为强制特定的架构或配置。