专利名称：一种目标基因捕获方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种基于文库的目标基因捕获方法及其应用。
背景技术：
BAC、PAC、YAC等克隆载体的构建为基因克隆提供了有力工具。在已知基因部分序列信息的情况下，为了获得基因全长序列，现有的技术中，主要有两种方法。第一种可行的方法是从BAC、PAC或YAC文库中利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法扩增带有目标片段的克隆；第二种方法是利用特异序列重组BAC、PAC或YAC文库，获得带有目标片段的阳性克隆。可以看到，两种方法都需要构建BAC、PAC或YAC基因组文库，但BAC、PAC、YAC文库构建及重组操作复杂、保存不稳、价格昂贵、周期长、步骤繁琐，并且第一种方法PCR扩增假阳性率高、第二种方法重组效率极低，大大限制了对中小片段基·因功能的研究。Red重组技术可简单的实现对基因进行敲除、敲入、点突变等操作，还可在靶基因的上下游加入适当的启动子和终止子序列以调节基因的表达。广泛应用于构建具有特定突变的工程菌，改变生物代谢途径，阻断副反应的进行，防止副产物或有毒产物形成，促进目的产物积累等方面。Murphy (1998)较早利用质粒pTP223表达Red重组酶，使线性DNA片段与染色体发生重组，构建的大肠杆囷基因缺陷重组效率大大提闻；Zhang等(2000)利用Red重组技术将一段两端与靶基因两翼同源的序列(各有42bp)、中间为药物抗性基因的线性DNA片段和含有靶基因的载体同时电转入菌株细胞，抗性基因成功地将靶基因置换下来；，Yu等(2000)利用这种Red重组系统将大肠杆菌染色体和质粒上多个靶基因敲除。Ellis(2001)等在将70bp的单链DNA与染色体DNA进行重组，修复galKtyrl45am琥珀突变和删除313kb长的基因片段获得了同样高的重组效率。Datsenko等(2000)在Red重组酶的作用下，PCR片段借助两端与靶基因两翼同源的序列与染色体上对应区域发生重组，染色体上的靶基因被抗性基因所替代。Marta Nedelkova等(2011)构建了 GB05RedTrfA+pSC101 β菌株，使大片段的同源重组的效率获得提高。但是上述重组技术的改进仍克服不了基于大片段基因组文库的目标基因捕获技术操作复杂、价格昂贵、周期长的缺点，不便于研究中小片段基因功能。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种目标基因捕获方法极其应用。本发明一方面提供了一种目标基因捕获方法，包括将打断成2_4k的基因组DNA片段与载体连接获得重组载体；重组载体电转化GB05RedTrfA+pSC101 β感受态细胞，培养获得重组载体细菌文库；制备带筛选标记的待捕获目标基因的双链DNA重组片段；将重组片段与重组载体细菌文库中的阳性克隆重组，筛选阳性克隆获得含有目标基因片段的细菌克隆。具体的，包括下列步骤I)获取基因组DNA，将基因组DNA打断成片段大小主要为2_4k的片段，使用琼脂糖凝胶电泳回收大小为2-4k的片段，对回收片段进行末端补平；2)将打断并补平末端的片段与含有氨苄抗性的载体连接获得重组载体；3)将步骤2)获得的重组载体电转入用GB05RedTrfA+pSC101 β做的感受态细胞，并在合适的条件下在固体培养基平板上培养感受态细胞直至长出大量含有重组载体的克隆，得到重组载体细菌文库； 4)制备重组片段制备两翼为待捕获目标基因的同源臂，中间插入筛选标记的双链DNA重组片段；5)重组将步骤4)制备的重组片段与重组载体细菌文库中的阳性克隆重组，利用所述双链DNA重组片段中的筛选标记筛选获得含有目标基因片段的细菌克隆。其中，步骤I)中所述目标基因捕获是指在已知某一基因部分序列(基因序列片段)的情况下，通过实验方法从相应物种的基因组DNA中获得该基因的全部序列。提取基因组DNA的方法可采用常规手段，如CTAB法、SDS法、苯酚抽提法、浓盐法和煮沸法等。由于本发明的方法对于高等动植物复杂基因的研究特别适用，因此，所述基因组DNA优选来自高等动植物。较佳的，使用DNA打断仪将基因组DNA打断成大小为24Κ的片段(可根据需要调整打断仪的参数)。本发明实施例采用hydroshear打断仪器对基因组DNA打断。为了后续实验的稳定性，需回收打断后大小为2-4k的片段，只需采用琼脂糖凝胶即可回收打断后大小为24K的片段。利用琼脂糖凝胶电泳挖胶回收的方法纯化2-4K的片段，确保片段大小的准确性。打断片段补平的方法可采用现有技术，例如采用DNA聚合酶补平。步骤2)中将目标片段与含有氨苄抗性的载体连接的方法可采用常规。所述含有氨苄抗性的载体可选自PUC19载体、PUC18载体、pMD18_T载体等常用含有氨苄抗性的载体。步骤3)中GB05RedTrfA为改造后的GB05生物工程大肠杆菌；pSC101 β为含有能编码RedP 蛋白基因的质粒；68051^(11'忖4+口5(1010 为含有 pSClOiP 质粒的 GB05RedTrfA菌株。三者的构建方法参见文献 “Nedelkova, Μ.，M. Maresca, et al. (2011). " Targetedisolation ofcloned genomic regions by recombineering for haplotype phasing andisogenic targeting. " Nucleic Acids Res 39(20) :el37.，，。其中含有 pSClOiP 质粒的 GB05RedTrfA 细胞，即 GB05RedTrfA+pSC101 β 可经商购获得(例如The BiotechnologyCenter (BIOTEC) of theTechnische Universitat Dresden)。由于pSClOl β为温感型载体，故培养温度约30°C为佳。所述固体培养基可选用LB固体培养基。
可根据所选载体上的区别于感受态细胞中的筛选标记选择合适的培养基培养转化后的感受态细胞以获得含有重组载体的克隆。例如，当步骤2)选择PUC19载体时，可采用加入X-Gal和IPIG固体培养基培养转化后的感受态细胞。本发明构建文库过程中，无需电脉冲电泳，对基因组DNA的质量要求也不高，因此易于操作。步骤4)中需针对待捕获目标基因的已知DNA片段设计同源臂引物，设计同源臂的设计原则为，同源臂长度为40-60bp。同源臂之间插入筛选标记。所述筛选标记与步骤2)所采用的含有氨苄抗性的载体(Amp)、及步骤3)所选用的感受态细胞GBO5RedTrfA+pSClO10 (CM、tet)中的抗性标记进行区分。例如为卡那霉素抗性筛选标记。一种简单制备两翼为同源臂中间插入筛选标记的双链DNA重组片段的方法为以 含有所述筛选标记的现有载体为模板，采用所设计的同源臂引物经PCR扩增获得。例如利用同源臂引物设计，从PRI909载体(宝生生物工程有限公司)或PET32载体卡那霉素抗性区域两侧进行PCR扩增，获得含有卡那霉素抗性的双链DNA重组片段。步骤5)中重组具体步骤可为利用含有氨苄抗性的培养基培养步骤3)获得的重组载体细菌文库中的阳性克隆，然后以鼠李糖诱导步骤4)制备的重组片段与所述阳性克隆重组，最后用重组片段中的筛选标记筛选获得含有目标基因片段的细菌克隆。本发明第二方面，提供了一种可用于目标基因捕获的基因组DNA文库，采用包括下列步骤的方法制得将打断成2-4k的基因组DNA片段与含有氨苄抗性的载体连接获得重组载体；重组载体电转化GB05RedTrfA+pSC101 β感受态细胞，培养获得重组载体细菌文库。进一步的，所述基因组DNA文库采用前述目标基因捕获方法中的步骤1)-3)制得。本发明第三方面，提供了上述目标基因捕获方法及文库在基因研究领域的用途。上述目标基因来自高等动植物。本发明的方法，尤其适用于大小为4kb以下的基因的功能研究。本发明的方法，可用于高等动植物复杂基因上下游调控序列分析、基因打靶技术及基因克隆技术。本发明的方法相比前人所用的BAC、YAC等方法，操作更简单、周期短、费用低、重组效率高，是一种快速有效的对感兴趣基因组进行重组捕获的方法，尤其适用于某些较难克隆的复杂基因组，条件一般的实验室也很容易实施，可对后续的信息分析带来方便。
图I重组流程A :片段化的基因组DNA ；B :含有基因组插入片段的载体；C :含有基因组插入片段的细菌克隆；D :抗性筛选含有插入片段的克隆；E 鼠李糖诱导PCR产物与目标克隆的重组；
F :抗性筛选含有目标片段的克隆。图2:DNA检测结果图3 Hydroshear打断后电泳检测图4:PUC19 质粒5 :菌落生长情况图6:测序结果比较图a:理论序列b:实测序列
c: 一致性比较
具体实施例方式为了测试基于小片段基因组DNA文库重组的目标区域捕获效率，本发明选取了大豆GmcpSecA基因,测试了从大豆基因组中捕获GmcpSecA全长基因的实验效果。具体地，包括如下步骤I.用hydroshear打断仪对基因组进行打断，其片段大小要控制适当，并使打断后的片段更集中，经测试，本方法打断后DNA片段集中在2-4K为佳；2.打断后的片段和PUC19载体进行连接获得重组载体；3.重组载体电转入用GB05RedTrfA+pSC101 β做的感受态细胞，因pSClOl β为温感型载体故需要30°C培养，直至长大量的克隆；4.针对待捕获基因的已知DNA片段进行同源臂引物设计，从pRI909载体(宝生生物工程有限公司)卡那霉素抗性区域两侧进行PCR扩增，获得含有卡那霉素抗性的双链DNA片段；5.用培养基洗脱步骤3中的大量克隆，以鼠李糖为诱导；利用含有氨苄抗性的培养基培养步骤3)中获得的PUC19阳性重组载体细菌克隆，然后以鼠李糖诱导步骤4的双链DNA片段与PUC19阳性克隆重组，最后卡那霉素筛选获得含有目标基因片段的细菌克隆。以筛选标记进行阳性筛选并计算重组率；结果显示，本发明的方法确实能够较大程度地使得基因重组，并且重组效率要高于前人所用的BAC、YAC方法。6. 3730 测序。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式
加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。实施例I测试大豆中GmcpSecA基因的捕获效果材料大豆基因组DNA，用CTAB法提取DNA。步骤
一)大豆I)获取基因组DNA，将基因组DNA打断至大小为2-4K，琼脂糖凝胶电泳回收2-4Κ的基因组片段，产物纯化后进行末端补平。用CTAB法提取大豆基因组DNA。使用Quant-iT系列(Invitrogen公司)双链DNA浓度检测试剂盒检测DNA浓度，之后取IOOng经1%琼脂糖电泳检测DNA质量。结果如图2，为主带清晰、无降解或少量降解的DNA，符合后续步骤要求。使用Hydroshear仪器打断，其打断参数见(表I)，其中DNA量为2 μ g。打断后的片段经1%琼脂糖电泳检测DNA打断效果，打断后DNA片段主要分布在2-4K (图3)，符合重组的要求。
表I、Hydroshear仪器打断参数
权利要求
1.一种目标基因捕获方法，包括将打断成2-4k的基因组DNA片段与载体连接获得重组载体；重组载体电转化GB05RedTrfA+pSC101 β感受态细胞，培养获得重组载体细菌文库；制备带筛选标记的待捕获目标基因的双链DNA重组片段；将重组片段与重组载体细菌文库中的阳性克隆重组，筛选阳性克隆获得含有目标基因片段的细菌克隆。
2.如权利要求I所述目标基因捕获方法，具体包括下列步骤 O获取基因组DNA，将基因组DNA打断成片段大小主要为2-4k的片段，使用琼脂糖凝胶电泳回收大小为2-4k的片段，对回收片段进行末端补平； 2)将打断并补平末端的片段与含有氨苄抗性的载体连接获得重组载体； 3)将步骤2)获得的重组载体电转入用GB05RedTrfA+pSC101β做的感受态细胞，并在合适的条件下在固体培养基平板上培养感受态细胞直至长出大量含有重组载体的克隆，得到重组载体细菌文库； 4)制备两翼为待捕获目标基因的同源臂，中间插入筛选标记的双链DNA重组片段； 5)将步骤4)制备的重组片段与重组载体细菌文库中的阳性克隆重组，利用所述双链DNA重组片段中的筛选标记筛选获得含有目标基因片段的细菌克隆。
3.如权利要求2所述目标基因捕获方法，其特征在于，步骤I)中，采用CTAB法、SDS法、苯酚抽提法、浓盐法或煮沸法获取基因组DNA。
4.如权利要求2所述目标基因捕获方法，其特征在于，步骤I)中，使用DNA打断仪将基因组DNA打断成大小为2-4Κ的片段。
5.如权利要求2所述目标基因捕获方法，其特征在于，步骤I)中，所述含有氨苄抗性的载体选自PUC19载体、PUC18载体或PMD18-T载体。
6.如权利要求2所述目标基因捕获方法，其特征在于，步骤3)中，培养温度约30°C。
7.如权利要求2所述目标基因捕获方法，其特征在于，步骤4)中，所述同源臂的长度为40-60bp，所述筛选标记与步骤2)所采用的含有氨苄抗性的载体及步骤3)所选用的感受态细胞GB05RedTrfA+pSC101 β中的抗性标记进行区分。
8.如权利要求7所述目标基因捕获方法，其特征在于，所述筛选标记为卡那霉素抗性筛选标记。
9.如权利要求2所述目标基因捕获方法，其特征在于，步骤5)中，重组具体步骤为利用含有氨苄抗性的培养基培养步骤3)获得的重组载体细菌文库中的阳性克隆，然后以鼠李糖诱导步骤4)制备的重组片段与所述阳性克隆重组，最后用重组片段中的筛选标记筛选获得含有目标基因片段的细菌克隆。
10.一种基因组DNA文库，采用包括下列步骤的方法制得将打断成2-4k的基因组DNA片段与含有氨苄抗性的载体连接获得重组载体；重组载体电转化GB05RedTrfA+pSC101 β感受态细胞，培养获得重组载体细菌文库。
11.如权利要求10所述基因组DNA文库，其特征在于，所述基因组DNA文库采用权利要求2-6任一权利要求所述目标基因捕获方法中的步骤I)-步骤3)制得。
12.权利要求1-9任一权利要求所述目标基因捕获方法或权利要求10或11所述基因组DNA文库在基因研究领域的用途。
全文摘要
本发明涉及一种基于文库的目标基因捕获方法及其应用。本发明目标基因捕获方法包括下列步骤将打断成2-4k的基因组DNA片段与载体连接获得重组载体；重组载体电转化GB05RedTrfA+pSC101β感受态细胞，培养获得重组载体细菌文库；制备待捕获目标基因的双链DNA重组片段；将重组片段与重组载体细菌文库中的阳性克隆重组，筛选阳性克隆获得含有目标基因片段的细菌克隆。本发明还进一步公开了一种可用于目标基因捕获的基因组DNA文库。本发明的目标基因捕获方法及基因组DNA文库可用于基因研究。
文档编号C40B40/08GK102925428SQ20121043498
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者肖珊, 李萍, 陶晔, 林芹, 胡秋萍 申请人:上海美吉生物医药科技有限公司