一种组织匀浆法分离活细胞构建细胞库的方法
【专利摘要】本发明公开了一种组织匀浆法分离胎儿附属物组织细胞构建细胞库的方法，目的在于构建细胞库时步骤简单、省时、易于质控和规范化。本发明由下述步骤组成：(1)胎儿附属物组织的清洗；(2)组织的匀浆前处理；(3)组织匀浆处理分离细胞(团)；(4)匀浆后组织的过滤处理和细胞(团)的收集；(5)细胞(团)检测；(6)冻存分离的细胞(团)，构建细胞库。与现有方法相比，本发明方法具有操作简单、用时短、不引入外源试剂、易于标准化和质量控制以及细胞获得量大等优点，为提高胎儿附属物细胞库的构建效率，获得高质量用于治疗的干细胞具有重要的意义。
【专利说明】一种组织匀浆法分离活细胞构建细胞库的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胎儿附属物组织细胞库的构建方法，更具体地说是一种从胎儿附属物组织分离细胞构建细胞(团)库的物理方法。
【背景技术】
[0002]胎儿附属物组织主要由胎盘小叶、胎盘底座、基蜕膜、羊膜和脐带组织构成。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，是胎儿最早期的造血器官，含有大量的间质成分。最新的研究表明胎盘中含有间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞和丰富的造血干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。
[0003]胎盘亚全能干细胞来源于胎盘组织，自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。具备多能干细胞的许多生物学特征，该细胞体外可向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、肝上皮样细胞等定向分化。
[0004]胎盘造血干细胞是存在于胎盘组织中的一群原始造血细胞，是血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)的始祖，是高度未分化细胞，也可以说它是一切血细胞(其中大多数是免疫细胞)的原始细胞。胎盘组织中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的5-10倍，足可供小孩自用几次，或提供给1-2个成人患者的治疗。同时有效解决了移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植。
[0005]基蜕膜是母亲妊娠时胚泡的滋养层细胞一经与子宫内膜接触，引起其附近的内膜间质细胞肥大增殖形成的组织。基蜕膜形成胎盘隔将丛密绒毛膜分隔成若干个绒毛小叶，其中含有母亲源的基蜕膜干细胞。
[0006]羊膜(amnion)是覆盖在羊膜腔内表面的一层薄膜，从细胞滋养层演化而来，是人类两层胎膜的内层，其厚度为0.02~0.05mm，是人体中最厚的基底膜，由羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell, HAEC)、基底膜、实质层、纤维母细胞层、海绵层5层结构组成。人羊膜上皮细胞位于羊膜的最内层，羊膜上皮细胞在受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，在治疗中枢神经障碍方面具有独特的应用价值:1996年，Sakuragawa等最先发现培养的人羊膜上皮细胞表达神经元和神经胶质细胞的标志。随后的研究表明，培养的人羊膜上皮细胞能合成和释放神经递质如乙酰胆碱，儿茶酚胺和多巴胺。人羊膜上皮细胞移植治疗大鼠帕金森病(PD)的实验表明其在体内不仅能存活并表达络氨酸羟化酶(TH)活性，而且可以逆转病情和防止神经元死亡。人羊膜上皮细胞对于灵长类的脊髓损伤同样具有良好的治疗效果。
[0007]脐带是胎儿和母体连接的纽带。脐带内有三根血管通过，一根静脉和二根动脉，起着沟通母子间血液循环的作用。足月胎儿的脐带长约30~70厘米。脐带华通氏胶(Wharton’ s Jelly)中的干细胞主要是脐带间充质干细胞。
[0008]间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一种多能干细胞,在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，MSC是一种重要的参与组织再生的细胞。在组织损伤引起的特殊信号作用下，MSC迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。MSC易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增I亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一种实用的组织修复种子细胞。
[0009]MSC具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为:上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病；并且，MSC具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病；MSC还是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。
[0010]胎儿附属物细胞库的构建，将原来作为医疗废弃物直接处理掉的新生儿的脐带和胎盘组织通过处理，提取其中丰富的干细胞资源，并通过成熟的深低温冷冻技术使之在休眠状态下长时间储存，作为一种宝贵的生物资源储备，将来，可以应用于许多自体重大疾病的治疗；同时，也可以用于异体的移植与治疗；还可以通过再研发和处理，开发成干细胞药物，造福全社会。
[0011]胎儿附属物细胞库构建包括细胞的组织分离，纯化，冷冻保存，病原微生物的检测以及质量控制等方面。本专利所涉及的胎儿附属物细胞库构建方法是其中组织中细胞分离的方法，尤其是细胞从实体组织中分离的技术。从组织中分离细胞构建细胞库的方法目前有化学酶解法和细胞团培养法。其中化学酶解法是广为采用的主要方法。
[0012]化学酶解法是利用消化酶将活体细胞从组织中分离的方法。具体分离过程先将组织剪切成约1-1.5mm3的小块，再采用胶原酶或胶原酶和胰酶组合使用进行细胞团消化，并利用血清等酶消化终止液终止消化，最后过滤清洗获取细胞。例如授权号CN101608174B《一种人脐带间充质干细胞库的构建方法》的专利，间充质干细胞的分离就是采用胶原酶消化的方法。授权号CN100344757C《人胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法》的专利，建库的间充质干细胞采用的方法为胶原酶和胰酶依次消化法。化学酶解法具有以下特点:1)由于需要使用大量的化学酶和消化终止液，实验成本较高；2)由于不同的操作方法和人员情况，每次获得的细胞产量差异较大。3)由于采用的消化方法不同，整个消化酶解的时间长短不一，从30分钟到几小时都有。
[0013]细胞团培养法是一种物理和培养相结合将细胞从组织中分离的方法，也是构建细胞库可选用的一种方法。具体分离过程先将组织剪切成约1-1.5mm3的小块，接种到培养皿中培养分离细胞。例如授权号CN102010850B《一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法》的专利，脐带组织间充质干细胞的分离就是采用的细胞团培养法。该方法具有以下特点:1)仅需要将组织剪切成1-1.5mm3的细胞团和简单的培养，操作比较简单；2)细胞团的培养需要几天的时间才能实现细胞的分离，耗时较长；3)细胞的长期培养，污染的可能性比较大。
[0014]由此可见，目前构建细胞库的实体组织细胞分离方法操作流程比较繁琐，耗时长，完全依赖于人工操作，对技术员的操作技能要求高。另外，化学酶解法又引入了动物来源的外源性试剂，会加大公共细胞库的干细胞药物治疗的风险性。
[0015]在本发明基于细胞库构建中保证细胞分离方法简单、省时、易于质控和规范化的原则，采用组织匀浆方法分离胎儿附属物组织，获得大量用于建库的细胞，以满足科研、医药和临床等领域对细胞库资源的需求。
【发明内容】
[0016]本发明的目的是提供一种组织匀浆分离胎儿附属物细胞(团)建立细胞库的方法。
[0017]本发明优选使用的组织细胞处理器PlacentaPiX)是发明人为本发明设计的一种仪器，该仪器包含控制装置和匀浆容器两部分，如图1所示，控制装置包括机身(1)，匀浆容器放置孔(2)，旋转头(3)，卡槽(4)，散热孔(5);匀浆容器包括杯体(6)，杯盖(7)，密封圈
(8)，旋转头连接器(9)，固定轴(10)，刀头(11)，卡头(12)。
[0018]机身(I)侧面设置有散热孔(5)，机身(I)顶部为匀浆容器放置孔(2)，匀浆容器放置孔(2)内壁设有卡槽(4)，匀浆容器放置孔(2)底部为旋转头(3)，处理组织时，匀浆容器放置入匀浆容器放置孔(2)中，杯盖(7)底部的旋转头连接器(9)下端与旋转头(3)接合，上端通过固定轴(10)与刀头(11)连接，杯盖(7)通过密封圈(8)与杯身(6)紧密接合，杯身(6)外侧壁的卡头(12)与卡槽⑷接合。
[0019]其中关键部件为特殊设计的刀头(11)。刀头(11)呈四叶刀刃，由上下层叠放置且互相垂直的刀片(13)和刀片(14)组成。刀片(13)分5段，包含4个弯折，两端两个弯折呈130-150度(优选138度)，中间两个弯折呈140-160度(优选148度)；刀片(14)分3段，包含2个弯折，两个弯 折呈110-130度(优选123度)；
[0020]工作时，将组织块装入杯身(6)，盖上杯盖(7)后，将匀浆容器放入匀浆容器放置孔(2)内，通过控制器-旋转头(3)-旋转头连接器(9)-固定轴(10)-刀头(11)的一些列传动。带动刀头(11)转动，从而起到匀衆作用。
[0021 ] 虽然目前市场上已经有少量与本发明所用的组织细胞处理器PI acentaPro作用相似的仪器，如德国美天旎公司的gentleMACS标本处理器也能分离组织得到细胞悬液。但是第一，市面上已有的仪器的处理量都相对较小，一般只能处理5克以下的样本，而PlacentaPro最多能处理400克的样本，为建立细胞库和大规模细胞培养奠定了很好的基础；第二，市面上已有的仪器由于结构限制，只能处理易破碎的组织，如脾脏、肝脏、肺等，对于具有很强韧性的胎儿附属物组织，如含有大量华通氏胶的脐带也无能为力，而PlacentaPro由于结构的特殊性，能够在不破坏细胞活性的情况下，将韧性大的组织，如胎儿附属物组织进行匀浆，直接分离得到细胞/细胞团。
[0022]本发明的技术方案包括组织的清洗、匀浆前处理、组织匀浆处理、过滤回收及细胞库构建的过程，具体步骤如下:
[0023](I)组织清洗:通过适量清洗液(例如含双抗的PBS缓冲液)对获得的胎儿附属物组织进行冲洗，直到组织表面的残留血液被冲洗干净。
[0024](2)组织匀浆前处理:根据组织细胞处理器PlacentaPiO的匀浆容器的大小，将得到的组织剪成小块，放入组织细胞处理器中，加入0.5-2倍质量的缓冲液(例如PBS缓冲液)并密封组织细胞处理器；[0025](3)组织匀浆处理:组织细胞处理器PlacentaPiO通过转子带动特殊刀头的旋转将组织切碎和匀浆，对组织进行细胞分离和提取；
[0026](4)组织过滤处理，细胞收集:将步骤(3)得到的组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织进行研磨，收集滤液，对滤液进行细胞清洗，离心收集细胞；对脐带组织收集过滤器上的细胞团，清洗细胞团并收集。
[0027](5)分离的细胞(团)构建细胞库:将步骤⑷分离的细胞(团)置液氮保存，按其ABO / Rh血型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出细胞库。
[0028]根据本发明步骤⑴所述需要处理的样品是胎儿附属物组织，包括胎盘小叶和基蜕膜组织、胎盘底座组织、胎盘羊膜组织和脐带组织。
[0029]根据本发明步骤(2)所述处理的组织样品大小为:
[0030]胎盘小叶和基蜕膜30_120g，优选60_90g，加入的缓冲液或培养基的体积为20-110ml，优选 50-80ml ；
[0031 ] 脐带5_30g，优选10_20g，加入的缓冲液或培养基的体积为10_45ml，优选15-30ml ；
[0032]胎盘底座100_300g，优选150_200g，加入的缓冲液或培养基的体积为100_300ml，优选 150-200ml;
[0033]胎盘羊膜5_25g，优选10_20g，加入的缓冲液或培养基的体积为10_40ml，优选15-25ml ；
[0034]根据本发明步骤(2)所述组织细胞处理器PlacentaPiO处理:
[0035]胎盘小叶和基蜕膜组织处理转速为1000-2400rpm，优选地，1400-1800rpm ；
[0036]脐带组织处理转速为1500-3500rpm，优选地，2500_2800rpm ；
[0037]胎盘底座组织处理转速为1500-2500rpm，优选地，2000rpm ；
[0038]胎盘羊膜组织处理转速为2000-3000rpm，优选地，2300_2500rpm ；
[0039]根据本发明步骤(4)所述组织碎片过滤装置为100-400目金属过滤器，胎盘小叶和基蜕膜组织、胎盘底座组织过滤时优选200目的过滤器，脐带组织、胎盘羊膜组织过滤时优选400目的过滤器。
[0040]本发明的有益效果为:本发明采用自主研制的组织细胞处理器PlacentaPiO对胎儿附属物组织细胞进行分离的方法，具有操作简单、用时短、无外源试剂加入、易于标准化和质量控制以及细胞获得量大等优点，为提高细胞库的构建效率，保障细胞库优质的质量具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1组织细胞处理器PlacentaPro结构示意图
[0042]图2原代细胞培养形态
[0043]图3脐带组织处理得到的细胞团培养并传至P3代的细胞培养形态图
[0044]图4脐带组织处理得到的细胞团培养并传至P3代的细胞流式图
[0045]图5胎盘羊膜组织处理后得到的细胞团的原代培养形态图
【具体实施方式】[0046]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0047]实施例1:采用组织匀浆法分离胎盘小叶细胞构建细胞库
[0048]胎盘小叶组织匀浆的方法包括以下步骤:
[0049](I)胎盘组织清洗:胎盘组织是在生物安全柜内进行处理，根据胎盘大小使用适量含1%双抗的PBS缓冲液对胎盘组织进行冲洗，至胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；
[0050](2)胎盘小叶组织前期处理:使用手术剪从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，把胎盘小叶转移到培养皿上并剪成小块，把60-90克的胎盘小叶组织块放入组织细胞处理器PlacentaPro的匀浆容器中，加入50-80毫升的PBS并密封处理杯；
[0051](3)胎盘小叶组织匀浆处理:利用组织细胞处理器PlacentaPiO将步骤(2)得到的胎盘小叶组织块通过组织切碎和匀浆的物理处理进行细胞分离和提取，搅拌速度为1400rpm-1800rpm之间，处理时间为5分钟；
[0052](4)胎盘小叶组织过滤处理:将步骤(3)处理完毕后的胎盘小叶组织转移到200目金属过滤器上,对组织碎片进行研磨并利用另一个培养皿收集过滤完的液体,分成2次往金属过滤器加入10-15ml的PBS清洗组织并继续研磨。
[0053](5)细胞计数:用50ml离心管收集步骤(4)获得的细胞悬液，以1400rpm /分钟的速度离心10分钟,去上清并加入PBS重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数。
[0054]胎盘小叶组织细胞分离处理测试共分8组分别进行，每一组进行了两个不同的测试设定，分别为(a) 1400rpm, 5分钟和(b) 1800rpm, 5分钟。胎盘组织来源于8个不同的供者，处理量在60克左右之间。实验结果如表1所示。
[0055]
[0056]表1 (a)胎盘小叶组织匀浆处理细胞提取数据
【权利要求】
1.一种组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征是由下述步骤组成: (1)对胎儿附属物组织提供者进行ABO/ Rh血型检测、HLA分型检测、微生物免疫检测、用含双抗的缓冲液去除残留血液； (2)组织匀浆前处理:将清洗后的组织剪成小块，放入组织细胞处理装置样品室中，加入0.5-2倍质量的缓冲液或培养基，密封组织细胞处理装置； (3)组织匀浆处理:运转组织细胞处理装置，在转速为1000-3500rpm，处理时间为1_15分钟的条件下，将组织切碎和匀浆，对组织进行细胞(团)的分离处理； (4)组织过滤处理:将步骤(3)得到的匀浆液通过100-400目的滤网过滤:对于胎盘小叶和基蜕膜组织、胎盘底座组织，对滤网上残留的少许胎盘组织块进行研磨，收集滤液；对于脐带组织、胎盘羊膜组织，收集滤网上的细胞团。 (5)细胞(团)收集与清洗:对于细胞，用离心管收集步骤(4)得到的细胞悬液，以1400-1800rpm /分钟的速度离心5_15分钟，去上清并加入缓冲液重悬细胞；对于细胞团，用缓冲液清洗后直接收集细胞团。 (6)将步骤(5)分离的细胞(团)置液氮保存，按其ABO/ Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出细胞库。
2.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(I)中，胎儿附属物组织包括胎盘小叶和基蜕膜、胎盘底座、胎盘羊膜和脐带。
3.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中.，所使用的组织细胞处理装置为组织匀浆处理器，优选发明人研制的组织细胞处理器PlacentaPro。
4.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，组织细胞处理装置所处理的胎儿附属物组织样品的大小为5-300g，其中脐带组织为5-30g，胎盘小叶和基蜕膜组织为30-120g，胎盘底座组织为100-300g，胎盘羊膜组织为5-25g。
5.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，胎盘小叶和基脱膜组织处理转速优选1000-2400rpm ;脐带组织处理转速优选1500-3500rpm ;胎盘底座组织处理转速优选1500_2500rpm ;胎盘羊膜组织处理转速优选2000-3000rpm。
6.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，过滤胎盘小叶和基蜕膜组织、胎盘底座组织时，优选200目的金属滤网；过滤脐带组织、胎盘羊膜组织时，优选400目的金属滤网。
7.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(6)中，细胞库可以是脐带间充质干细胞库、胎盘造血干细胞库、胎盘亚全能细胞库、基蜕膜干细胞库和羊膜上皮细胞库。
8.如权利要求1所述的组织匀浆法分离胎儿附属物组织构建细胞(团)库的方法，其特征在于，所述的步骤(6)中，质量控制包括了细胞来源的调查；细胞污染的检测，如乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒；遗传病检测；HLA-ABC / DR配型检测；细胞活性的检测。
【文档编号】C40B50/06GK103469309SQ201310413590
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】许晓椿, 肖海蓉 申请人:博雅干细胞科技有限公司