一种角蛋白复合银纳米簇的制备方法与流程

本发明属于荧光纳米簇制备领域，尤其是涉及一种角蛋白复合银纳米簇的制备方法。

背景技术：

银纳米簇由于其独特物理、电学和光学性质，近几年来在催化、化学传感器、电子器件和生物成像等领域得到了广泛关注。相对于金纳米簇，银纳米簇具有更低的生产成本。具有高量子产率、近红外发射波长以及高生物相容性的银纳米簇在生物成像领域拥有巨大的应用前景。生物矿化法是一种近十年兴起的绿色环保的合成方法，其反应原理为借助蛋白质或核酸序列中的胺、羧基和硫醇基团等基团作为合成反应中稳定剂和还原剂替代传统化学试剂。目前核酸序列和牛血清白蛋白是常用的两种生物原料，但这些原料都具有成本较高的问题，牛血清白蛋白在合成过程中还需要预处理，步骤较为复杂；并且现有方法均通过在反应中使用低浓度还原剂的手段降低反应速度，以便于采用透析等需长时间纯化的方法终止反应，整个反应所需时间在24小时以上。

角蛋白普遍存在于人和动物的毛发中，利用索氏提取法可以在实验室自行中动物毛发中提取角蛋白，原料易得且廉价；角蛋白多肽具有完整的链段结构和羟基、羧基、氨基、二硫键等可以与金属阳离子形成较强作用力的官能团；但是对于银簇而言，用分子量大的蛋白作为模板合成，目前的文献都很少，主要原因是由于一般的蛋白中巯基含量不够多，另外nabh4参与反应体系的时间很难控制。

中国专利cn108031857a公开了发红色荧光的金纳米团簇的制备方法，分别配置氯金酸溶液、角蛋白溶液，室温下将氯金酸溶液缓慢加入到角蛋白溶液中，然后充分搅拌，使溶液混合均匀，得到淡黄色溶液；将溶液的ph值调至8～12；将溶液置于25～60℃条件下孵育，得到棕色的金纳米团簇溶液；将金纳米团簇溶液倒入截留分子量为透析袋中透析，然后冷冻干燥得到金纳米簇粒子。银纳米簇和金纳米簇均属于贵金属纳米簇，发红色荧光的金属簇均可作为荧光探针使用。相对于金纳米簇，银纳米簇的合成过程中需要使用还原剂，合成过程相对复杂；但是银纳米簇的合成成本更低。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有很好的生物相容性和较强且稳定的荧光性质的角蛋白复合银纳米簇的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种角蛋白复合银纳米簇的制备方法，采用以下步骤：

(1)将角蛋白溶液与硝酸银溶液搅拌混合5分钟并在调节ph值之后继续反应15分钟；

(2)加入硼氢化钠溶液并静置反应30分钟；

(3)通过纯化方法终止反应，制备得到荧光银纳米簇。

步骤(1)中：

控制反应温度为0-40℃，在0℃、25℃、40℃中优选采用25℃。

硝酸银与所述角蛋白的质量比为1:6.59-1:39.54，优选的比例关系为1:13.18。

加入浓度为0.1-10mol/l氢氧化钠溶液，优选1mol/l氢氧化钠调节ph值至12.4。

角蛋白从羽毛中提取纯化，采用以下步骤：将羽毛用水彻底洗净，并用丙酮进行脱脂操作，取脱脂粉碎后的羽毛浸入含有8mol/l尿素、0.2mol/l十二烷基硫酸钠和0.5mol/l焦亚硫酸钠的混合溶液中，加热处理后将角蛋白降解液过滤去除不溶物后，置于阻截大小为8000-14000da的透析袋中进行透析，最后将角蛋白溶液冻干成粉末。

步骤(2)中硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:0.1-1:1，优选的比例关系为1:1。

步骤(3)采用sephadexg25凝胶作为填料的层析柱进行过柱纯化，利用紫外灯进行判断荧光银纳米簇在层析柱中的位置，该过程耗时约10分钟。

制备得到的银纳米簇的大小为2.5nm，在710nm处有较强的荧光发射，荧光量子产率为1.7％(以罗丹明b为对照)。所制得的材料具有很好的生物相容性和较强且稳定的荧光性质。

与现有技术相比，本发明成本低廉且具有很好的生物相容性；本发明采用了凝胶过柱方法快速去除反应体系中的还原剂小分子，准确调控反应的终止时间，从而在反应中使用较高浓度的nabh4加快反应速度，本方法合成时间仅需1个小时，操作简单且重复性好；基于角蛋白中含有丰富的巯基，该方法合成的银纳米簇具有近红外的发射波长、较高的量子产率且在水溶液中具有稳定的荧光光强，在生物成像方面具有巨大的应用前景。

本发明借助角蛋白的具有丰富二硫键的独特优点，以及凝胶过柱法可以快速终止反应的特点，得到以角蛋白为模板的具有生物相容性、荧光性能优异、稳定性好、合成方法简单快速、成本更低的银纳米簇合成方法。

附图说明

图1为本发明实施例1合成的银纳米簇的透射电镜示意图及粒径分布。

图2为本发明实施例1合成的银纳米簇的吸收光谱图。

图3为本发明实施例1合成的银纳米簇的荧光稳定性表征图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

试剂原料

反应中所用的溶剂为超纯水；氢氧化钠，硼氢化钠(96％)，硝酸，磷酸(95％)，过氧化氢(30％)购自国药集团化学试剂有限公司；硝酸银(99.8％)购自上海凌峰化学试剂有限公司；角蛋白是从羽毛中自行提取。

荧光光谱是由荧光光谱仪(英国爱丁堡fs-5)记录的；uv-vis吸收光谱是用uv-2450分光光度计(日本岛津)测量的；透射电子显微镜(tem)是在jeoljem-2100超高分辨率透射电子显微镜下进行的。

所用溶液的准备：

(1)角蛋白的制备：

角蛋白由实验室从羽毛中自行提取纯化，具体纯化步骤：将羽毛用水彻底洗净，并用丙酮进行脱脂操作。取脱脂粉碎后的羽毛10g浸入100ml含有8mol/l尿素、0.2mol/l十二烷基硫酸钠和0.5mol/l焦亚硫酸钠的溶液中。将上述溶液加热70℃，1小时。然后将角蛋白降解液过滤去除不溶物后置于阻截大小为8000-14000da的透析袋中进行透析。最后将角蛋白溶液冻干成粉末备用。

(2)所用的溶液的制备：

称取0.0849g硝酸银固体配制5ml硝酸银溶液(0.1mol/l)，将角蛋白用超纯水配制5份浓度为5～30mg/ml；称取0.4000g氢氧化钠固体配制1ml氢氧化钠(10mol/l)溶液并将其另稀释两份1ml氢氧化钠(1mol/l)与1ml氢氧化钠(0.1mol/l)；称取0.1892g硼氢化钠固体用1mol/l氢氧化钠溶液配制成5ml硼氢化钠溶液(1mol/l)，再将其用浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液和浓度为0.01mol/l的氢氧化钠溶液分别稀释成0.1mol/l硼氢化钠溶液和0.01mol/l硼氢化钠溶液。

实施例1

在室温且搅拌的状态下，将5ml角蛋白溶液(10mg/ml)与0.2ml硝酸银溶液(0.1mol/l)充分反应5分钟后，加入0.15ml氢氧化钠溶液(0.1mol/l)搅拌反应15分钟后，向上述的溶液加入0.23ml硼氢化钠溶液(0.1mol/l)，混合均匀后，静置30分钟，通过sephadex-g25凝胶层析柱纯化方法终止反应进行，即得到稳定的产物银纳米簇，配制1mg/ml银纳米簇，用400nm激发光激发，测得710nm处荧光最强。

实施例2

在室温且搅拌的状态下，将5ml角蛋白溶液(5mg/ml、7.5mg/ml、15mg/ml、30mg/ml)与0.2ml硝酸银溶液(0.1mol/l)充分反应5分钟后，加入0.15ml氢氧化钠溶液(1mol/l)搅拌反应15分钟后，向上述的溶液加入0.23ml硼氢化钠溶液(0.1mol/l)，混合均匀后，静置30分钟，通过sephadex-g25凝胶层析柱纯化方法终止反应进行，即得到产物银纳米簇，配制1mg/ml银纳米簇，用400nm激发光激发，测得光强分别为实例1产物的0.12，0.65，0.70，0.49倍。

实施例3

在室温且搅拌的状态下，将5ml角蛋白溶液(10mg/ml)与0.2ml硝酸银溶液(0.1mol/l)充分反应5分钟后，加入0.15ml氢氧化钠溶液(0.1mol/l、10mol/l)搅拌反应15分钟后，向上述的溶液加入0.23ml硼氢化钠溶液(0.1mol/l)，混合均匀后，静置30分钟，通过sephadex-g25凝胶层析柱纯化方法终止反应进行，即得到稳定的产物银纳米簇，配制1mg/ml银纳米簇，用400nm激发光激发，测得光强分别为实例1产物的0.00，0.19倍。

实施例4

在室温且搅拌的状态下，将5ml角蛋白溶液(10mg/ml)与0.2ml硝酸银溶液(0.1mol/l)充分反应5分钟后，加入0.15ml氢氧化钠溶液(0.1mol/l)搅拌反应15分钟后，向上述的溶液加入0.23ml硼氢化钠溶液(0.01mol/l)，混合均匀后，静置30分钟，通过sephadex-g25凝胶层析柱纯化方法终止反应进行，即得到稳定的产物银纳米簇，配制1mg/ml银纳米簇，用400nm激发光激发，测得光强分别为实例1产物的0.70倍。

实施例5

在(0℃、40℃)且搅拌的状态下，将5ml角蛋白溶液(10mg/ml)与0.2ml硝酸银溶液(0.1mol/l)充分反应5分钟后，加入0.15ml氢氧化钠溶液(1mol/l)搅拌反应15分钟后，向上述的溶液加入0.23ml硼氢化钠溶液(0.1mol/l)，混合均匀后，静置30分钟，通过sephadex-g25凝胶层析柱纯化方法终止反应进行，即得到稳定的产物银纳米簇，配制1mg/ml银纳米簇，用400nm激发光激发，测得光强分别为实例1产物的0.36，0.23倍。

实施例6

在室温且搅拌的状态下，将5ml角蛋白溶液(10mg/ml)与0.2ml硝酸银溶液(0.1mol/l)充分反应5分钟后，加入0.15ml氢氧化钠溶液(1mol/l)搅拌反应15分钟后，向上述的溶液加入0.23ml硼氢化钠溶液(0.1mol/l)，混合均匀后，静置30分钟，通过(超纯水、ph＝6的br缓存溶液)纯化方法终止反应进行，即得到稳定的产物银纳米簇，配制1mg/ml银纳米簇，用400nm激发光激发，测得光强分别为实例1产物的0.50，0.67倍。

图1为实施例1合成的银纳米簇的透射电镜示意图及粒径分布(2.53±0.54nm)。

图2为实施例1合成的银纳米簇的吸收光谱图，其中线1为1mg/ml角蛋白溶液的紫外吸收光谱；线2为1mg/ml银纳米簇的紫外吸收光谱；线3为1mg/ml银纳米簇的荧光吸收光谱。结果明白银纳米簇中没有大尺寸粒径的存在，且在激发光为400nm时，最大荧光发射峰位为710nm。

图3为实施例1合成的银纳米簇的荧光稳定性表征图。其中线1、线2分别为合成结束时与保存三个月后的荧光强度。银纳米簇的荧光光强可以在三个月后还维持在80％以上，说明了本方法合成银纳米簇的稳定性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。