一种复合微生物菌肥及其制备方法与流程

技术特征：

1.一种复合微生物菌肥，其特征在于，制备该复合微生物菌肥的原料按重量份为：浑圆链霉菌粉20-60份， 环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉20-60份， 多孢木霉菌粉20-40份，巴氏梭菌菌粉20-40份，氨基酸原粉10-20份，黄腐酸钾10-20份，棉粕粉10-20份。

2.根据权利要求1所述的一种复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

、浑圆链霉菌粉的制备

取出浑圆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为浑圆链霉菌种子液；

二级种子扩培：将上述制备的浑圆链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为浑圆链霉菌二级种子液；

发酵：将上述制备的浑圆链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的浑圆链霉菌固体发酵培养基上，菌种与浑圆链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的浑圆链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵4-6天，检测其孢子含量不低于40亿CFU/g，即可低温风干，即得到浑圆链霉菌菌粉；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；

其中，所述的浑圆链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的浑圆链霉菌固体发酵培养基：啤糟渣80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉

崛越氏芽孢杆菌种子液的制备

取出崛越氏芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为崛越氏芽孢杆菌种子液；

环状芽孢杆菌种子液的制备

取出环状芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为350L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于10亿cfu/ml，即可作为环状芽孢杆菌种子液；

发酵：将上述制备的崛越氏芽孢杆菌种子液与环状芽孢杆菌种子液以1：3-1：1的比例混匀，然后以总接种量的10%-20%的接种量加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵36-48小时，待芽孢含量不低于100亿cfu/g，其中环状芽孢杆菌的芽孢含量不低于40亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到环状芽孢杆菌与崛越氏芽孢杆菌混合发酵菌粉；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖5g，磷酸氢二钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.1 g，碳酸钙5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述液体种子培养基：糖蜜35 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙5.0 g/L，pH7.0；

其中，所述的芽孢固体发酵培养基：甘蔗渣57%，麸皮35%，棉粕5%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、多孢木霉菌粉的制备

多孢木霉种子液的制备：取出多孢木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4-6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为多孢木霉种子液；

发酵：将上述制备的多孢木霉种子液以3%的接种量接种至灭菌的多孢木霉固体发酵培养基上，菌种与多孢木霉固体培养基混合均匀后，将接好种的多孢木霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-10cm，控温28-32℃，湿度保持为60%-75%，发酵4-6天，检测其总孢子含量不低于30亿CFU/g，即可低温风干，即得到多孢木霉菌粉；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的多孢木霉固体发酵培养基：麸皮85%，芝麻渣粕2%，玉米芯5%，石粉4%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、巴氏梭菌菌粉的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有999mLRCM培养基的厌氧瓶中，37℃条件下静态厌氧活化64h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的99L巴氏梭菌发酵培养基中，37℃条件下静态厌氧培养64h~126h，芽孢含量超过30亿CFU/ml，即可加入轻质碳酸钙，喷雾干燥，调节巴氏梭菌芽孢含量30亿CFU/g，即为巴氏梭菌菌粉；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g /L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，

其中，所述的巴氏梭菌发酵培养基：:酵母膏20g/L，牛肉膏10g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min；

、将上述步骤中的浑圆链霉菌粉20-60份， 环状芽孢杆菌Bacillus circulans与崛越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii 混合发酵菌粉20-60份， 多孢木霉菌粉20-40份，巴氏梭菌菌粉20-40份，氨基酸原粉10-20份，黄腐酸钾10-20份，棉粕粉10-20份混匀，检测总菌含量不低于30亿CFU/ g，包装即为复合微生物菌肥。