有机改性的矿物微粒及其制备方法和用途与流程

本发明属于矿物微粒领域，所述矿物微粒选自氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙或其混合物，这些矿物微粒用作生物分子递送或吸附系统，如用作疫苗佐剂。更具体地，本发明提供有机衍生的氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙微粒及其用途和制备方法。

背景技术：

矿物佐剂如包括磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙的含铝佐剂，几十年来一直被成功地用于增强对灭活、减活和亚单位疫苗抗原的免疫应答。铝佐剂是目前在兽用和人用疫苗中使用最广泛的佐剂。这使人们对制备这些含矿物佐剂甚至更有兴趣。更有潜力的佐剂和疫苗意味着可以简化和减少疫苗接种，这就可能减少患者、医护人员和提高成本/效益。

佐剂效力的一个重要方面取决于抗原在引流淋巴结中的免疫系统的细胞或体液分支的递送和呈现。佐剂吸附抗原的含量或载量(以重量比表示)是一个重要参数，因为它调节某些抗原分子与佐剂一起被识别为异物并引起适当免疫应答的可能性。实现单位佐剂更高剂量的抗原可能是希望的，因为它允许减少相同剂量抗原的佐剂负荷，从而降低生产成本。抗原与佐剂结合的强度和性质是另一个重要参数，因为它决定了抗原呈颗粒形式(与佐剂颗粒结合)而不是以游离形式释放到周围生理环境中的可能性。这对于具有高扩散常数的小可溶性肽可能尤其重要，因为事实上，众所周知，作为疫苗的肽会引起较差的免疫原性，因此需要含佐剂(li,w.,joshi,m.d.,singhania,s.,ramsey,k.h.,&murthy,a.k.(2014).peptidevaccine:progressandchallenges.vaccines,2(3),515-536.]。与颗粒相对强的结合将减少抗原解吸和扩散到培养介质中的可能性，并避免被抗原呈现细胞识别从而限制疫苗的效力。但研究表明，由于抗原呈现细胞对吸附抗原的处理和呈现不佳，铝佐剂对抗原吸附过强可能导致疫苗效率降低(hansenb.etal.,relationshipbetweenthestrengthofantigenadsorptiontoanaluminum-containingadjuvantandtheimmuneresponse,vaccine,2007)。因此，疫苗界和工业界的强大压力是更好地控制与佐剂组合的抗原的最终递送方式。这个问题的一个可能的解决办法是能够设计出适合所递送抗原的物理化学特性的佐剂。

佐剂效力的另一方面可能与粒度有关。例如，morefield等人(morefieldg.l.etal.,roleofaluminum-containingadjuvantsinantigeninternalizationbydendriticcellsinvitro,vaccine,2005)和li等人(lix.etal.,aluminumhydroxidenanoparticlesshowastrongervaccineadjuvantactivitythantraditionalaluminumhydroxidemicro-particles,j.control.release,2014)的研究表明，与较大的颗粒相比，较小粒度的含铝颗粒表现更好，特别是在诱导抗原特异性抗体反应方面，因为较小的颗粒可以被转运至最近的传入淋巴结。目前，用于减小颗粒粒度的技术有很多，如超声、高压剪切、过滤、均化、研磨、微流化、沉淀或再结晶等。另外，很好地建立起生产确定粒度颗粒的合成路线。调节合成参数，如al³⁺与po4^3-(或oh^-)的化学计量比和ph，可能会导致不同粒度的颗粒(burrelll.s.etal.,aluminiumphosphateadjuvantspreparedbyprecipitationatconstantph.parti:compositionandstructure,vaccine,2000；burrelll.s.etal.,aluminiumphosphateadjuvantspreparedbyprecipitationatconstantph.partii:physicochemicalproperties,vaccine,2000)。

但仍需要一些时间和成本更为节约的改进方法，这些方法对颗粒粒度的均匀性提供更好的控制，并产生具有最佳抗原结合性能的矿物微粒。

技术实现要素：

在共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中，本发明人描述了如何搅拌选自磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙或其混合物的某些二价或三价金属盐的矿物微粒在一种或多种无机聚磷酸盐的水溶液(如有机聚磷酸盐的溶液)中的悬浮液，使所述矿物颗粒发生改性，从而导致其标称静电电位发生显著变化，并导致颗粒粒度减小。

不希望受理论所局限，假定的是这些改性由所述矿物微粒的表面处无机聚磷酸根离子与氢氧根或正磷酸根基团的取代反应或配体交换引起的。

本发明人现在发现应用通式1a或1b的有机聚磷酸盐可以实现类似的取代反应或配体交换:

其中n为0-5的整数和m为2-10的整数，和其中ra代表选自腺苷和其它核苷、硫胺、碳水化合物和异戊二烯的有机取代基，和rb代表选自肌醇和其它环多醇以及碳水化合物的有机取代基。

因此，由于携带至少一个聚磷酸根基团-o-po2-(-o-po2-)n-o-po3(其中n为0-5的整数)或携带2-10个磷酸根基团-o-po3，本发明的有机聚磷酸盐可以被视为“聚磷酸盐”。

作为通式1a的有机聚磷酸盐的实例，可提及的有腺苷和其它核苷磷酸盐如atp和adp、硫胺磷酸盐如三磷酸硫胺和二磷酸硫胺、碳水化合物聚磷酸盐如α-d-核糖5-三磷酸盐和l-抗坏血酸-2-三磷酸盐、蝶呤磷酸盐和异戊二烯磷酸盐如牻牛儿基二磷酸盐。

作为通式1b的有机聚磷酸盐的实例，可提及的有肌醇和其它环多醇磷酸盐如二磷酸肌醇(ip2)、三磷酸肌醇(ip3)、四磷酸肌醇(ip4)、五磷酸肌醇(ip5)和六磷酸肌醇(ip6)，其中ip6也称作植酸或植酸盐(作为盐)。通式1b的其它实例包括碳水化合物磷酸盐如1,6-二磷酸葡萄糖、1,6-二磷酸果糖、2,6-二磷酸果糖、1,5-二磷酸核酮糖、1,5-二磷酸2-脱氧-d-核糖以及1,3-和2,3-二磷酸甘油酯。

与共同待审国际申请pct/ep2017/076232的公开相比，这里公开的本发明提供了令人惊讶的优点。应用通式1a或1b的有机聚磷酸盐导致在颗粒表面处提高的反应收率，从而导致更高的表面覆盖率。因此，与以前相比，观察到微粒的标称静电电位发生了更显著的变化，并且控制颗粒粒度的减小似乎更容易，因为由此产生更小的有机衍生的矿物微米和纳米颗粒的稳定性似乎更高。其次，也是最重要的，与共同待审国际申请pct/ep2017/076232中所述的无机聚磷酸盐所能达到的相比，应用特别是通式1b的有机聚磷酸盐可导致最终的改性矿物微粒的热稳定性更高，这对于高压灭菌/杀菌目的非常重要。最后，本发明的有机衍生的矿物微粒对抗原的吸附容量(如模型抗原鸡卵溶菌酶(hel)所证实的)高于共同待审国际申请pct/ep2017/076232中公开的无机聚磷酸盐改性的微粒所观察到的。本发明人认为，这可能是由于特定的通式1b的有机聚磷酸盐对蛋白质和多肽中的带正电残基如赖氨酸和精氨酸的螯合作用引起的，导致更强地吸附到颗粒表面。

通式1a的有机聚磷酸盐的热稳定性可能低于通式1b的聚磷酸盐。核苷酸(通式1a的有机聚磷酸盐的实例)是生物多功能分子，其在能量代谢、dna合成和细胞信号传导中起着主要作用。它们由在-ose部分的5′-位处带有单、二或三磷酸根基团的核苷部分组成。由于磷酸根对铝凝胶具有亲和性，核苷酸如atp将吸附在铝佐剂上，并因此可用来改变佐剂颗粒表面的静电电位。同样，可应用佐剂铝颗粒携带和递送核苷酸给细胞。但铝佐剂通常用高压釜灭菌，这与核苷酸的化学完整性不相容。在高压灭菌器中的高温高压条件下，adp或atp的无机聚磷酸根链上的磷酸酐键会发生水解，使这些分子的物理和化学性质丧失或发生负面的改变。作为高压灭菌的替代方法，可通过具有0.22μm或0.10μm孔的膜过滤消毒在水中至多100mm的浓缩atp、adp或amp溶液，并将灭菌溶液进料至高压灭菌后的铝佐剂颗粒中至合适的最终浓度，例如0.5-2mm，从而无需高压灭菌。

与通式1a或通式1b的有机聚磷酸盐的反应应用选自磷酸铝、氢氧化铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙的某些二价或三价金属盐来实施，但也适用于多种其它矿物微粒。

可在与含水反应环境相容的较宽温度范围内实施取代反应或配体交换。

在本申请中，术语“未改性的矿物微粒”指用于所述取代反应/配体交换的初始材料，而术语“有机衍生的矿物微粒”指所述取代反应/配体交换的结果或产品。

图6a给出了矿物微粒初始材料(此处为磷酸铝)与有机聚磷酸盐的溶液间的假定反应，该反应发生在微粒表面。本文中所指的磷酸铝(佐剂)主要是羟基磷酸铝，其中一些羟基(al-oh)被正磷酸根基团(al-opo3，表示为pi)所取代。反应主要发生在可用的al-oh基团与溶解的有机聚磷酸根离子之间，和随着时间的推移，有机聚磷酸根基团(表示为np有机)逐渐更完全地覆盖磷酸铝颗粒表面。取代反应还可能涉及正磷酸根基团；即在某种程度上可用的正磷酸根基团被有机聚磷酸根基团取代。但假定的是羟基是比正磷酸根基团更好的离去基团，并因此而被优先取代。

矿物微粒初始材料实际上由较小晶体的团簇/聚集体组成，正如图6c中用电子显微镜所观察到的。假定的是晶体至少部分通过位于颗粒上的羟基之间的氢键结合在一起。一旦有机聚磷酸根基团开始交换羟基，氢键数量的减少会削弱晶体的凝聚力。同时，正如用电子显微镜所观察到的(图6c)，具有多个负电荷的紧密布置的有机聚磷酸根基团的数量不断增加，导致晶体团簇进一步失稳并最终解聚(图6b)。

但与共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中描述的无机聚磷酸盐改性的矿物微粒相比，本发明得到的有机衍生矿物微粒的稳定性有所提高。首先，1b型分子中的磷酰酯键比两个正磷酸根间的磷酸酐键(通式1a)具有更高的活化能，这就可以在不使大多数磷酸根基团水解的情况下实施热处理灭菌，并因此保留了利用这种有机聚磷酸盐改性的特性。其次，不希望受理论所局限，本发明人认为颗粒在悬浮液(胶体)中的稳定性提高至少部分是由附着在矿物微粒表面的有机磷酸根基团施加的空间位阻增加引起的。有机磷酸根基团的有机残基(ra或rb)比pct/ep2017/076232中讨论的无机聚磷酸根离子体积更大。因此，当位于矿物微粒表面的一些原始羟基或正磷酸根基团被有机聚磷酸根基团取代后，接近剩余羟基或正磷酸根基团将被有效阻止，不能进一步取代。

另外，本发明人发现有机衍生的矿物微粒对带正电的生物分子或具有正电斑块的生物分子具有增强的结合性能，更特别地是抗原结合性能。推测该特性是由于带正电的生物分子(例如抗原)对所述有机衍生的矿物微粒的表面的吸引力增加所致，导致吸附容量和/或结合强度增加，即结合常数增加。鉴于此，根据本发明的有机衍生的矿物微粒可以例如用作改良的疫苗佐剂。

因此，在第一方面，这里提供一种有机衍生的矿物微粒的制备方法，包括搅拌矿物微粒初始材料在一种或多种有机聚磷酸盐的溶液中的悬浮液，其中所述矿物微粒选自磷酸铝、氢氧化铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒或其混合物，和其中所述有机聚磷酸盐选自通式1a或1b的化合物：

其中n为0-5的整数和m为2-10的整数，和其中ra代表选自腺苷和其它核苷、硫胺、碳水化合物和异戊二烯的有机取代基，和rb代表选自肌醇和其它环多醇以及碳水化合物的有机取代基。

搅拌持续足够时间，以允许矿物微粒表面发生反应，通过该反应可用的氢氧根和某种程度的正磷酸根基团被有机聚磷酸根离子交换，即取代。可允许取代反应进行更短或更长时间，以实现离子的部分或更完全取代。

上述的化学反应可以描述为配体交换或取代反应，从而位于矿物微粒初始材料表面的氢氧根阴离子被有机聚磷酸根离子交换。因为有机聚磷酸根离子中的磷酸根基团对al(iii)的亲和力远高于氢氧根，根据lechateliers原理，平衡向右偏移(例如adjuphos+np有机→adjuphos-np有机+oh^-)。

如上所述，配体交换/取代反应通常发生在含水反应环境中，并且可在约0-100℃的温度范围内实施，例如5-95℃、或10-90℃、或15-85℃、或20-80℃、或25-75℃、或30-70℃、或40-60℃。反应可方便地在环境温度下或在约20℃±(5-10)℃下实施。取代反应或配体交换也可以在大于100℃的温度下在中等压力下实施。

在配体交换/取代反应中，与原始(未改性)颗粒相比，颗粒粒度减小。粒度的减小取决于取代反应可进行的程度、反应速率和反应持续时间。反应速率很复杂，因为它们取决于参数如特定的初始材料、有机聚磷酸盐的类型、有机聚磷酸盐的初始浓度、主体溶剂的ph值、反应温度和界面效应(在颗粒表面和主体溶剂的界面处)。

反应进程可以通过原位测量来在线跟踪，也可以通过取样并对分离样品随后分析而离线跟踪。因此，对于矿物微粒初始材料与有机聚磷酸盐的某些组合，本领域熟练技术人员不需要创造性的努力就可以确定正确的反应时段。例如，应用离子色谱法可以作为时间的函数量化从主体溶液中消失的有机聚磷酸根离子的数量，并间接测量这些离子在磷酸铝或磷酸钙颗粒表面的吸附量。替代地，吸附到颗粒表面的有机聚磷酸根离子的直接测量可以通过敏感的电化学方法来测量，例如电化学扫描隧道显微镜(stm)、电化学石英晶体导纳(eqca)，或甚至可以用灵敏的石英晶体微天平(qcm)检测质量变化。根据双电层理论，颗粒电动势(ζ-电位)的变化也反映了在颗粒表面的helmholtz平面上聚磷酸根的吸附。

因此，上文所述的配体交换/取代反应的相关监测程序涉及作为时间的函数或作为有机聚磷酸根浓度的函数监测ζ-电位的变化，因为颗粒表面的化学改性将在高灵敏度下通过表面静电电荷反映。监测颗粒表面改性的补充方法包括但不限于拉曼散射和红外吸收光谱(这些方法将检测吸附的有机聚磷酸盐的特定化学特征)、二次离子质谱(其将监测离子束辐照后由颗粒表面解吸的二次离子(来自有机聚磷酸盐))、或元素分析如能量分散x-光散射以记录在最初不含碳的颗粒中源自改性剂的碳的存在。通过从有机聚磷酸盐的溶液中脱除有机衍生矿物微粒并在水中淋洗它们，一旦达到所需的ζ值，则可终止配体交换/取代反应。一旦ζ-电位在5-10分钟(例如5分钟、7.5分钟或10分钟)内的变化不超过10％，优选不超过5％，则也可以停止反应。

为了方便，在下文以及本专利申请的全文中，上文所述的涉及有机聚磷酸盐的溶液中的矿物微粒的配体交换/取代反应将被称为“平衡”或“平衡步骤”。

在第二方面，本发明提供按第一方面的平衡方法可获得的有机衍生的矿物微粒。

在特定的实施方案中，所述平衡导致位于微粒表面处的磷酸根离子或氢氧根离子被有机聚磷酸根离子部分或全部取代。

在其它特定的实施方案中，所述平衡用通式1a的有机聚磷酸根离子实施。

在优选的实施方案中，所述平衡用通式1b的有机聚磷酸根离子实施。

在特别优选的实施方案中，所述平衡用植酸/ip-6/六磷酸肌醇或其盐实施。

在特定的实施方案中，用有机聚磷酸盐进行的所述矿物微粒的所述平衡增加了所述矿物微粒的标称静电电位。

在特定的实施方案中，用有机聚磷酸盐进行的所述矿物微粒的所述平衡减小了所述矿物微粒的粒度。

在特定的实施方案中，所述有机聚磷酸盐的溶液包含带负电的有机聚磷酸盐，其中所述溶液优选具有生理ph值。

在另一个实施方案中，所述有机聚磷酸盐的溶液包括两种或更多种带负电的有机聚磷酸盐的混合物。

在特别优选的实施方案中，所述有机聚磷酸盐的溶液包括六磷酸肌醇(植酸/ip-6)。

在其它特定的实施方案中，在如下条件下实施所述平衡步骤：

i.在环境温度或在约20℃±(5-10)℃下，

ii.反应时间至少2分钟，和/或

iii.有机聚磷酸盐的初始浓度为至少0.1mm和至多20mm，和/或

iv.在ph4.0和ph7.5之间的ph值下。

在特定的实施方案中，所述矿物微粒初始材料具有：

i.当通过dls或激光衍射在胶体悬浮液中测量时，标称粒度至少0.1μm和至多5μm，和/或

ii.当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸铝的ζ-电位为至少-20和至多-30mv，

iii.当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，氢氧化铝的ζ-电位为至少+10和至多+20mv。

iv.当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸钙的ζ-电位为至少-10和至多-20mv。

这里还提供由选自如下的矿物微粒的平衡制备的有机衍生的矿物微粒：氢氧化铝微粒、磷酸铝微粒、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒，其中位于所述矿物微粒表面处的至少部分氢氧根离子被有机聚磷酸根离子取代。

在特定的实施方案中，本发明的有机衍生的矿物微粒具有：

(i)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸铝的标称ζ-电位为至少–35mv，

(ii)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，氢氧化铝的ζ-电位为至少+10和至多+20mv。

(iii)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸钙的标称ζ-电位为至少–40mv，

(iv)标称粒度至少0.01μm和至多2μm，

(v)al与p的化学计量比为1.2+/-0.15至1，

(vi)ca与p的化学计量比为1.7+/-0.2，和/或

(vii)有机聚磷酸根离子对所述微粒的最大表面覆盖导致最大np有机/al化学计量比0.05。

在其它特定的实施方案中，所述有机衍生的矿物微粒作为灭菌、盐水缓冲水溶液中的浆液或悬浮液形式提供。

在其它特定的实施方案中，所述有机衍生的矿物微粒作为喷雾冻干粉提供(wanningetal.,pharmaceuticalsprayfreezedrying.internationaljournalofpharmaceutics,2015,488:136-153)，以准备在无菌水中进行重组。

在另一个特定的实施方案中，有机衍生的矿物微粒作为任选含稳定赋形剂海藻糖的干燥冻干制剂提供。

在特定的实施方案中，与矿物微粒初始材料相比，本发明的所述有机衍生的矿物微粒具有增加的生物分子结合性能，其中所述生物分子优选具有与所述改性微粒相反的电荷，或者当所述改性微粒为中性时，所述生物分子也为中性。

在特定的实施方案中，所述生物分子为抗原。

还提供的是本发明的所述有机衍生的矿物微粒在医药中的用途。

在特定的实施方案中，本发明的所述有机衍生的矿物微粒用作生物分子递送或吸附系统。

在特定的实施方案中，所述生物分子递送系统为疫苗佐剂。

在特定的实施方案中，本发明的所述有机衍生的矿物微粒在疫苗中用作疫苗佐剂。

在特定的实施方案中，本发明的所述有机衍生的矿物微粒用于血液分级，优选用作生物分子吸附系统。

附图说明

图1：经ip6处理的佐剂颗粒对鸡卵溶菌酶(hel)的吸附容量。

图1作为悬浮液中hel浓度的函数给出了在颗粒上吸附的hel量。显然，与用间-六磷酸盐(m6pi)处理相比，用ip6处理颗粒提高了颗粒的吸附容量，ip6的最大吸附量为1.4mghel/mg当量al³⁺，而m6pi为1.1mghel/mg当量al³⁺，正磷酸盐(pi)为～0.8mghel/mg当量al³⁺。另外，这些结果表明，即使在高压灭菌(用作adju-phos的灭菌工艺)后，经ip6处理的颗粒仍具有优异的hel吸附容量。

图2：六磷酸肌醇(ip6)对磷酸钙佐剂颗粒的ζ-电位的影响。

图2给出了磷酸钙颗粒ζ-电位对正磷酸盐(pi)、间-六磷酸盐(m6pi)和六磷酸肌醇(ip6)浓度的依赖关系。用任何磷酸盐处理都会导致磷酸钙颗粒的ζ-电位增加，这表明在颗粒表面处磷酸根离子的吸附现象。ζ-电位对浓度的依赖性令人联想到langmuir型吸附等温线，这表明存在结合位点的饱和。正磷酸盐导致ζ-电位由约-5mv增加至-20mv，聚磷酸盐m6pi和ip6分别使ζ-电位更剧烈地增加至约-50mv和-60mv。

图3：用六磷酸肌醇(ip6)处理的磷酸钙颗粒对鸡卵溶菌酶的吸附容量。

图3作为悬浮液中hel浓度的函数给出了在磷酸钙颗粒上吸附的hel的量。显然，与用间-六磷酸盐处理相比，用ip6处理磷酸钙颗粒提高了颗粒的吸附容量，ip6的最大吸附量为～180μg/mg当量ca²⁺，而m6pi的对应值为～120μg/mg当量ca²⁺，pi的对应值为～45μg/mg当量ca²⁺。

图4：颗粒对腺苷、5′-单磷酸腺苷(amp)和5′-三磷酸腺苷(atp)的吸附容量。

图4清楚地给出了atp吸附容量如何比amp和未磷酸化腺苷增加了至少5倍。可以判断的是atp中存在缩聚的三磷酸根基团导致产生这种效果，而amp中是单磷酸根基团。三磷酸根基团增强腺苷吸附容量的机理仍有待研究。可以假设的是聚磷酸根链上存在额外的羟基在统计上会增加通过配体交换与结合的概率，或者这些反应性羟基在atp中的空间位阻较小。替代地，atp的三磷酸根链上的终端羟基的化学反应性高于amp，或者atp中α-位的磷酸根被用作离去基团的焦磷酸根(β-和γ-位的磷酸根)影响得更具反应性。

图5：六磷酸肌醇(ip6)浓度对adju-phos的ζ-电位的影响。

图5给出了用其它磷酸根和聚磷酸根离子观察到的相同图案，其中在第一阶段，由于六磷酸肌醇(ip6)吸附到颗粒表面，ζ-电位从-43mv增加到-60mv，和在第二阶段，ζ-电位从-60mv降低到-35mv，这很可能是由于离子强度的增加导致电荷的库仑屏蔽和双静电层的压缩。因此，本实验表明在ip6浓度为5mm时达到了最佳平衡。

图6a和6b：在羟基磷酸铝颗粒和溶解的有机聚磷酸根离子的表面处假定的取代反应。

图6a给出了矿物微粒(以氢氧化铝为例)如何与有机聚磷酸盐反应以产生有机衍生的矿物微粒，其中有一些羟基已被有机聚磷酸根基团取代。

图6b给出了有机衍生的矿物微粒如何由于(假定的)电荷间的排斥而最终开始分开。

图6c：颗粒(上图)和adju-phoszp(下图)的电子显微照片(tem)。

图6c比较了未改性的颗粒(上图)和用2mmna-ip6改性的adju-phoszp的显微形态。颗粒的平均粒径分布为～2.5μm，由粒径为～20nm的板状小晶体的聚集体组成。当用ip6处理时，显微颗粒会部分解聚，这可以在下图中作为～20nm的单个晶体而看到。

图7：adju-phos颗粒对腺苷、5′-单磷酸腺苷(amp)和5′-三磷酸腺苷(atp)的吸附容量。

图7给出了atp的吸附容量如何比amp和未磷酸化腺苷增加至少2倍。可以判断的是atp中存在一个缩聚的三磷酸根基团导致产生这种效果，而amp中是单磷酸根基团。三磷酸根基团增强腺苷吸附容量的机理仍有待研究。可以假设的是聚磷酸根链上存在额外的羟基在统计上会增加通过配体交换与adju-phos结合的概率，或者这些反应性羟基在atp中的空间位阻较小。替代地，atp的三磷酸根链上的终端羟基的化学反应性高于amp，或者atp中α-位的磷酸根被用作离去基团的焦磷酸根(β-和γ-位的磷酸根)影响得更具反应性。

图8：铝水凝胶颗粒对腺苷、5′-单磷酸腺苷(amp)和5′-三磷酸腺苷(atp)的吸附容量。

图8给出了与未磷酸化腺苷相比，atp和amp这两种磷酸化形式的腺苷如何强烈地吸附到铝水凝胶上。atp和amp的吸附容量没有明显的差异，表明atp中三磷酸根链的存在相比于amp中单磷酸根基团并没有提供任何附加的提高。这与adju-phos形成对比，在后者中，在相同浓度范围内，atp的吸附容量高于amp的吸附容量。比adju-phos相比，氢氧化铝由于其性质具有更高比例的可与磷酸根发生配体交换反应的氢氧根基团(每摩尔铝)。因此，预期的是铝水凝胶对磷酸化分子如atp或amp的吸附容量比adju-phos更高。铝水凝胶对amp和atp的反应性相同或相似，因为它可能只涉及反应性差别不大的终端磷酸根基团。

图9：5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对adju-phos的ζ-电位的影响。

图9给出了随atp浓度增加到1mm，adju-phos的ζ-电位(绝对值)从-40mv增加到-48mv。atp浓度从1mm进一步增加到6mm，并不会导致ζ-电位的进一步增加，这表明atp吸附位点在1mm内达到饱和。与atp相比，用amp处理导致ζ-电位(绝对值)从-40mv降至-35mv。atp与amp间的这种差异可归因于adju-phos对atp的吸附容量高于amp(图1)和atp携带更多的负电荷(三磷酸根而不是单磷酸根)。对用未磷酸化腺苷处理的adju-phos来说，ζ-电位没有明显变化。

图10：5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对adju-phos沉积物床层高度的影响。

图10是塑料分光光度试管中均质悬浮液的照片，证实了5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对adju-phos沉积物床层高度的影响。atp浓度从左至右依次为：0.0mm、0.5mm、1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm和5.0mm。

图11：5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对adju-phos沉积物床层高度的影响。

图11给出了在静止48小时后测量的adju-phos沉积物床层高度随atp浓度变化而由16mm降至9.5mm。床层高度的最显著下降发生在atp为0.0-1.0mm，这对应于adju-phos的ζ-电位增加最多的浓度范围(图9)，表明这两个参数是相关的。有趣的是，amp处理会产生相反的效果，其中adju-phos沉积物床层高度随浓度变化而增加。看起来尽管ζ-电位增加，但5′-三磷酸腺苷上的三磷酸根链诱导了adju-phos颗粒聚集，预计由此产生的静电斥力将使颗粒彼此分开。对无机聚磷酸盐和植酸盐(六磷酸肌醇)来说也观察到了类似图案。

图12：磷酸钙颗粒对腺苷、5′-单磷酸腺苷(amp)和5′-三磷酸腺苷(atp)的吸附容量。

图12给出了磷酸钙吸附atp、amp和腺苷，其吸附容量作为浓度的函数呈线性增加，几乎没有饱和迹象(在本实验中使用的核苷酸浓度范围内)。atp和amp的吸附量似乎也比腺苷高，这表明磷酸根基团是更高吸附容量的原因。可以假设在amp和atp中存在磷酸根基团通过与磷酸钙基质中的氢氧根离子进行配体交换来增加在磷酸钙上的吸附，因为本实验中应用的磷酸钙佐剂是具有未知化学计量氢氧根数的钙和磷酸根的(不溶于水的)水合盐。

图13：5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对磷酸钙ζ-电位的影响。

图13给出了随着atp浓度增加至1mm磷酸钙ζ-电位(绝对值)从-5mv增加到-40mv。这种ζ-电位的急剧增加被解释为(根据静电双层模型)对颗粒吸附层(sternlayer)的特定吸附。atp浓度从1mm进一步增加到6mm，只导致ζ-电位略有增加，这表明atp吸附位点在1mm内达到饱和。与atp相比，用amp处理仅导致ζ-电位(绝对值)从-5mv轻微增加到-10mv，这也表明对颗粒表面的特定吸附。由于atp和amp在磷酸钙上的吸附容量相似(图3)，atp和amp间ζ-电位的显著差异可归因于atp携带更多的负电荷(三磷酸根而不是单磷酸根)。对用未磷酸化腺苷处理的磷酸钙来说，ζ-电位没有明显变化，表明对颗粒的吸附层(sternlayer)没有发生特定吸附。这种结果表明，腺苷在磷酸钙上的吸附(图3)可能是非特定的，导致传质和包埋入凝胶基质中。atp和amp的吸附似乎是特定的，因为ζ-电位的变化表明为化学吸附过程，导致磷酸钙颗粒的净静电荷发生变化。

图14：塑料分光光度试管中均质悬浮液的照片，证实了5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对磷酸钙沉积物床层高度的影响。atp浓度从左至右依次为：0.0mm、1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm和5.0mm。

图15：5′-三磷酸腺苷(atp)和5′-单磷酸腺苷(amp)的浓度对磷酸钙沉积物床层高度的影响。

图15给出了经过48小时静置后测量的磷酸钙沉积物床层高度作为atp浓度的函数从11mm下降至6mm。床层高度的最剧烈下降发生在atp为0.0-2.0mm时，这对应于磷酸钙ζ-电位增加最多(图13)时的浓度范围，表明这两个参数是相关的。有趣的是，amp处理没有改变磷酸钙沉积物床层高度。看起来尽管ζ-电位增加，但5′-三磷酸腺苷上的三磷酸根链似乎诱导了磷酸钙颗粒聚集，预计由此产生的静电斥力使颗粒彼此分开。对无机聚磷酸盐和植酸盐(六磷酸肌醇)来说也观察到了类似图案。

图16：初始用六磷酸肌醇钠处理的的系列稀释效果。

图16表明在ph值为7.0下在5mm咪唑中稀释后，当稀释5-320倍时，未处理的adju-phos的ζ-电位(绝对值)由-35mv下降至-22mv。相比之下，初始用0.2mmna-ip6处理的adju-phos表现出由-47mv至-33mv的更高ζ-电位值，与针对未处理的adju-phos所观察到的趋势一致。

对未处理的adju-phos，ζ-电位作为稀释倍数的函数降低可以解释为静电场强度的降低，这是因为颗粒平均间距随稀释而增加。这表明在低稀释倍数下，颗粒处于近距离范围内，它们间的静电场相互作用(重叠)并表现为更强(更高的ζ-电位)。随着稀释增大，颗粒间距增大，表观静电场强度降低(低ζ-电位)。这种效应在adju-phos-zp中也可以看到。但adju-phoszp与adju-phos间的较高ζ-电位差恒定在约-12mv处。

如果ip6只可逆地吸附到adju-phos上，人们预计adju-phoszp在高稀释倍数下的ζ-电位将达到的值，但事实并非如此。将用0.2mmip6处理的初始稀释320倍，导致ip6的最终浓度为0.6μm。当用低于10μm的ip6浓度处理时，没有观察到ζ-电位的变化。因此，图16中所示的结果强烈地表明，初始ip6有一部分强烈地吸附到adju-phos上，并不可逆地改变了它的ζ-电位。

图17：初始用atp处理的的系列稀释效果。

图17表明在ph值为7.0下在5mm咪唑中稀释后，当稀释5-320倍时，常规(未处理的)的ζ-电位(绝对值)由-41mv下降至-27mv。初始用1.0mmatp处理的表现出由-44mv至-30mv的略高ζ-电位值，与针对未处理的所观察到的趋势一致。

与用ip6处理的adju-phos(实验12，图16)相比，用atp处理的adju-phos也显示出ζ-电位的增加与稀释倍数无关，虽然ζ-电位差仅约-3mv(相比于ip6的-12mv)。根据与实验12相同的论证，这一结果表明atp在adju-phos上有很强的吸附。

图18：初始用ip6或atp处理的磷酸钙的系列稀释效果。

图18表明在ph值为7.0下在5mm咪唑中稀释后，当稀释5-320倍时，未处理的磷酸钙的ζ-电位(绝对值)由-5mv增加至-10mv。与此相比，用0.5mmna-ip6初始处理的磷酸钙表现出从-26mv至-23mv的更高ζ-电位值。同样，用1.0mmatp初始处理的磷酸钙表现出从-16mv至-22mv的更高ζ-电位值。

如果ip6或atp只可逆地吸附到磷酸钙上，人们预计在高稀释倍数下磷酸钙的ζ-电位将达到磷酸钙的值，但事实并非如此。将用0.5mmip6或1.0mmatp处理的初始磷酸钙稀释320倍，导致最终浓度分别为1.5μmip6或3.0μmatp。当用低于10μm的ip6或atp浓度处理磷酸钙时，没有观察到ζ-电位的变化。因此，图18中所示的结果强烈地表明，初始ip6或atp有一部分强烈地吸附到磷酸钙上，并不可逆地改变了它的ζ-电位。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本发明的测试实践中可以使用与本文所描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

在本说明书和所附权利要求书中，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。

如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”同义，并且是封闭或开放式的，不排除其它未引用的元件、要素或方法步骤。

术语“包含”也包括术语“由...组成”。

如本文所用，当涉及诸如参数、含量、持续时间等可测量值时，术语“约”意指包括规定值的+/-10％或更小的变化，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小，只要这些变化适合在所公开的发明中实施。应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体地、优选地公开。

由端点记载的数值范围包括所有包含在相应范围内的数字和分数以及所引述的端点。

在以下段落中，将更详细地定义本发明的不同方面或实施方案。如此定义的每方面或实施方案可以与任何其它方面或实施方案组合，除非有明确的相反表示。特别地，指示为优选或有利的任何特征均可以与指示为优选或有利的任何其它一个或多个特征组合。

在整个说明书中，“一个实施方案”或“一种实施方案”是指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性均包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在一种实施方案中”并不一定但可以全都指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定的特征、结构或特性可以以任何适当的方式组合，这对于本领域技术人员而言根据本公开将是显而易见的。

本文使用的术语“磷酸铝”指无定形羟基磷酸铝(shirodkars.etal.,aluminumcompoundsusedasadjuvantsinvaccines.pharmaceuticalresearch,1990,7:1282-1288)，其中氢氧化铝的一些羟基被磷酸根基团所取代。无序、无定形态导致了高的表面积和高吸附容量。它不是化学计量化合物，和其组成取决于沉淀配方和条件。al:p的原子比优选为1.2±0.15-1。

正如这里所称，磷酸铝的表面由al-oh和al-opo3基团组成。取决于磷根盐的取代程度，等电点(iep)在9.4到4.5间变化。商购磷酸铝佐剂的iep值在4.5到5.5之间。

本文所用的术语“氢氧化铝”指氧氢氧化铝，它是结晶的化学计量化合物。

本文所用的术语“磷酸钙”是非羟基磷灰石磷酸钙或主要包含非羟基磷灰石磷酸钙的复合材料。磷酸钙按ca3(po4)2或非化学计量的羟基磷灰石ca10-x(hpo4)x(po4)6-x(oh)2-x表示，其中x是0-2的整数(jiangd.etal.,structureandadsorptionpropertiesofcommercialcalciumphosphateadjuvant,vaccine,2004,23:693-698)。例如，磷酸钙可以指由钙磷石(cahpo4·2h2o)和磷酸钙(ca3(po4)2)组成的复合材料，其可表示为[ca3(po4)2]x·[cahpo4·2h2o]y，其中磷酸钙的量(x)大于钙磷石的量(y)或其中x>y。更具体地，磷酸钙可以指由ca/p重量比约为1.29的钙磷石(cahpo4·2h2o)和ca/p重量比为1.94的磷酸钙(ca3(po4)2)的非羟基磷灰石形式组成的复合材料。ca:p的原子比优选为1.7±0.2-1。

本文所使用的术语“微粒”指标称粒度为至少0.01μm和至多10μm、至多5μm或至多2μm的颗粒。初始材料微粒的标称粒度优选为至少0.1μm和至多5μm。另外，当所述微粒为磷酸铝微粒时，当在蒸馏水中测量时，初始材料微粒的标称ζ-电位可以为至少-10mv和至多-20mv。

正如这里所应用，术语pi或pi应指无机磷酸盐。当缩合的无机磷酸盐为环状时，加一个“m”(间)，如m6pi。例如，二磷酸盐＝2pi，间-六磷酸盐＝m6pi。

正如这里所应用，术语“有机聚磷酸盐”应指被至少两个磷酸根基团(-o-po3)取代的有机分子或被至少一个聚磷酸根基团-o-po2-(-o-po2-)n-o-po3取代的有机分子，其中n是0-5的整数：

正如这里所应用，术语np有机应指有机聚磷酸盐,n＝磷酸根基团数。

本文所使用的术语“聚磷酸盐”指缩合磷酸盐或磷酸的聚合物，更优选选自如下所列：二磷酸盐、三磷酸盐、四磷酸盐、五磷酸盐、六磷酸盐、间-三磷酸盐、间-六磷酸盐。

具体实施方式

本发明是在共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中公开的发明的进一步开发，该发明涉及改性矿物微粒的制备方法，其中包括在一种或多种无机聚磷酸盐的水溶液中悬浮选自磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙或其混合物的某些二价或三价金属盐的矿物微粒，使所述矿物微粒改性，包括标称静电电位的显著变化和颗粒粒度的减小。

现在本发明公开了通过在制备方法中通过采用一种或多种有机聚磷酸盐的溶液(如单个有机聚磷酸盐的溶液)以类似方式生产的包含磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙的有机衍生的矿物微粒。已经发现与上面提到的共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中所公开的用无机聚磷酸盐处理相比，用有机聚磷酸盐处理所述微粒显著提高了磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒的生物分子结合性能，其中所述生物分子优选为疫苗抗原。

具体地，已经表明有机聚磷酸根离子对磷酸根离子或氢氧根离子的可能取代增加了所述微粒的ζ-电位的数值，从而增加了例如吸引生物分子(优选为抗原)的静电电位的强度，和/或增加了与所述微粒表面的结合强度。另外，如共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中所公开的，已经发现磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒中初始阴离子的取代会导致材料超结构失稳和分解。其结果是，用无机聚磷酸盐处理这种微粒导致标称颗粒粒度的减小。

现已发现，在共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中公开的改性也可以用这里公开的有机聚磷酸盐来实现，包括磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒的标称粒度减小。

但这里公开的应用有机聚磷酸盐的反应更容易控制，尤其是对于粒度减小来说，这将在本说明书的其它地方详细说明。另外，本文公开的应用有机聚磷酸盐的反应产物的热稳定性比在共同待审的国际申请pct/ep2017/076232中公开的应用无机聚磷酸盐的反应产物观察到的更高。

本发明的方法可以方便地利用商购的磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒。

因此，本发明的第一方面涉及有机衍生的矿物微粒的制备方法，包括用一种或多种有机聚磷酸盐的溶液如单个有机聚磷酸盐的溶液平衡所述矿物微粒的步骤，其中所述矿物微粒选自磷酸铝微粒、无定形羟基磷酸铝微粒、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒，和其中所述有机聚磷酸盐为选自通式1a或1b的化合物：

其中n为0-5的整数和m为2-10的整数，和其中ra代表选自腺苷和其它核苷、硫胺、碳水化合物和异戊二烯的有机取代基，和rb代表选自肌醇和其它环多醇以及碳水化合物的有机取代基。

与利用无机聚磷酸盐的类似反应相比，分别对通式1a和1b的有机聚磷酸盐与矿物微粒的反应进行研究，并且每种反应都显示出显著的优点。

具有短的缩合的聚磷酸根基团的通式1a的有机聚磷酸盐如三磷酸盐(即n＝1，这里以atp为例)似乎比类似的单磷酸盐(amp)能更好地与磷酸铝颗粒的表面羟基基团反应。不希望受理论所局限，本发明人假定atp中的磷酸酐更富含能量，并因而更亲核。atp比amp分子中有更多负电荷可能是另一个原因。

从提高颗粒的ζ-电位角度来看通式1b的有机聚磷酸盐是有利的，这也导致抗原吸附提高。对由肌醇和其它环多醇衍生的有机聚磷酸盐来说尤为如此。例如，六磷酸肌醇(ip6)在中性ph值下其形式电荷为12^-，而间-六磷酸盐(m6pi)的值为6^-。因此ip6的电荷密度比m6pi的值大100％。另外，实验还表明，ip6中的磷酰酯键比m6pi中的磷酸酐键对水解来说更稳定，这表明ip6基佐剂比m6pi基佐剂更耐高压灭菌。

在一个优选的实施方案中，一种或多种有机聚磷酸盐选自具有通式1b的化合物。在另一个优选的实施方案中，一种或多种有机聚磷酸盐选自各种异构体和/或对映体形式的肌醇和其它环多醇磷酸盐,如二磷酸肌醇(ip2)、三磷酸肌醇(ip3)、四磷酸肌醇(ip4)、五磷酸肌醇(ip5)和六磷酸肌醇(ip6)，后者也称为植酸或植酸盐(作为盐的形式)。

更优选地，一种或多种有机聚磷酸盐包括三磷酸肌醇(ip3)或六磷酸肌醇(ip6)。

最优选地，本发明涉及有机衍生的矿物微粒的制备方法，包括用六磷酸肌醇(ip6)(也称为植酸，或其盐(植酸盐)，优选为植酸钠)的溶液平衡所述矿物微粒的步骤。

在另一个优选的实施方案中，所述矿物微粒为磷酸钙微粒。

有机衍生的微粒优选具有至少0.01μm和至多1μm、优选0.1-0.5μm的标称粒度和本说明书其它地方定义的标称ζ-电位。微粒可以具有各种形状，和例如可以是球形、锥形、椭球、复杂形状、圆柱形或立方形。另外，一组微粒中的微粒可能不具有完全相同的粒度或形状。本文所用的术语“改性”指对某物的形状或性质进行微小或根本的改变或变更，优选获得所述物质的改进(改性)版本。例如，如本文所述，有机衍生的矿物微粒可以使位于初始未改性的微粒初始材料表面的磷酸根离子或氢氧根离子完全或部分被有机聚磷酸根离子取代，与用一种或多种有机聚磷酸盐的溶液平衡之前的矿物微粒初始材料相比，表面电荷发生改变、ζ-电位发生变化、生物分子结合及生物分子吸附性能发生改变和/或粒度发生改变。优选地，与用有机聚磷酸盐的溶液平衡之前的矿物微粒初始材料相比，所述表面电荷在数值上更高，所述ζ-电位在数值上更高，所述生物分子结合及生物分子吸附性能得到提高，和/或所述标称粒度减小。在优选的实施方案中，所述生物分子为抗原。另外，有机衍生的矿物微粒可具有用于在肽、蛋白质或多肽(例如生物分子)表面处螯合碱性氨基酸残基的特定结合位点，而在矿物微粒初始材料中则不存在这些位点。

在特定的实施方案中，用有机聚磷酸盐的溶液平衡所述矿物微粒改变了所述矿物微粒的标称静电电位。

如本文所用，术语“静电电位”、“电位”或“v”是指本领域技术人员理解的该术语的一般含义，尤其是指在分子附近特定位置处的带电实体(例如质子、电子或离子)的势能，并且可以定义为单位电荷(q)的能量(v＝u/q)。静电电位可以以焦耳/库仑或伏特为单位表示。静电电位可用于预测和/或计算使电荷从例如一个电势v1移动到另一电势v2所需能量。

如本文所用，术语“zeta电位”或“ζ-电位”描述悬浮在液体中的微粒的相对电荷的量度。更具体地说，ζ-电位表示距颗粒物理表面即所谓的扩散层的边界(所谓的滑动平面)一定距离的中间电位,此时离子处于颗粒表面与周围液体(如溶剂)的吸引静电场之间的平衡状态。因此，ζ-电位表示距颗粒物理表面一定距离的电位，此时所述颗粒的电荷不再干扰周围的液体。ζ-电位通常在+100mv至-100mv的范围内，并且可以通过使用zetasizernanozs(malverninstrumentsinc.)以电动力学模式，优选在25℃和/或在去离子水中测量。对于流体中的微粒，标称ζ-电位越高，就悬浮时降低的沉降趋势而言，稳定性就越高。例如，ζ-电位大于+25mv或小于-25mv的微粒通常具有高稳定性。如这里所述，通过用有机聚磷酸盐的溶液平衡所述微粒来改变矿物微粒的ζ-电位可能增加、减小、逆转和/或中和所述微粒的ζ-电位。如这里所述，标称ζ-电位的增加或减小指标称ζ电位绝对值的增加或减小，与其前面的(+)或(-)符号无关。例如，当初始标称ζ-电位为-10mv时，所述标称ζ-电位的增加可以为-15mv、-20mv、-25mv、-30mv等，而所述标称ζ-电位的减小可以为-5mv、-3mv、-1mv、0mv等。另一个例子是，当初始标称ζ-电位为+10mv时，所述标称ζ-电位的增加可以为+15mv、+25mv、+50mv、+100mv等，而上述标称ζ-电位的减小可以为+5mv、+3mv、+1mv、0mv等。任何标称ζ-电位变化为0mv也可称为ζ-电位的中和。标称ζ-电位的相反数表示电荷的变化，例如，标称ζ-电位为+10mv可以被反转为-10mv。

如这里所述，通过用聚磷酸盐的溶液(如有机聚磷酸盐的溶液)平衡矿物微粒而对所述微粒的ζ-电位进行改性的类型(如增加、减小、逆转、中和)取决于矿物微粒的类型及其初始电荷和/或ζ-电位。例如，在带正电的氢氧化铝表面处用聚磷酸根取代氢氧根，可能会导致氢氧化铝微粒的ζ-电位逆转，而当在带负电的磷酸铝或磷酸钙表面处用有机聚磷酸根取代磷酸根时，则可能会分别导致磷酸铝微粒或磷酸钙微粒的ζ-电位的绝对值增大。

在特定的实施方案中，所述矿物微粒初始材料具有：

(i)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸铝的ζ-电位为至少-20和至多-30mv，

(ii)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，氢氧化铝的ζ-电位为至少+10和至多+20mv

(iii)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸钙的ζ-电位为至少-10和至多-20mv。

在特定的实施方案中，如本文所述，用有机聚磷酸盐的溶液平衡磷酸铝和/或磷酸钙微粒增加所述微粒的静电电位强度和/或其ζ-电位的绝对值。优选地，当在蒸馏水中测量时，所述ζ-电位增加至少–20mv、至少-25mv、至少–30mv、至少–35mv、至少–40mv、至少–50mv、至少–60mv、至少–70mv、至少-80mv或至少-90mv，优选至少–40mv、至少–50mv、至少–60mv或至少-70mv，更优选至少-50mv。

在特定的实施方案中，如本文所述，用有机聚磷酸盐的溶液平衡氢氧化铝微粒消除或逆转了所述微粒的标称静电电位和/或所述微粒的标称ζ-电位。

在特定的实施方案中，如本文所述，矿物微粒的平衡导致所述微粒粒度的减小。所得到的有机衍生矿物微粒的粒度通常取决于矿物微粒初始材料的的初始粒度和平衡持续的时间。

在特定的实施方案中，当通过动态光散射(dls)或激光衍射在胶体悬浮液中测量时，所述矿物微粒初始材料的标称粒度为至少0.1μm和至多5μm。

在特定的实施方案中，本文所述方法可提供粒度为至多1μm、至多0.5μm、至多0.2μm或至多0.1μm、至多0.05μm、至多0.02μm、优选至多0.2μm的有机衍生的矿物微粒。例如，本文所述磷酸铝微粒长达40小时的平衡过程可导致初始材料颗粒的标称粒度值减小2μm，使所得的有机衍生矿物微粒的标称粒度为0.2μm。如本文所述，有机衍生的微粒可作为较小晶体的无定形聚集体或具有相同晶体粒度的较小无定形聚集体存在。

在其它特定的实施方案中，本文所述方法可提供其粒度小于初始材料颗粒粒度的有机衍生矿物微粒，例如相对于初始材料颗粒的粒度(即与矿物微粒初始材料相比),至少小约10％、或至少小约20％、或至少小约30％、或至少小约40％、或至少小约50％、或至少小约60％、或至少小约70％、或至少小约80％、或至少约小90％。

本文中使用的术语“平衡”指在特定温度下使矿物微粒如磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒与一种或多种有机聚磷酸盐的溶液接触一段时间，并允许物质和/或能量在矿物微粒和周围的一种或多种有机聚磷酸盐的溶液之间流动，直到所述微粒不再具有随时间发生进一步变化的趋势(例如ζ-电位不再变化)。假定在这个时间段内，在所述矿物微粒的表面处发生了氢氧根或正磷酸根基团与有机聚磷酸根离子的取代反应或配体交换。这种取代反应或配体交换将会持续直到达到平衡。

平衡步骤通常包括使矿物微粒与一种或多种有机聚磷酸盐的溶液混合。可用于实施混合的设备的非限定性实例包括摇动平台、旋转木马、涡流器、混合器(如螺杆、丝带或桨叶)或掺混器(如螺杆、丝带、桨叶)。另外，在将矿物微粒加入到一种或多种有机聚磷酸盐的溶液之前，可对其进行洗涤。洗涤优选在去离子水中实施。平衡的持续时间取决于矿物微粒的类型(如磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙)和/或平衡的目的(如改变所述微粒的粒度、静电电位和/或ζ-电位)，和可以为至少1分钟到至少50小时。通常，与改变粒度相比，本文所述的改变矿物微粒的静电电位和/或ζ-电位需要更短的平衡时间。优选地，用于改变矿物微粒静电电位和/或ζ-电位的平衡时间至多为1小时，而用于改变矿物微粒粒度的平衡时间为至少1小时。更优选地，用于改变矿物微粒静电电位和/或ζ-电位的平衡时间为至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少11分钟、至少12分钟、甚至更优选至少10分钟，和用于改变矿物微粒粒度的平衡时间为至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少25小时、至少30小时、至少35小时、至少40小时、至少45小时、至少50小时、甚至更优选至少40小时。在特定的实施方案中，所述平衡阶段在室温下进行。任选地，平衡阶段后可以将一种或多种有机聚磷酸盐的溶液从所得的有机衍生矿物微粒中移除，或将所得的有机衍生矿物微粒从一种或多种有机聚磷酸盐的溶液中移除。实现这种分离的方法的非限定性实例包括过滤、离心分离、光诱导介电电泳(odep)力、缓冲液交换、洗涤或本领域技术人员已知的其它技术。

在第二方面，本发明提供可通过第一方面的平衡方法获得的有机衍生矿物微粒。

由于上述化学反应、表面变化和粒度减小，由本发明方法获得的微粒难以准确、客观地描述。所测的ζ-电位在配体交换/取代反应过程中发生了很大的变化，和必须将其视为上述化学反应、表面变化和粒度减小的结果。但经验表明，按照所述程序，可重复地获得具有基本相同性能/ζ-电位的有机衍生矿物微粒。因此所述有机衍生矿物微粒最精确地描述为所述平衡方法的产品。

如上所述，假定通过与经离子键连接至金属阳离子的氢氧根离子进行配体交换而使有机聚磷酸盐与磷酸铝或磷酸钙的表面发生反应。测量到的颗粒ζ-电位的变化是颗粒物理表面和主体溶剂之间的介面(所谓的helmholtz平面)处离子吸附的直接证据。在负电荷的情况下，由于静电斥力不利于有机聚磷酸根吸附到带负电的表面上。但这里给出的实验数据表明在用有机聚磷酸盐处理后，磷酸铝的ζ-电位增加，表明有机聚磷酸根在磷酸铝颗粒上的特定吸附。另外，数据表明，在用去离子水对颗粒进行充分洗涤后，用有机聚磷酸盐处理的磷酸铝颗粒(相比于未处理的颗粒或正磷酸盐处理的颗粒)保留了其ζ-电位的增加值。数据表明有机聚磷酸根与颗粒表面强有力地结合，为配体交换的发生提供了支持证据。

因此，监测颗粒ζ-电位随时间的变化可以得到颗粒表面(helmholtz平面)处有机聚磷酸根的吸附动力学。但这种方法没有给出氢氧根离子的配体交换动力学。铝(iii)的配体交换速率是铝(iii)水合物中记录的最慢的(martinr.b.,thechemistryofaluminumasrelatedtobiologyandmedicine.clinicalchemistry,1986,32:1797-806)。但在磷酸铝的情况下，al(iii)主要与磷酸根络合，al(iii)中氢氧根的配体交换动力学是未知的。

与使用无机聚磷酸盐进行类似反应相比，预计应用光谱学直接证明配体交换更容易些，这是由于这些分子中存在碳和磷酸酯键，这将在拉曼光谱或ir等分析光谱中给出明显的特征峰，这是原始未改性的颗粒最初不存在的化学特征峰。由磷酸聚合物组成的无机聚磷酸盐显示了在磷酸铝或磷酸钙颗粒中已存在的正磷酸根的特征峰。预计用有机聚磷酸盐改性的颗粒表面的拉曼光谱与未经改性的初始颗粒的拉曼光谱不同。另外，配体交换反应释放出的氢氧根离子会导致溶液碱化，因此测量ph值随时间的变化也可以揭示配体交换的动力学。

在特定的实施方案中，本文所述的方法由商购(未改性)的磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒开始，随后对其进行改性。所述磷酸铝微粒初始材料优选为微粒，和所述未改性的(即初始材料)氢氧化铝微粒为微粒，更优选分别为2％或2％微粒。所述磷酸钙微粒初始材料优选为非羟基磷灰石微粒。在另一个特定的实施方案中，磷酸铝或磷酸钙微粒可以包含一部分羟基。在另一个特定的实施方案中，磷酸铝或磷酸钙微粒可以包含小部分其它化合物或元素，如氯化钠(例如0.8-1.0％w/w)、氯化物(例如≤0.33％w/w)、氮(例如≤0.05％w/w)、硝酸盐(例如≤100ppm)、硫酸盐(例如≤0.1％w/w)、铁(例如≤15ppm)、砷(例如≤1ppm)、重金属(例如≤20ppm)、铵(例如≤50ppm)等。

在特定的实施方案中，所述方法包括本文所述的用所述一种或多种有机聚磷酸盐的溶液平衡所述氢氧化铝、磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒的步骤，导致位于微粒表面的氢氧根离子或磷酸根离子被有机聚磷酸根离子部分或全部取代。

本文中使用的术语“取代”指固体基质中的阴离子被其它阴离子取代，也称为配体交换。由于电荷相反，阳离子和阴离子会因相互施加的库仑力而相互吸引。随着原子间距离缩短，该距离会变得足够短，以至于阴离子价电子层的电子移动到阳离子价电子层，从而形成离子键(电价)。相比之下，在氢氧化铝中，铝(al³⁺)与氢氧根(oh)以离子键结合。与共价键相反，离子键不是局部化的。当假设微粒具有简单的球形且有机聚磷酸根离子对表面单层覆盖时，有机聚磷酸根离子对磷酸铝、氢氧化铝或磷酸钙微粒的最大表面覆盖率可以为0.2-0.8％(w:w)。

这里应用的术语“表面”指如微粒、蛋白质、肽、多肽、生物分子或抗原等三维结构的外边界，其可与周围液体介质(如液体缓冲液)中的溶剂(如水)和溶质(如离子)相互作用，也称为溶剂可接触表面。本文所述的溶剂可接触矿物微粒表面可由结合等温线确定或外推。

在特定的实施方案中，本文所述的用一种或多种有机聚磷酸盐的溶液平衡所述矿物微粒增加了所述矿物微粒的生物分子结合和/或生物分子吸附容量。所述选自磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒的有机衍生矿物微粒的生物分子结合和/或生物分子吸附容量可以比选自磷酸铝、氢氧化铝或磷酸钙微粒的初始材料的生物分子结合和/或生物分子吸附性能高至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍。所述生物分子优选为抗原。

在本说明书全文中使用的术语“结合”、“相互作用”、“特异性结合”或“特异性相互作用”是指试剂实质上结合或影响一种或多种所需分子或分析物，从而排除随机或无关的其它分子，并且任选地基本上排除结构上相关的其它分子。术语“结合”、“相互作用”、“特异性结合”或“特异性相互作用”并不一定要求试剂仅与其预期靶标结合。例如，如果试剂在结合条件下对此(类)预期靶标的亲和力比其对非靶标分子的亲和力大至少约2倍，优选至少约5倍，更优选至少约大10倍，还更优选至少约25倍，仍更优选至少约50倍，甚至更优选至少约100倍，则可以说所述试剂与目标靶标特异性结合。

试剂与其预期靶标之间的结合或相互作用可以是非共价的(即通过非共价力介导，例如离子相互作用、氢桥、偶极相互作用、范德华相互作用等)。优选地，所述试剂可以与其预期靶标结合或相互作用，此结合的亲和力或结合常数(ka)为ka≥1×10⁶m^-1,更优选ka≥1×10⁷m^-1,再更优选ka≥1×10⁸m^-1,甚至更优选ka≥1×10⁹m^-1,仍更优选ka≥1×10¹⁰m^-1或ka≥1×10¹¹m^-1，其中ka＝[a_t]/[a][t]＝ka/kd，a表示试剂，t表示预期靶标，ka表示吸附速率，kd表示解吸速率。ka的测定可以通过本领域已知的方法进行，例如使用平衡透析和scatchard图分析。

为了增加生物分子吸引到微粒表面的静电电位强度(和结合强度)，改性微粒的ζ-电位的绝对值优选尽可能高。另外，由于较高表面/质量比会导致单位质量佐剂可负载更多生物分子，改性微粒的粒度位于亚微米范围内，优选在纳米范围内。所述生物分子优选为疫苗抗原。

可溶离子物质可吸附到颗粒表面的第一个通用机理是通过长程静电吸引力。这些力被认为是生物分子如抗原吸附到微粒(如佐剂微粒)表面的最关键决定因素。遵循这一机理，将会导致生物分子如抗原被困在微粒的吸引静电场即上述扩散层中，在扩散层内自由扩散，并进出主体溶剂。当生物分子接近颗粒表面时，可能会产生其它短程力，如范德华力或偶极-偶极相互作用(氢键)。溶剂效应(疏水效应)也可能强化所述机理以及生物分子与颗粒表面的总结合强度。

本发明人发现，通过在一种或多种有机聚磷酸盐的溶液(如本文所述的单个有机聚磷酸盐的溶液)中平衡所述微粒来增加磷酸铝微粒的负标称静电电位，该静电场的强度也得到增加，这反过来又增加了带相反(正)电荷的生物分子如抗原蛋白的结合能力。另外，不希望受到任何理论局限，本发明人假定在带正电的氢氧化铝表面用有机聚磷酸根取代氢氧根可以导致ζ-电位的逆转，允许吸附带正电的生物分子如抗原蛋白，而后者是通常被氢氧化铝微粒静电排斥的。

不希望受到任何理论的局限，本发明人提出，如本文所述的，生物分子例如抗原可以结合到矿物微粒表面的第二种机制是通过更具体的相互作用，包括在生物分子的蛋白表面带正电的氨基酸(优选赖氨酸和精氨酸)与在微粒(例如佐剂微粒)的表面带负电的有机磷酸根基团之间形成离子键。磷酸根基团对蛋白中带正电的氨基酸残基(尤其是赖氨酸和精氨酸)的亲和力在生物化学中有完好记载，例如蛋白激酶和磷酸酶，其中核苷酸的磷酰基团与酶催化位点的赖氨酸或精氨酸残基进行短暂的离子配对(mavrij.andvogelm.j.,ionpairformationofphosphorylatedaminoacidsandlysineandargininesidechains:atheoreticalstudy,proteinsstructurefunctionandbioinformatics,1996)。在蛋白与蛋白相互作用的某些特定情况下，已显示出这种类型的离子键可以与共价键一样强(woodsa.s.andferrés.,amazingstabilityofthearginine-phosphateelectrostaticinteraction,journalofproteomeresearch,2005)，并且该特性在某些应用中得到了利用(fokkensm.etal.,amoleculartweezerforlysineandarginine,journaloftheamericanchemicalsociety,2005；schugk.a.etal.,noncovalentbindingbetweenguanidiniumandanionicgroups:focusonbiological-andsynthetic-basedarginine/guanidiniuminteractionswithphosph[on]ateandsulf[on]ateresidues,chemicalreviews,2005)。本发明人进一步提出，在主体溶剂合适的ph值和离子强度下，这种相互作用可以发生在含磷酸盐的微粒(例如用作佐剂)如磷酸铝或磷酸钙的表面上。另外，如本文所述，在矿物微粒表面处引入有机聚磷酸根离子可以以一定方式改进这种结合机制，从而由于它们的聚合性质和构象灵活性，有机聚磷酸盐可以螯合带正电荷的氨基酸残基(优选为赖氨酸或精氨酸侧链)。结果是，生物分子如抗原的结合能力或结合强度(表现为在它们表面处的这种碱性残基)可能由于螯合作用而显著提高。有趣的是，在带正电荷的氢氧化铝的比较例中，有机聚磷酸根离子取代一些氢氧根离子可能会创造一些特定吸附带正电的生物分子如抗原的位点，否则在通常用于生物分子递送或吸附系统应用(如疫苗生产)的ph值下，由于电荷-电荷之间的相互排斥作用，预期这些带正电的生物分子与氢氧化铝的亲和性较差。

本发明的另一方面涉及选自磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒的有机衍生矿物微粒，其中位于磷酸铝或磷酸钙微粒表面的正磷酸根离子或位于氢氧化铝微粒表面的氢氧根离子被有机聚磷酸根离子部分或全部取代。

在特定的实施方案中，这里所述的有机衍生矿物微粒具有：

(i)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸铝的标称ζ-电位至少–40mv，或者

(ii)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，氢氧化铝的标称ζ-电位至少–20mv，或者

(iii)当在蒸馏水中在ph7.0下测量时，磷酸钙的标称ζ-电位至少–40mv。

在特定的实施方案中，当在蒸馏水中测量时，所述改性的磷酸铝微粒的标称ζ-电位为至少–20mv、至少-25mv、至少–30mv、至少–35mv、至少–40mv、至少–50mv、至少–60mv、至少–70mv、至少-80mv或至少-90mv，优选为至少–40mv、至少–50mv、至少–60mv、至少–70mv，更优选为至少-50mv。

在特定的实施方案中，本发明的选自磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒的有机衍生矿物微粒的标称粒度为至少0.01μm和至多2μm、至多1μm、至多0.5μm、至多0.2μm、至多0.1μm、至多0.05μm、至多0.02μm、优选至多2μm。

在特定的实施方案中，本发明的有机衍生的磷酸铝的al/p的化学计量比为1.2+/-0.15至1。

在特定的实施方案中，本发明的有机衍生的磷酸钙的ca/p的化学计量比为1.7+/-0.20至1。

在特定的实施方案中，本文所述的有机衍生矿物微粒的有机聚磷酸根离子对所述微粒的最大表面覆盖率可以为0.2-0.8％w:w。

如上所述，含矿物的佐剂，包括磷酸铝、氢氧化铝和磷酸钙，几十年来一直被成功地应用于制备疫苗，以增强对灭活、减活和亚单位抗原的免疫应答。

在特定的实施方案中，与初始材料磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒相比，本文所述的有机衍生矿物微粒具有增强的生物分子结合性能，优选地，其中所述生物分子的电荷与所述改性微粒相反，或者其中当所述改性微粒为中性时所述生物分子也为中性的。例如，有机衍生的磷酸铝微粒带负电，优选与带正电的生物分子结合。

如本文所用，术语“生物分子”是指包括通过纯化或合成而衍生自活生物体并且可能具有生物活性的成分或试剂。这些术语还涵盖诊断剂以及所谓的“药妆品”。诊断剂包括例如荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白或gfp)或放射性标记的分子。药妆品包括对个体外观(例如皮肤、头发、嘴唇和眼睛)有影响的活性成分，包括抗皱剂和改进肤色的试剂。在这些应用中，如本文所述的改性微粒优选地外部施用。活性药物成分(也称为医药产品或药物)受到特别关注，并形成生物分子的亚组。

生物分子可以包括小分子(例如分子量小于约1,500的那些)、合成的或天然的，例如单糖、二糖、三糖、寡糖、肽、核酸，但也括核酸类似物和衍生物；或大分子，包括质粒、载体、多糖、生物大分子，例如较大的肽(多肽)、蛋白、肽类似物及其衍生物、拟肽、基于核酸的分子(例如dna、rna、mrna、trna、rnai、sirna、microrna或任何其它类dna或类rna分子)、多核苷酸、寡核苷酸、酶、抗生素、由生物材料(例如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织)制成的提取物、治疗剂、预防剂、诊断剂、显像剂、适体(包括寡核苷酸或蛋白适体)。

在一个实施方案中，生物分子是水溶性的，特别是水溶性活性药物成分。此类成分可能属于生物制药分类系统(bcs)的i类或iii类，生物制药分类系统将药物分为四类：i类-高渗透性，高溶解性；ii类—高渗透性，低溶解性；iii类-低渗透性，高溶解性；iv类-低渗透性，低溶解性。水溶性药物也可以通过溶解1g化合物所需的水量(g)来规定，其中水溶性药物是满足以下溶解性标准的那些：10-30g(“可溶”)；和30-100克(“难溶”)；100-1000克(“微溶”)；1000-10000克(“极微溶”或“极难溶”)；或特别可溶、难溶和微溶的药物。

在另一个实施方案中，生物分子可以是抗体或抗体片段。术语“抗体”是指包括单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体片段包含抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括fab，fab′，f(ab′)2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。

在优选的实施方案中，生物分子可以是能够在宿主生物体中诱导免疫应答的抗原。因此，在优选的实施方案中，与初始材料磷酸铝、无定形羟基磷酸铝、氢氧化铝和/或磷酸钙微粒相比，本文所述的有机衍生矿物微粒具有增强的抗原结合性能，优选地，其中所述抗原带有与所述改性微粒相反的电荷，或者其中当所述改性微粒为中性时所述抗原也为中性的。例如，改性的磷酸铝微粒带负电，且优选与带正电的抗原结合。

术语“宿主生物”通常表示动物，优选脊椎动物，包括鸟类、人类和非人类哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、牛、马、马、绵羊、山羊、狗、猫或灵长类动物。

在特定的实施方案中，本文所述的有机衍生的矿物微粒由于它们增强的抗原结合能力，其也可以具有增强的抗原吸附容量。与现有技术相比，这些增强的抗原吸附容量有可能生产可能包含来自更多种感染剂的抗原的组合疫苗。佐剂的蛋白质吸附容量可以用多种分析方法来测量。例如，通过比较在佐剂上吸附前后在抗原溶液水相中的蛋白质含量(lindblade.,aluminumcompoundsforuseinvaccines,immunologyandcellbiology,2004,82:497-505)，或者当可获得所需抗原的特定抗体时，应用免疫沉淀技术(应用定量免疫电泳法或者应用单向辐射免疫扩散法)，可测量吸附、蛋白质吸附容量。在不使用抗体的情况下，可通过分光光度法进行检测(lindblade.,aluminumcompoundsforuseinvaccines,immunologyandcellbiology,2004,82:497-505)。

如本文所用，术语“吸附”是指其中在微粒表面与生物分子(例如抗原和/或有机分子)之间建立结合的物理吸附(例如通过范德华力)或化学吸附(例如通过共价键或离子键)。

在特定的实施方案中，选自氢氧化铝、磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒的所述有机衍生矿物微粒的生物分子结合性能比初始材料氢氧化铝、磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒的生物分子结合性能高至少1.5倍，至少2倍，至少2.5倍，至少3倍，至少3.5倍，至少4倍，至少5倍，至少5.5倍，至少6倍，优选其中所述生物分子是抗原。吸附的生物分子(例如抗原)与氢氧化铝(mg/g)、磷酸铝(mg/g)、无定形羟基磷酸铝(mg/g)或磷酸钙(mg/g)微粒的比取决于改性微粒的类型和生物分子(例如抗原)的性质的组合。例如，生物分子(例如抗原)与矿物微粒的比(mg/g)可以为至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，优选至少12。

根据本发明的选自氢氧化铝、磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒的有机衍生的矿物微粒可以具有改进的物理化学性质，即增加胶体稳定性或减少聚集，这可能是由于颗粒之间静电排斥力增加所致，和/或改进的生物分子吸附和结合，优选其中所述生物分子是抗原。

此外，本发明的另一方面是如本文所述的所述有机衍生矿物微粒在药物中的用途。

在特定的实施方案中，药物可以是人药和/或兽药。

在特定的实施方案中，本文所述的所述有机衍生矿物微粒可以用作生物分子递送或吸附系统，优选其中所述生物分子递送系统是疫苗佐剂。

在特定的实施方案中，本文所述的所述有机衍生矿物微粒可以用于疫苗中，优选用作生物分子递送系统，更优选用作疫苗佐剂。

在特定的实施方案中，本文所述的所述有机衍生矿物微粒可用于生产疫苗。

在其它特定的实施方案中，由选自氢氧化铝、磷酸铝、无定形羟基磷酸铝和/或磷酸钙微粒的初始材料制备的有机衍生矿物微粒可以用于生产疫苗佐剂或疫苗组分，和/或可以用于生产疫苗。

如本文所述的，具有与其表面结合的抗原的改性矿物微粒可用于在动物中产生抗体，例如多克隆抗体。这通过如下过程实现：将具有与其表面结合的抗原的所述矿物微粒注射到实验室或农场动物中来提高血清中抗原特异性抗体的高表达水平，然后可以从动物中回收该抗体。多克隆抗体可直接从血清中回收，而单克隆抗体则是通过将免疫小鼠的分泌抗体的脾细胞与永生性骨髓瘤细胞融合，以产生在细胞培养上清液中表达特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞系而生产。

因此，本发明的另一方面是根据本发明的有机衍生矿物微粒用于生产抗体的用途。

能够结合生物分子和/或污染物(即砷、铬、硝酸盐、钙、镭、铀、氟化物)的矿物微粒可以用作生物分子吸附系统，例如在水性和其它含离子溶液的纯化、分离和去污过程中(例如充当离子交换剂)。例如，带正电的矿物微粒可能能够结合带负电的白蛋白，因此可以用于从血液样本中去除白蛋白。在另一个例子中，带电的矿物微粒可以用于选择性富集各种样品中的酸性或碱性蛋白。在工业规模上，经常使用吸附柱(例如离子交换色谱法)进行纯化、分离和去污。

因此，本文所述的有机衍生矿物微粒可以在纯化、分离和去污过程中用作生物分子吸附系统。

在特定的实施方案中，本文所述的有机衍生矿物微粒可用于在血液分级分离过程中去除不需要的蛋白。

在以下非限定性实施例中进一步描述本发明。

实施例

实施例1

利用用六磷酸肌醇(ip6)处理的颗粒实施模型抗原鸡卵溶菌酶(hel)的吸附，并与作为对照的间-六磷酸盐(m6pi)、正磷酸盐(pi)和水进行比较。对20g/l的添加ip6或m6pi至最终浓度5mm进行处理，并将ph重新调节至ph5.0，在温和搅拌下将悬浮液放置12小时以达到平衡并确保不会发生颗粒沉降。颗粒然后用超纯水充分淋洗以脱除多余的离子，并进行高压灭菌。在实施hel吸附前，将悬浮液的ph调至7.0。

作为hel浓度的函数确定颗粒的吸附容量。由2mm的原料hel溶液进行连续稀释，并相应添加到固定体积的磷酸钙颗粒中，从而使最终浓度为10-120μm，和磷酸钙颗粒的最终浓度为4mg/ml。在室温下搅拌使混合物平衡30min，以确保颗粒不发生沉淀。吸附的hel量由颗粒沉淀后上清液中留存的量来确定。结果如图1所示。

实施例2

六磷酸肌醇(i6p)浓度对磷酸钙颗粒ζ-电位的影响。用超纯水(6μs/cm)充分淋洗磷酸钙佐剂颗粒(brenntag-biosector,denmark)，然后在室温下用各种浓度的正磷酸盐(pi)、间-六磷酸盐(m6pi)或六磷酸肌醇(ip6)处理60分钟。用zetasizernanozs(malvern,u.k.)在相应的磷酸盐的溶液中在10x稀释的淋洗颗粒的初始悬浮液中实施ζ-电位测量。结果如图2所示。

实施例3

利用用0.2mm磷酸盐处理的磷酸钙颗粒实施模型抗原鸡卵溶菌酶(hel)吸附，以确定颗粒的吸附容量随hel浓度的变化。由2mm的原料hel溶液进行连续稀释，并相应添加到固定体积的磷酸钙颗粒中，从而使最终浓度为10-120μm，和磷酸钙颗粒的最终浓度为4mg/ml。在室温下搅拌使混合物平衡30min，以确保颗粒不发生沉淀。吸附的hel量由颗粒沉淀后上清液中留存的量来确定。结果如图3所示。

实施例4

通过比较三磷酸腺苷(atp)与单磷酸腺苷(amp)和腺苷(a)，研究在上吸附的腺苷核苷酸的磷酸化程度。将浓度为1％(w/v)的调节至ph7.0，并与浓度为0.1-2.5mm的a、amp和atp的溶液混合，并在室温下搅拌平衡1小时，以避免沉淀。然后颗粒旋转减慢，并在259nm处对上清液进行吸光度测量。应用15400cm^-1m^-1的摩尔消光系数由初始浓度和吸附后最终浓度间的差计算所吸附的腺苷量。结果如图4所示。

实施例5

研究了六磷酸肌醇(ip6)浓度对颗粒ζ-电位的影响。颗粒在浓度为0.2-40mm的ip6溶液中稀释至0.1％(w:v)，将ph值调节至7.0。室温下平衡60min后，用dls(zetasizernanozs,malverninstruments)记录ζ-电位。结果如图5所示。

实施例6

通过比较三磷酸腺苷(atp)与单磷酸腺苷(amp)和腺苷(a)，研究了adju-phos和铝水凝胶对腺苷核苷酸的吸附。用5mm咪唑在ph7.0下缓冲1％(w/v)的adju-phos或铝水凝胶，并与浓度为0.2-6.0mm的a、amp和atp的溶液混合，并在室温下搅拌平衡2小时，以避免佐剂颗粒沉淀。佐剂颗粒旋转减慢，并在259nm处(腺嘌呤的最大吸光度)用分光光度计对上清液进行吸光度测量。应用腺嘌呤的15400cm^-1m^-1的摩尔消光系数由初始浓度和吸附后最终浓度间的差计算所吸附的腺苷量。结果如图7和图8所示。

实施例7

应用动态光散射法(zeta-sizer，nanoseries，malvern)测量腺苷核苷酸(atp和amp)对adju-phos静电ζ-电位的影响。在5mm咪唑中在ph7.0下缓冲0.2％(w/v)的adju-phos，并与浓度为0.2-4.0mm的atp或amp的溶液混合，并在室温下搅拌平衡2小时，以避免佐剂颗粒沉淀。将样品转移到毛细管细胞(dts1060，malvern)中，温度平衡2分钟后，在25℃下实施三次测量。结果如图9所示。

实施例8

研究了腺苷核苷酸(atp和amp)对adju-phos沉淀和床层高度的影响。在相同的ph和盐度条件下，当用聚磷酸盐处理adju-phos时，颗粒材料的堆积密度增大，导致床层高度降低。adju-phos沉淀物的堆集密度越高，佐剂颗粒越难再悬浮到主体溶剂相中，这可能成为疫苗生产商的负担。因此，监控改性adju-phos的堆积密度是下游应用的一个重要参数。

向1ml处于ph7.0的5mm咪唑缓冲液中的2％(w/v)adju-phos中，添加atp或amp的浓溶液，以达到0.2-5.0mm的最终浓度。将均质悬浮液(通过剧烈摇动)转移到塑料分光光度试管中，并静置沉淀48小时，直到在颗粒珠和上面液体之间观察到明显的相分离。作为核苷酸浓度的函数测量床层高度。在这些条件下，试管中悬浮液总体积的高度恒定和等于22mm。结果如图10和图11所示。

实施例9：磷酸钙对腺苷核苷酸的吸附

通过比较三磷酸腺苷(atp)与单磷酸腺苷(amp)和腺苷(a)，研究了磷酸钙对腺苷核苷酸的吸附。

用5mm咪唑在ph7.0下缓冲1％(w/v)的磷酸钙，并与浓度为0.2-6.0mm的a、amp和atp的溶液混合，并在室温下搅拌平衡2小时，以避免佐剂颗粒沉淀。佐剂颗粒旋转减慢，并在259nm处(腺嘌呤的最大吸光度)用分光光度计对上清液进行吸光度测量。应用腺嘌呤的15400cm^-1m^-1的摩尔消光系数由初始浓度和吸附后最终浓度间的差计算所吸附的腺苷量。结果如图12所示。

实施例10：在磷酸钙上腺苷核苷酸对静电ζ-电位的影响

用动态光散射(zeta-sizer，nano-series，malvern)测量腺苷核苷酸(atp和amp)对磷酸钙静电ζ-电位的影响。在ph7.0的5mm咪唑中缓冲0.2％(w/v)的adju-phos，并与浓度为0.2-4.0mm的atp或amp的溶液混合，在室温下搅拌平衡2小时，以避免佐剂颗粒沉淀。将样品转移到毛细管细胞(dts1060，malvern)中，温度平衡2分钟后，在25℃下实施三次测量。结果如图13所示。

实施例11:腺苷核苷酸对磷酸钙沉淀的影响

测量了腺苷核苷酸(atp和amp)对磷酸钙沉淀和床层高度的影响。在相同的ph和盐度条件下，当用聚磷酸盐处理磷酸钙时，颗粒材料的堆积密度增大，导致床层高度降低。磷酸钙沉淀物的堆集密度越高，佐剂颗粒越难再悬浮到主体溶剂相中，这可能成为疫苗生产商的负担。因此，监控改性磷酸钙的堆积密度是下游应用的一个重要参数。

向1ml处于ph7.0的5mm咪唑缓冲液中的2％(w/v)磷酸钙中，添加atp或amp的浓溶液，以达到0.5-5.0mm的最终浓度。将均质悬浮液(通过剧烈摇动)转移到塑料分光光度试管中，并静置沉淀48小时，直到在颗粒珠和上面的液体之间观察到明显的相分离。作为核苷酸浓度的函数测量床层高度。在这些条件下，试管中悬浮液总体积的高度恒定和等于22mm。结果如图14和图15所示。

实施例12：ip6在颗粒上的不可逆吸附的测试

为了测试ip6在颗粒上的不可逆吸附(例如通过配体交换)，在ph值为7.0的5mm咪唑缓冲液中用0.2mm的na-ip6处理2％w/v的adju-phos24小时。这对应于ip6的最小浓度，此时adju-phos的ζ-电位达到其最大值，以限制未被吸收的游离ip6的过量量。在ph7.0的5mm咪唑缓冲液中，连续稀释所得的adju-phoszp(用ip6改性)，以保持ph和离子强度的条件恒定。作为稀释倍数的函数记录ζ-电位，并与常规(未处理)的比较。结果如图16所示。

实施例13：atp在上的不可逆吸附测试

为了测试atp在颗粒上的不可逆吸附(例如通过配体交换)，实施类似于实施例12的实验。在ph值为7.0的5mm咪唑缓冲液中用1.0mm的atp处理2％w/v的adju-phos24小时。在ph7.0的5mm咪唑缓冲液中，连续稀释所得的用atp改性的adju-phos，以保持ph和离子强度的条件恒定。作为稀释倍数的函数记录ζ-电位，并与常规(未处理)的比较。结果如图17所示。

实施例14：ip6和atp在磷酸钙上的不可逆吸附测试

为了测试ip6或atp在磷酸钙颗粒上的不可逆吸附(例如通过配体交换)，实施类似于实施例13和14的实验。在ph值为7.0的5mm咪唑缓冲液中用0.5mm的ip6或1.0mm的atp处理2％w/v的磷酸钙24小时。在ph7.0的5mm咪唑缓冲液中，连续稀释所得的用ip6或atp改性的磷酸钙，以保持ph和离子强度的条件恒定。作为稀释倍数的函数记录ζ-电位，并与常规(未处理)的磷酸钙比较。结果如图18所示。

实施例15：adju-phos(用肌醇六磷酸钠改性的)的大规模生产方法

在反应槽中的2000l体积的纯水中使45kg磷酸铝(iii)水合盐沉淀且固定后，以5ml/min的流率和恒定的搅拌条件向悬浮液中添加50l新制备的20mm的六磷酸肌醇十二钠(na-ip6)在纯水中的溶液。添加全部体积的na-ip6溶液后，将悬浮液再搅拌两小时。从添加na-ip6溶液开始，按时间间隔测量ζ-电位，以监测植酸盐在磷酸铝颗粒上的吸附进程。通常，添加20mmna-ip6溶液后的前两小时内达到稳定的ζ-电位值。然后向悬浮液中加入5.84kgnacl，以控制离子强度以及磷酸铝颗粒的表观密度。然后将悬浮液转移到高压灭菌器罐中，其中在121℃、1.3bar压力下对用na-ip6处理的adju-phos灭菌30分钟。冷却后，悬浮液被无菌包装在塑料容器中用于运输。

实施例16：ip6-改性的与常规的的佐剂效果的比较

应用雌性balb/c小鼠和鸡卵溶菌酶(hel)作为抗原，在两个不同的模型中比较了ip6改性的与作为参照的常规和游离(非佐剂)抗原的体内佐剂效果。这个实验的灵感来自于majgaardjensen,o.etal.“ontheeffectofal(oh)3asanimmunulogicaladjuvant”apmis96,257-264(1988)。

模型1

在模型1中，皮下注射一定量hel，该量与的吸附容量非常匹配。该值可以从上面的图1得到。因此在鸡卵溶菌酶浓度为125μm下，和常规达到饱和(图1)，在该浓度下，观察到两种佐剂的吸附容量分别为1.4和0.5mghel/mgal。

对于体内试验应用两种不同剂量的佐剂：250μgal和500μgal。

根据1.4mghel/mgal的吸附容量，在模型1的设置中hel的用量如下：

·对于250μg的剂量，应用350μghel(250μg*1.4)，和

·对于500μg的剂量，应用700μghel(500μg*1.4)。

然后以三种不同的方法测试这些量350μg和700μghel：吸附在¹⁾上的、²⁾吸附在常规上的、和³⁾使用无佐剂的，即未吸附。

类似地，基于常规对0.5mghel/mgal的吸附容量，在模型2的设置中hel的用量如下：

·对于250μg的剂量，应用125μghel(250μg*0.5)，和

·对于500μg的剂量，应用250μghel(500μg*0.5)。

在模型1条件下，所应用的hel量被完全吸附，但由于常规的吸附容量较低，仅有部分被该佐剂吸附。因此对于250μg的剂量，当采用常规时，注射液将包含(350-125)μg＝225μg未结合抗原。对于500μg剂量，当使用常规时，将存在(700-250)μg＝450μg未结合抗原。对于对照组，按照定义，注射的所有hel均未结合。

模型2

在模型2中，皮下注射一定量hel，该量与常规的吸附容量非常匹配。按上面的模型1计算饱和值。再一次应用两种不同的佐剂剂量：250μg和500μgal，因此对于250μg剂量，应用125μghel(250μg*0.5)，和对500μg剂量，应用250μghel(500μg*0.5)。再次以三种不同的方法测试这些量150μg和300μg的hel：吸附在¹⁾上的、²⁾吸附在常规上的、和³⁾使用无佐剂的，即未吸附。

在模型2条件下，所应用的hel量被完全吸附，也被常规的吸附。但在这些条件下没有完全应用的全部吸附容量。这意味着注射剂量的将含有自由吸附容量，其可以表示为hel的当量量。因此，对于250μg剂量，上的自由吸附容量等于(350-125)μg＝225μghel。对于500μg剂量，上的自由吸附容量等于(700-250)μg＝450μghel。对于对照组，按照定义没有自由吸附容量。

试验：

两个模型(1或2)各包含3组试验，每组试验包括6-8只雌性balb/c小鼠。它们皮下注射200μl，其中包含以下量的抗原(“ag”)和佐剂(表示为“zp”和常规表示为“ap”)：

如上所述，在小鼠接种后21天在终末血尿后用elisa检测血清中的抗体分析抗hel抗体(ab＝igg)。观察到ag+zp组合比ag+ap组合有更高的ab响应。对于模型2，尽管注射了相同量抗原，但仍观察到ag+zp组合与比ag+ap组合有更高的ab响应，这表明在模型2的设置中上的自由吸附容量对类似剂量抗原来说可能有积极影响。

实施例17：ip6改性的磷酸钙(ip6-capo)与常规磷酸钙(capo)的佐剂效果的比较

类似于上文的实施例15实施本实验。分别在175μghel/mgca和40μghel/mgca的吸附容量下达到ip6-capo和常规capo的饱和(参见图3)。利用这些饱和值，可以类似于上面的实施例15计算要注入的以下抗原(hel)量：

对于模型1：对于以上用量，在capo上会有未结合抗原*。对于250μg的注射ca剂量，这将对应于(44-10)μg＝34μg抗原，对于500μg的注射ca剂量，未结合抗原量将为88-20＝68μg抗原。

对于模型2：对于以上用量，在ip6-capo上会有对于250μg的注射ca剂量，这将对应于44-10＝34μg抗原，对于500μg的注射ca剂量，这将对应于88-20＝68μg抗原。

测试：

按上述实施例15对两种模型(1或2)实施体内试验。

每个模型包含3个实验组，每组包括6-8只雌性balb/c小鼠。它们皮下注射200μl，其中包含以下量的抗原(“ag”)和佐剂(ip6-capo表示为“capo*”和常规磷酸钙表示为“capo”)：

如上所述，在小鼠接种后21天在终末血尿后用elisa检测血清中的抗体分析抗hel抗体(ab＝igg)。观察到ag+capo*组合比ag+capo组合有更高的ab响应。对于模型2，尽管注射了相同量的抗原，但也观察到ag+capo*组合与比ag+capo组合有更高的ab响应，这表明在模型2的设置中ip6改性的磷酸钙(ip6-capo,capo*)上的自由吸附容量对类似剂量的抗原来说可能有积极影响。