一种微生物菌肥、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，涉及一种微生物菌肥、其制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]最近几十年来，各种环境问题越来越严重的威胁人类的发展，各种工业废气、废水、化肥、农药等污染物都进入其最终宿体土壤中，因此造成土壤环境质量日益下降，尤其是土壤重金属污染，已然成为当下政府及社会共同关注的热点。
[0003]由于重金属污染土壤结构较差，养分缺乏，重金属以毒性较强的形态存在，从而影响植物生长，并且重金属离子对土壤酶活性产生抑制或激活作用，进而影响土壤养分释放以及作物对养分的吸收。镉是相对稀有的重金属元素，是典型的分散元素，主要以硫化物的形式存在于铜、铅、锌等有色金属矿藏中。人类活动可以各种途径将镉带入土壤中，且其不能或者不易被生物分解转化后排出体外，只能沿食物链逐级传递，在生物体内浓缩放大，当积累到较高含量时就会对生物体产生毒性效应，从而危害健康。有关镉污染及其生物有效性问题得以引起全世界关注，20世纪60年代在日本富士县神通川流域出现的“骨痛病”的主要原因就是镉污染。因此，土壤中镉污染来源、形态、生物有效性以及相应的治理手段的研宄十分有必要。
[0004]为治理土壤重金属污染，通常要加入各种改良剂以改善土壤的理化性质，从而降低土壤中镉的活性。除了必要的N、P、K肥料外，常用改良剂包括腐殖酸、石灰、磷矿物、铁锰氧化物、粉煤灰、活性污泥和堆肥等。这些改良剂本身可降低重金属在土壤中的活性，在植物稳定中起着重要作用，但是，也存在一些缺陷，如治理面积小、生产效率低，并且在制备过程中易造成二次污染。
[0005]近来，国内外开展了大量利用能够富集重金属的生物来清除土壤重金属污染的研宄。该方法具有高效、经济、生态协调性等优点，成为环境研宄中的热点。
[0006]CN 102553904 A公开了一种重金属污染土壤的生物修复方法，此发明利用蚯蚓来修复轻度、中度铜、镉、铅复合污染土壤，但是此发明对于蚯蚓的养殖以及植物的培养周期较长，过程复杂。CN 103880486 A公开了微生物菌肥及其制备方法和治理重金属污染土壤的方法，此发明利用蚯蚓粪制成的微生物菌肥治理土壤重金属污染。CN 1490280A公开了一种微生物多抗菌肥及其制备方法和应用，利用不同功效细菌、真菌制成的微生物多抗菌肥是一种具有营养、生物防治作用的微生物肥料，但是不针对于重金属污染的治理。
[0007]因此，在本领域需要开发一种能够有效治理土壤重金属污染的微生物菌肥。
【发明内容】
[0008]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微生物菌肥、其制备方法及其应用。
[0009]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0010]在第一个方面，本发明提供了一种微生物菌肥，所述微生物菌肥包含真菌菌种LP-20和有机肥料，其中所述真菌菌种LP-20 (Trichoderma spirale)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，100101，保藏日期为2013年8月16日，保藏编号为CGMCC N0.8038。
[0011]在本发明的微生物菌肥中，所述有机肥料包含腐殖酸、草炭土和腐熟鸡粪。
[0012]在第二个方面，本发明提供了一种本发明所述微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)对真菌菌种LP-20进行培养，得到菌悬液；
[0014](2)将步骤(I)获得的菌悬液进行浓缩得到菌体浓缩物，将所述菌体浓缩物与腐殖酸、草炭土和腐熟鸡粪混匀；
[0015](3)制粒、烘干后即得微生物菌肥。
[0016]在本发明所述微生物菌肥的制备方法中，步骤⑴所述真菌菌种LP-20的培养包括以下步骤:
[0017](a)培养皿培养:将真菌菌种LP-20在无菌条件下接种于固体培养基上，在20-30 °C、优选25°C下，培养4-6天、优选5天；
[0018](b) 一级种子培养:将步骤(a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在20-30°C、优选25°C下，培养3-7天、优选5天，制得一级种子；
[0019](c) 二级种子培养:按液体培养基的体积比为5-15%、优选8-12%、更优选10%的接种量，将所述一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养5-7天、优选5.5-6.5天、进一步优选6天，制得二级种子；
[0020](d)混合发酵培养:按液体培养基的体积比为5-20%、优选5-12%、更优选10%的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得该菌种的菌悬液。
[0021]在真菌菌种LP-20的培养中，步骤(a)所述固体培养基包括如下组分:酵母提取物l_3g/L、优选1.5g/L，醋酸钠1.5-4g/L、优选2.5g/L，琼脂13_18g/L、优选15g/L，氯霉素
0.25mg/Lo
[0022]在真菌菌种LP-20的培养中，步骤(b)所述液体培养基包括如下组分:蛋白胨8-12g/L、优选 10g/L，葡萄糖 15-25g/L、优选 20g/L，氯霉素 0.25mg/L。
[0023]在培养皿培养中，培养温度可以为20 °C、21 °C、22 °C、23 °C、24°C、25 °C、26 °C、27 °C、28°〇、29°0或30°〇;培养时间可以是4天、100小时、4.5天、120小时、5天、130小时、5.5天、140小时或6天；所用固体培养基中酵母提取物可以为lg/L、l.lg/L、l.2g/L、l.3g/L、
1.4g/L、l.5g/L、l.6g/L、l.7g/L、l.8g/L、l.9g/L、2.0g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L、2.8g/L或 3.0g/L，醋酸钠可以为 1.5g/L、l.6g/L、l.7g/L、l.8g/L、2.0g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L、2.7g/L、2.8g/L、3.0g/L,3.2g/L、3.4g/L、3.6g/L、3.8g/L、3.9g/L 或 4g/L，琼脂可以为 13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L 或 18g/L。
[0024]在一级种子培养中，培养温度可以为20 °C、21°C、22 °C、23 °C、24°C、25 °C、26 V、27°〇、28°〇、29°〇或30°〇;培养时间可以是3天、80小时、3.5天、90小时、4天、4.5天、110小时、5天、5.5天、140小时、6天、6.5天或7天；所用液体培养基中蛋白胨可以为8g/L、9g/L、10g/L、llg/L 或 12g/L，葡萄糖可以为 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L 或 25g/L。
[0025]在二级种子培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10%、11%、12%、13%、14%或15%;培养时间可以为5天、130小时、5.5天、140小时、6天、150小时、6.5天、160小时或7天。
[0026]在混合发酵培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20%。
[0027]在本发明所述微生物菌肥的制备方法中，步骤(2)中所述浓缩可以通过离心或压滤来完成，目的是脱除菌悬液中的水分得到菌体浓缩物；步骤(2)所述混合物料的质量比为0.1% -5%菌体浓缩物、10%腐殖酸、50%草炭土和35% -39.9%腐熟鸡粪；其中所述滤饼可以为 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或 5%，腐熟鸡粪可以为 35%、35.4%、35.8%、36%、36.2%、36.5%、36.8%、37%、37.4 %、37.8 %、38 %、38.3 %、38.5 %、38.7 %、38.9 %、39 %、39.2 %、39.4 %、39.6 %,39.8%或 39.
[0028]第三个方面，本发明提供了所述微生物菌肥在治理土壤重金属污染中的应用，本发明制备的微生物菌肥可用于治理土壤中镉和锌等重金属污染。
[0029]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0030]本发明的真菌菌种LP-20筛选分离自土壤，属于木霉属，具有生物安全性，含有该真菌菌种的微生物菌肥可以有效的富集土壤中游离态的镉离子和锌离子，从而降低土壤中镉和锌的活性。菌肥中的有机肥也具有重金属吸附特性，而且该有机肥料能够促进菌种LP-20对土壤中重金属的吸附作用，并且还可以提供植物生长所需的营养物质，将真菌菌种LP-20和有机肥料配合形成微生物菌肥，能够更加有效地吸附土壤中的镉和锌重金属。因此，本发明提供的微生物菌肥具有充当增产保肥的肥料和治理土壤重金属污染的天然改良剂的双重效果，是一种环境友好型、生态协调性的土壤重金属污染治理用微生物菌肥。
【附图说明】
[0031]图1是不同反应时间对LP-20吸附土壤中重金属镉和锌的效果图；
[0032]图2是不同土壤pH值对LP-20吸附土壤中重金属镉和锌的效果图；
[0033]图3是具有不同的菌种与有机肥料混合比的微生物菌肥对吸附土壤中重金属镉的效果图。
【具体实施方式】
[0034]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0035]实施例1菌肥中真菌菌种对±壤中重金属镉和锌的吸附效果
[0036]在本实施例中，通过以下方法对真菌菌种LP-20进行培养，包括以下步骤:
[0037](a)培养皿培养:将真菌菌种LP-20在无菌条件下接种于固体培养基上，25°C下培养5天；
[0038](b) 一级种子培养:将步骤(a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，250C下培养5天，制得一级种子；
[0039](c) 二级种子培养:按液体培养基的体积比为10%的接种量，将所述一级种子接种到5L发酵罐中，曝气，培养6天，制得二级种子；
[0040](d)混合发酵培养:按液体培养基的体积比为10%的接种量，将二级种子接种到发酵罐(机械搅拌)中，进行高密度