%、10%、15%、20%和25%。每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长量稳定后，才能继 续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群。
[0019] 1. 3. 3强化耐旱微生物的分离及纯化 1. 3. 3. 1稀释涂布平板法 1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏（PDA)琼脂培养 基高温灭菌，冷却至55-60°C时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液(最终质量浓度为 0.3%)，混均匀后分别倒平板。
[0020] 2)制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛 有9ml无菌水的大试管中充分混勾，此为KT1稀释液，以此类推制成10'10'10'101口 1〇_ 6几种浓度的稀释液。
[0021] 3)涂布：用移液枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平 板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
[0022] 4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马 丁氏培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养3-5 d。
[0023] 1. 3. 3. 2平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化。直到培养基上长出来的是纯种，如不纯，仍需重复该步骤，最后得到3个菌种。
[0024] 1.3. 4强化耐旱微生物的鉴定 按照试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系：10XBuffer(with MgCl2)2 乩，dNTP (10mmol/L)0.4ML，341f (l〇Mmol/L)ll^L，534r (10Mmol/L)lML，Taq 酶（5u/ML)0.4ML，模板DNA1ML，加超纯水定容至终体积20ML。PCR反应条件：94°C 5min 预变性，94°〇变性11^11，551：复性458,721：延伸458,30个循环，721：延伸10111111。引物为 34If (5r -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和534r (5' -AIT ACC GCG GCT GCT GG-3')。优势真菌的PCR反应体系： lOXBuffer (without MgCl2)2 ML，MgCl2(25mmol/L)1.6ML，dNTP(10mmol/L)0.4ML，Geoll (lOMmol/L) 0? 4ML，GeoA2 (lOMmol/L) 0? 4ML，Taq酶（5u/ML) 0? 2ML，模板DNA 1ML，加超纯 水定容至终体积20ML。PCR反应条件：94°C 4min预变性，94°C变性lmin，54°C复性lmin， 72°C延伸2min，30个循环，72°C延伸7min。引物为GeoA2(5'-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3')和Geoll (5' -ACC ITG TTA CTT TTA CTT CC-3'）。将得到的PCR产物送到 北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。
[0025] 将分离出的菌种通过对其菌落形态观察，结合分子鉴定结果（PCR序列相似度）比 较，鉴定出分别为：蜡样芽孢杆菌、粘红酵母和赖氨酸芽孢杆菌。
[0026] 表1强化耐旱微生物鉴定结果
【主权项】
1. 一种采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高草坪草抗旱性的方法，其特征在于按如下 的步骤进行： (1) 制备中度干旱胁迫：60%~40%，重度干旱胁迫：40%~20%，土壤和30-35nm纳米堆肥 按59 :1的比例混合并加入15ml强化耐旱微生物菌剂；所述的强化耐旱微生物菌剂指的 是：蜡样芽孢杆菌：赖氨酸芽孢杆菌：粘红酵母按体积比1:1:1的配制；所述的强化耐旱 微生物菌剂采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法，在强化过程中，视0D_增长而逐步提 高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以5%的梯度增加，最终目标是25% ; (2) 以灭菌后的土壤为基质进行草坪植物栽培试验，纳米堆肥采用混施的方式施入土 壤基质，实验时基质用量为9400gnT2,草皮基质厚度为15mm，高羊茅草种播种量为160gnT2， 将种子浸泡24h后均匀播洒于基质表层，首先进行黑暗处理，萌发后植株生长初期，每天统 一定量给水，以保持培养基质水分状况良好，生长第IOd时分别浇入15ml强化耐旱微生物 菌剂，生长15d后进行干旱胁迫，按照胁迫程度进行称重浇水，以维持在胁迫范围内，干旱 胁迫持续25d后取样，进行生理生态指标测定，实验期间光照强度为400-600 ymol.nT2.s' 室内的相对湿度为50-55%，温度为20-23°C，最后将草坪植物齐基质刈割，测量地上鲜重， 根部用蒸馏水冲洗干净，置于烘箱中l〇5°C条件下杀青30min，8(TC烘干至恒重，测量地上 和地下干重。
2. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高草坪草抗旱性的方法，其中： (1) 纳米堆肥的制备：将生活垃圾堆肥105°C烘干至恒重，将垃圾堆肥加工研磨制成 3〇-35nm纳米堆肥，备用； (2) 草皮基质组配与强化微生物联合纳米堆肥应用： 中度干旱胁迫：60%~40%，重度干旱胁迫：40%~20%，每个胁迫设3个处理，4次重复，两个 胁迫所设处理相同，分别为： 1) 以100% 土壤为对照基质并加入15ml空白培养基 2) 土壤和纳米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml空白培养基 3) 土壤和纳米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml强化耐旱微生物菌剂 (3) 以灭菌后的土壤为基质进行草坪植物栽培试验，纳米堆肥采用混施的方式施入土 壤基质，实验时基质用量为9400gnT2,草皮基质厚度为15mm，高羊茅草种播种量为160gnT2， 将种子浸泡24h后均匀播洒于基质表层，首先进行黑暗处理，萌发后植株生长初期，每天统 一定量给水，以保持培养基质水分状况良好，生长第IOd时分别浇入15ml灭菌后的空白培 养基和强化耐旱微生物菌剂，生长15d后进行干旱胁迫，按照胁迫程度进行称重浇水，以维 持在胁迫范围内，干旱胁迫持续25d后取样，进行生理生态指标测定，实验期间光照强度为 400-600ymol.m_2.s'室内的相对湿度为50-55%，温度为20-23°C，最后将草坪植物齐基质 刈割，测量地上鲜重，根部用蒸馏水冲洗干净，置于烘箱中l〇5°C条件下杀青30min，80°C 烘干至恒重，测量地上和地下干重。
3. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高草坪草抗旱性的方法其中： PEG6000的浓度分别为5%、10%、15%、20%和25%，每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长 量稳定后，才能继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群。
4. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高草坪草抗旱性的方法在增强 高羊茅逆境下的适应能力方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高草坪草抗旱性的方法。它是从生活垃圾堆肥中通过分离提取出合适的有益微生物菌株，通过耐旱强化获得更为高效的微生物菌剂，将其与纳米堆肥联合施用于草坪基质，研究其对干旱胁迫下草坪植物的耐旱性，为纳米堆肥联合微生物菌剂在草坪草抗旱性方面的应用提供依据。实验结果表明：在干旱胁迫下，纳米堆肥联合微生物有助于高羊茅的生长，提高叶片保护酶活性，增强植株对干旱胁迫的适应能力，中度胁迫和重度胁迫时，节水率分别为43.10%和52.39%。
【IPC分类】C05G3-00
【公开号】CN104844346
【申请号】CN201510186594
【发明人】多立安, 赵树兰, 刘春湘
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月20日