水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶基因、蛋白及其应用的制作方法

专利名称：水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶基因、蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学与基因工程领域，更具体地，本发明涉及水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶基因、其蛋白产物及其应用。谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathioneperoxidase,PHGPx)可直接还原磷脂氢过氧化物，从而有效地保护细胞膜免受氢过氧化物的损伤，是目前发现的唯一一个能还原磷脂氢过氧化物的重要抗氧化酶(Fulvio Ursini等人，Biochimica etBiophysica Acta 839(1985)62-70；Regina Brigelius-Flohe等人，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)269(1994)7342-7348.；Kunio Yagi等人，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical andBiophysical Research Communications)219(1996)486-491)。
众所周知，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)在哺乳动物体内广泛存在，其主要作用是清除H2O2和许多有机氢过氧化物，其作用过程是GPx使H2O2还原为H2O，或使许多有机氢过氧化物(ROOH)还原为相应的醇(ROH)，只是在催化反应中需要还原型谷胱甘肽作为氢供体，而起重要作用的活性部位位于其序列的硒代半胱氨酸(SeCys)上(L.Flohé等人，酶学方法(MethodsEnzymol.)105(1984)114-121)。机体内过量的氧自由基如羟自由基可诱发脂类过氧化，除了直接造成生物膜损伤外，还可通过脂类氢过氧化物与蛋白质(包括酶)或核酸反应，使机体组织发生广泛性损伤(C.H.Foyer等人，植物、细胞和环境(Plant,Cell and Environment)17(1994)507-523.)。GPx具有清除脂类氢过氧化物的能力，可以有效地使脂类氢过氧化物对机体的损伤得以减轻(L.Flohé等人，文献同上)。但是细胞膜上磷脂的过氧化是造成细胞瓦解的最初也是最根本的原因之一，而GPx却不能还原细胞膜上的磷脂氢过氧化物，说明生物体内肯定存在另一种行使这一功能的重要的酶。
1982年Ursini从鼠和猪的不同器官中分离纯化出一种“过氧化作用抑制蛋白”，该蛋白能直接保护生物膜上磷脂免受过氧化损伤，并发现该蛋白是一种含硒酶，在谷胱甘肽的存在下能特异性地还原膜上的磷脂过氧化物，故将其命名为谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶。
PHGPx与GPx在构成亚基数、还原底物特异性、保护生物膜以及激素调控等方面有着明显区别(F.Ursini等人，酶学方法252(1995)38-53)。在构成上PHGPx是单亚基蛋白，而GPx是四聚体蛋白。在还原底物的特异性上，PHGPx能还原多种磷脂氢过氧化物尤其是能直接还原磷脂和胆固醇的氢过氧化物，且对H2O2活性低；而GPx能还原H2O2、有机氢过氧化物和游离脂肪酸氢过氧化物，但不能还原磷脂氢过氧化物，对H2O2活性高。这就决定了它们在保护细胞膜方面的功能不同。PHGPx能直接降解脂类过氧化物，哪怕是那些嵌在生物膜上的复杂脂类，而GPx只能与磷脂酶协同作用来阻止脂类的过氧化。因此PHGPx被认为是保护生物膜免受氧化破坏的主要途径，而GPx则被认为是在保护膜免受可溶性氢过氧化物的破坏中起作用，或在生物膜的修复过程中与磷脂酶协同作用。另一显著的区别是PHGPx基因的5’不翻译区和第一个内含子中包含有许多受激素调控的调节元件，如雌激素、黄体酮和糖皮质激素反应元件等，而GPx均不具有激素依赖性。
上述结果是对哺乳动物PHGPx研究所取得的，而对植物PHGPx的研究，时至1995年，以色列人才从培养的柑桔细胞中部分纯化出盐胁迫相关蛋白，测得其分子量约为22,000Da，并具有对卵磷脂氢过氧化物的催化活性，这是第一个也是唯一一个得到证实的植物PHGPx(Talia Beeor-Tzahar等人，FEBS通信366(1995)151-155)。
本发明的一个目的在于提供水稻PHGPx基因及其蛋白序列。
本发明的第二个目的在于提供水稻PHGPx基因及其蛋白质在制备抗衰老的生物细胞及个体中的应用。
本发明人将先进的RACE-PCR技术应用于水稻PHGPx基因的克隆，并成功地克隆出水稻PHGPx的全长cDNA，实现了本发明的目的。因此，本发明的一个方面涉及水稻PHGPx的全长cDNA，其长度为921bp，具有SEQ ID NO:1中所示的DNA序列，其中的507bpORF编码169个氨基酸残基，3’和5’的非编码区分别为344bp和70bp，其多腺苷化信号AAUAUA位于终止密码子下游95bp处。本发明还涉及由所述的水稻PHGPx的全长cDNA序列推导的蛋白质序列，其具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，本发明的水稻PHGPx是含有169个氨基酸的多肽，其理论分子量为19,234Da。
本发明的水稻PHGPx基因可插入表达载体进行表达，因此，本发明的另一方面涉及能在宿主细胞中表达水稻PHGPx基因的表达载体，所述的表达载体可以是用于在细菌如大肠杆菌中表达的载体，也可以是用于在植物特别是水稻中表达的载体。如下文实施例所述，本发明人已使水稻PHGPx基因成功地在大肠杆菌中获得高效表达，经用过氧化氢处理表达PHGPx的细胞，与对照相比成活率显著提高，在10μg/ml的浓度处理2小时其成活率是对照的2.5倍。显示表达蛋白具有抵抗氧化、清除氧自由基的活性，表明该蛋白可应用于植物转基因工程，来制备提高抗衰老的生物细胞及个体。
以下将参照附图以实施例描述本发明，应理解的是实施例仅举例描述本发明，而非限制本发明。


图1示出本发明的的水稻PHGPx与其它动植物PHGPx的氨基酸序列同源性比较，图中RI、CI、SP、TB、TM、HU和PO分别代表水稻、柑桔、菠菜、烟草、番茄、人和猪的PHGPx的氨基酸序列。
图2示出本发明的PHGPx在大肠杆菌中表达的策略。
图3A示出如实施例5所示本发明的水稻PHGPx在大肠杆菌中的表达，图3B示出重组蛋白的纯化，图中，M为蛋白质分子量标准，泳道1-6为筛选到的6个表达克隆，泳道7为Ni-NTA树脂亲和层析纯化得到的重组蛋白。
图4示出用于在水稻中表达PHGPx的植物表达载体pUBIBIAPHGPx的构建策略。
实施例1 带有双接头的水稻苗cDNA文库的构建将水稻栽培品种中丹2号(购自中国农业科学院作物研究所)在温室自然光下培养至3叶期，收集叶片，采用Promega公司的PolyATtractSystem 1000提取mRNA，用Clontech的MarathonTMcDNA扩增试剂盒合成cDNA，再连上接头，构建成两端带有接头的水稻苗cDNA文库。1．水稻mRNA的提取用Promega公司PolyATtractSystem 1000提取水稻叶片的mRNA，具体操作步骤如下1)称取中丹2号3叶期叶片0.5克，在液氮中充分研磨，将研磨后的粉末移至50ml离心管中，立即加入2ml抽提缓冲液，用匀浆器充分匀浆后加入4ml预热至70℃的稀释缓冲液，颠倒混匀。
2)加入5μl生物素化的寡聚(dT)核苷酸探针，摇匀后于70℃温浴5min。
3)移至50ml离心管中，室温下12,000rpm离心10min。
4)离心终止后小心将上清移入含有2ml SA-PMPs磁球的锥形管中，上下颠倒混匀，室温放置2min后，用磁铁吸附SA-PMPs磁球，直至溶液澄清，并小心弃去上清。
5)用2ml SSC(0.5×)重悬颗粒，并将悬浮液移至该试剂盒配备的mRNA User管中，用磁铁再次吸附SA-PMPs磁球颗粒，小心吸去SSC溶液。重复洗涤2次。
6)加入2ml无RNase的超纯水，混匀，然后用磁铁吸附磁球颗粒，
直至溶液澄清。
7)将含有mRNA的上清转移至一新管中，加1/10体积3M NaAc(PH5.0)和等体积异丙醇，混匀后-20℃放置过夜。
8)4℃12,000rpm离心10min，弃去上清，用70％乙醇离心洗涤沉淀。
9)真空干燥沉淀15分钟左右，用适量体积的超纯水悬浮沉淀使终浓度为0.5～1.0μg/μl,-70℃保存备用。2.cDNA文库的构建根据Clontech公司MarathonTMcDNA扩增试剂盒的操作程序，先以水稻mRNA为模板反转录成第一链cDNA，然后以第一链cDNA为模板合成第二链，再将双链cDNA两头连上接头构成两端带有接头的cDNA文库，具体操作步骤如下1)在0.5ml微量离心管中加入下列反应物RNA样品(polyA+)(1μg) 4μlcDNA合成引物(10μM)1μl5×第一链缓冲液2μldNTP混合物(10mM) 1μlAMV反转录酶(20μ/μl) 1μl加水将总体积补足10μl。
其中cDNA合成引物的序列为5’-TTCTAGAATTCAGCGGCGC(T)30N-1N-3’。
2)轻轻吹打混匀并稍加离心后，于42℃空气浴1小时以合成cDNA。然后将反应管放置在冰上以中止第一链合成反应。
3)在第一链反应管中加入下列反应物ddH2O 48.4μl第二链缓冲液(5×) 16μl
dNTP混合物(10mM) 6μl第二链酶混合液(20×) 4μl总体积80μl，混匀后16℃温浴1.5小时。
4)加入2μl(10单位)T4 DNA聚合酶，混匀后16℃反应45分钟。
5)加4μl EDTA/Glycogen混合液以终止第二链合成反应。
6)加入100μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合后14,000rpm离心10min。
7)将上层水相移入新管中，加入100μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，振荡混匀后14,000rpm离心10min。
8)将上层水相移入新管中，加入1/2体积的4M醋酸铵和2.5倍体积乙醇，混匀后14,000rpm室温离心20min以沉淀合成的双链cDNA。
9)用300μl80％乙醇离心洗涤沉淀，空气中干燥10min后，用10μ无菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。3．接头连接按Clontech公司的操作程序，将Marathon cDNA接头连接至上述合成的双链cDNA的两端，具体步骤如下1)在0.5ml微量离心管中加入下列反应物双链cDNA5μlMarathon cDNA接头(10μM)2μl5×DNA连接缓冲液2μlT4 DNA连接酶(1unit/μl)1μl总体积为10μl，混匀后16℃连接过夜。
其中Marathon cDNA接头的序列为5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’3’-H2N-CCCGTCCA-PO4-5’。
2)70℃处理5分钟灭活连接酶后，-20℃保存备用。
3)用琼脂糖凝胶电泳检测双链cDNA的浓度及质量，结果为2μl样品电泳后的带的总量约0.5μg，估算所得双链cDNA的浓度约0.25μg/μl。至此，已构建成了一个两端含有接头的水稻苗双链cDNA文库。实施例2 用RACE-PCR扩增全长水稻PHGPx基因根据动植物PHGPx中高度保守的一段氨基酸序列VNVASQCG(Yuval Eshdat等人，植物生理学(Physiologia Plantarum)100(1997)234-240；M.Shure等人，细胞(1983)35:225-233)以及水稻所偏爱的密码子合成了一套适合克隆水稻PHGPx基因的23nt的简并引物用于3’RACE-PCR扩增，然后再根据3’RACE-PCR产物的核苷酸序列，合成引物进行5’RACE-PCR，最后进行首尾(end-to-end)PCR，扩增出全长水稻PHGPx基因。1.3’RACE-PCR扩增水稻PHGPx基因的3’端根据氨基酸保守序列由赛百盛公司合成了用于3’RACE-PCR的5’端引物RP2，其序列为5’-GT(AGCT)AA(CT)GT(AGCT)GC(AGCT)(AT)(GC)(AGCT)CA(AG)TG(TC)GG-3’。用Clontech公司的MarathonTMcDNA扩增试剂盒进行3’RACE-PCR扩增，其具体步骤如下1)将下列反应物加入0.5ml PCR反应管中10×PCR缓冲液5μlMgCl2(25mM) 5μldNTPs(10mM) 1μlEx Taq(2.5μ/μl)1μl水稻cDNA(约0.2ng/l) 5μl合成引物RP2(20pmol/μl) 1μl接头引物AP2(20pmol/μl) 1μl
ddH2O31μl总体积为50μl。
其中接头引物AP2的序列为5’-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3’。
混匀后，按下列程序进行PCR扩增94℃ 30s；94℃ 5s；72℃2.5min(5个循环)；94℃ 5s；70℃2.5min(5个循环)；94℃ 5s；68℃2.5min(20个循环)。
2)3’RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果呈现两条带，一条分子量稍大，约750bp，另一条分子量较小，约650bp。
3)将PCR产物用Promega公司的WizardPCR扩增DNA纯化试剂盒分离纯化后，分别克隆进Takaka公司的pMD18T-Vector上，经转化大肠杆菌JM109，筛选出单克隆，将插入较大片段的命名为pM3RB6，较小片段的为pM3RS10。
4)将pM3RB6交Takaka公司用末端终止法进行双向测序，其结果表明该片段长为740bp，其所含编码区编码132个氨基酸，与已知的动植物PHGPx蛋白的C端具有较高的同源性。可以认为该片段是水稻中存在的PHGPx基因的3’端部分。
2、5’RACE-PCR扩增水稻PHGPx基因的5’端根据用3’RACE-PCR扩增出的水稻PHGPx基因3’端的序列，合成了用于5’RACE-PCR的3’端引物RP1，其序列为5’-AGGGACTGGTCGCAGTCGAGTATCT-3’。5’RACE-PCR的具体操作步骤除引物不同，即采用上述合成引物RP1和接头引物AP1(序列为5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)外，均与3’RACE-PCR步骤相同。将PCR产物走琼脂糖凝胶电泳，结果显示一条约550bp的带，该片段经Promega公司的WizardPCR扩增DNA纯化试剂盒纯化后插入Takaka公司的pMD18-T载体转化大肠杆菌JM109，筛选出单克隆并命名为pM5R18。由Takara公司采用末端终止法双向测序，结果读出了539bp的序列，其中最长的阅读框架编码156个氨基酸。该序列的3’端与pM3RB6插入片段的5’端有357bp是重叠的，表明该片段中含有水稻PHGPx基因的5’端部分。若将3’RACE-PCR所扩片段与5’RACE-PCR所扩片段拼接起来，则完整的阅读框架编码169个氨基酸，与动物PHGPx基因所编码氨基酸数目一致，表明已获得全长阅读框架的水稻PHGPx基因。3．全长PHGPx基因cDNA的获得根据5’RACE-PCR所扩出的水稻PHGPx基因5’端部分序列，合成了20个核苷酸的寡聚引物，其序列为5’-GGGAGAGGGATTTCGATTTT-3’，以Clontech公司MarathonTM cDNA合成引物为3’引物，对水稻双链cDNA文库进行常规PCR扩增，以获得完整的PHGPx基因cDNA克隆。其PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示单一条带，大小约为900bp。进而按常规实验方法将该片段克隆进pMD18-T载体，并测定了全长DNA序列。结果读出了921bp，其中的507bp ORF编码169个氨基酸残基，3’和5’的非编码区分别为344bp和70bp，其多腺苷化信号AAUAUA位于终止密码子下游95bp处。结果表明获得了全长的PHGPx基因的cDNA序列，将该基因命名为ricPHGPx。实施例3 水稻PHGPx全长cDNA序列及其特征根据上述结果，将全长921bp的cDNA序列进行了特征序列分析和同源性比较，并采用Southern和Northern杂交法分析了该基因在基因组中的存在形式和组织特异性表达特征。1．全长cDNA序列及其同源性分析用RACE-PCR克隆出的ricPHGPx全长cDNA为921bp，阅读框架编码含有169个氨基酸的多肽，其理论分子量为19,234Da。根据同源序列比较，其氨基酸序列与人睾丸(R.Steven Esworthy等人，Gene(1994),144:317-318.)和猪心(Regina Brigelius-Flohe等人，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)269(1994)7342-7348)PHGPx分别有50％和49％的同源性，与植物中的柑桔(DoronHolland等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)(1993)21:923-927)、菠菜(Manabu Sugimoto等人，生物科学生物技术生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)61(1997)1379-1381)、烟草(M.C.Criqui等人，植物分子生物学18(1992)623-627)和番茄(D.Nathalie等人，欧洲生物化学杂志(European Journal of Biochemistry)253(1998)455-451)PHGPx的同源性分别为63％,63％,62％和63％(图1)。哺乳动物PHGPx活性中心的催化残基是硒代半胱氨酸(SeCys)，由终止密码子UGA所编码，而水稻PHGPx的活性中心是由位于第44位的半胱氨酸构成，其密码子为UGU，这与其它植物(柑桔Cys-41，菠菜Cys-44，烟草Cys-43，番茄Cys-43)中的情形相似。这些结果进一步表明该cDNA编码一个新的植物PHGPx基因。
此外，通过查询Prosite数据库(A.Bairoch等人，核酸研究(增刊)(Nucleic Acids Research(Suppl))1991 2241-2245)发现，ricPHGPx中存在两个Asn糖基化位点(分别位于氨基酸残基50-53,134-137处)，一个PKC磷酸化位点(位于氨基酸残基16-18处)，三个CK2磷酸化位点(分别位于氨基酸残基6-9,11-14,16-19处)和两个十四烷基化位点(分别位于氨基酸残基2-7,125-130处)。2.PHGPx基因在水稻基因组中的存在形式从中丹2号的4周龄水稻叶片中根据尿素-苯酚方法(M.Shure等人，细胞35(1983)225-233)提取基因组DNA。用PHGPx基因内部没有切割位点的限制性内切酶SalⅠ,HindⅢ,BglⅡ和ApaⅠ分别酶解10μg基因组DNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离后，将DNA转至尼龙膜Hybond-N+上。按常规方法(J.Sambrook等人，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，将该膜在65℃下预杂交(预杂交液5×SSC,5×Denhardt’s,0.5％SDS,0.1mg/ml鲑鱼精DNA)1小时后，加入用随机引物标记法由[α-32P]dCTP标记的PHGPx cDNA探针，于65℃杂交12小时。杂交后用含有0.1％SDS和2×SSC的洗膜液在室温下漂洗10分钟；然后再用0.1％SDS,0.2×SSC的洗膜液于65℃洗膜两次，每次30分钟；最后再用0.1％SDS,0.2×SSC的洗膜液于65℃洗膜30分钟，膜晾干后加X光片于-80℃放射自显影。
根据放射自显影的结果，在高度严谨条件下上述4种内切酶的酶解产物杂交后均显示一条带。与DNA的标准分子量片段相比，SalⅠ片段约为14kb,HindⅢ、BglⅡ和ApaⅠ分别为2.2kb、4.5kb和9.0kb。这一结果表明PHGPx基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在，这一结果与其它植物PHGPx基因的情况是一致的。据已有的报道，番茄PHGPx是单拷贝基因(D.Nathalie等人，文献同上)，烟草PHGPx基因最多只有两个拷贝(M.C.Criqui等人，文献同上)，向日葵PHGPx基因有1-2个拷贝(P.Roeckel-Drevet等人，植物生理学(Physiologiaplantarum)103(1998)385-394)。3.PGHPx基因在水稻组织中的特异性表达用苯酚-SDS法(R.D.Palmiter等人，生物化学杂志(Journal ofBiochemistry)13(1974)3606-3610)分别从10天龄水稻幼苗及开花后10天的成熟水稻的不同组织提取总RNA，经1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离后，用碱固定法(J.Liu等人，植物分子生物学29(1995)685-689)将RNA(各20μg)转移至尼龙膜Hybond-N+上，将该膜在预杂交液(1％SDS,1MnaCl,10％硫酸葡聚糖，0.1mg/ml鲑鱼精DNA)中，65℃预杂交1小时，加入与上述Southern杂交相同的cDNA探针，在65℃下杂交12小时，洗膜条件及放射自显影操作也与上述Southern杂交条件相同。
杂交结果显示，在开花后10天的成熟植株的不同组织中，旗叶中PHGPx的转录水平最高，茎中次之，而根和种子中的含量则较低，10天龄的水稻幼苗中PHGPx的转录水平约为旗叶中的一半。根据25S和17S rRNA的位置，可以计算出所得杂交带的长度约为1000碱基，与PHGPx的cDNA全长相当。
上述结果表明PHGPx mRNA在成熟组织中的分布具有明显的组织特异性。旗叶中水平最高，茎部次之，而根和种子中则很低，这一分布恰好与植物体内氧自由基的分布规律相一致(C.Jacyn Baker等人，植物病理学年度综述1995,33:299-321)。植物体内氧自由基主要来源于光合作用过程中的光合电子传递链，光合作用强的组织(如绿色叶片，尤其是旗叶)中氧自由基含量很高，而几乎不进行光合作用的根和种子中氧自由基的含量则较低，本研究所发现的正常生长的水稻中旗叶中的PHGPx表达量最高，预示着PHGPx可能在消除植物体内的氧自由基方面起着重要作用。实施例4 氧化胁迫诱导ricPHGPx基因在水稻中的高效表达为了探讨ricPHGPx的功能，本发明首先用H2O2和Al3+处理两周龄的水稻苗，然后提取总RNA，进行Northern杂交，检测ricPHGPx的表达量来评价ricPHGPx基因对抗氧化胁迫的活性。在H2O2处理实验中，剪取两周龄水稻的苗部，浸泡在含有10mM H2O2和1％吐温20的水溶液(为了减少H2O2分解所造成的误差，每隔2小时更换一次浸泡液)中，分别在零时刻(浸泡前)和浸泡3,6,12,24,48小时后取样，而在AlCl3处理实验中，待水稻长至2周龄时，向培养液中加入AlCl3溶液至Al3+终浓度为50μM，同样分别在零时刻(加入Al3+前)和加入Al3+后3,6,12,24,48小时后剪取水稻的苗部。对上述样品用苯酚-SDS法提取总RNA，采用与上述研究组织分布相同的方法，进行探针标记和Northern杂交。各总RNA的样品用量均为10μg。
Northern杂交结果显示，正常生长的水稻幼苗组织中ricPHGPx表达量较低，用H2O2及Al3+处理后，其表达量显著上升。H2O2浸泡3小时后已能观察到ricPHGPx含量的变化，在所取样品的48小时内一直保持上升趋势，在48小时时其表达量已达到处理前的31倍。用Al3+处理后ricPHGPx mRNA的水平明显上升，3小时后达到项峰，约为处理前的5倍，随后开始缓慢下降，至48小时后仍高于正常水平。
上述杂交结果表明H2O2能诱导水稻幼苗中ricPHGPx表达量的上升，并且这种诱导随着氧化胁迫的存在能持续较长时间，在48小时内一直保持上升趋势，暗示着ricPHGPx量的提高可能贡献于清除由于氧化胁迫而诱导产生的自由基。另一方面Al能和抑制植物根系生长，对Al毒性产生的机制之一可能是通过脂类过氧化反应在植物体内诱导产生氧化胁迫而对植物产生伤害(K.D.Richards等人，植物生理学(Plant Physiology)116(1998)409-418)。本发明发现水稻PHGPx的mRNA水平在Al处理3小时后上升至正常水平的5倍，而后缓慢下降，说明为了对付Al所诱发的氧化胁迫，水稻体内的PHGPx表达量增加，而后的缓慢下降可能是由于水稻体内的金属硫蛋白等金属结合蛋白的表达量上升从而部分缓解了Al毒性所致(K.D.Richards等人，文献同上；L.H.Yu等人，基因206(1998)29-35)。
上述结果充分说明PHGPx在缓解水稻氧化胁迫中起着重要作用。实施例5 ricPHGPx在大肠杆菌中的高效表达及其抗H2O2活性为了表明ricPHGPx基因的功能，本发明将ricPHGPx基因插入Qiagen公司的pQE30的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，并转化大肠杆菌M15，获得了高效表达，用H2O2处理表达ricPHGPx的细胞，在10μg/ml H2O2的浓度下，其细胞存活率是对照细胞的2.5倍，显示出该基因的表达产物能提高细胞对H2O2的抗性，从而一定在清除氧自由基方面起着非常重要的作用。1、ricPHGPx在大肠杆菌中的高效表达如图2所示，将ricPHGPx插入Qiagen公司的pQE-30高效表达载体的多克隆位点来表达ricPHGPx基因。利用pQE-30表达载体可以表达出在其产物的5’端附加6个连续组氨酸的融合蛋白，这6个连续的组氨酸构成了Ni-NTA凝胶特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。为了保证表达蛋白与原蛋白在氨基酸序列上的一致性，本发明人在ricPHGPx基因的5’端与6个His序列间设计了一段肠肽酶(Enterokinase)识别位点的碱基序列，该序列编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，肠肽酶可识别此位点，并在Lys后面将肽链切断，这样表达出的基因产物可与原编码氨基酸序列一致。按照图2所示的技术路线，合成一对引物，按分子克隆常规实验程序(Sambrook等，文献同上)用PCR扩增出两端带有特定位点的基因序列，连接进pQE-30载体的BamHⅠ和HindⅢ之间，构建成带有ricPHGPx基因的表达载体，命名为pRPHGPl，并通过DNA序列分析，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。接着将该载体转化大肠杆菌M15菌株，并用含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB平板筛选重组子，将筛出的重组子经质粒酶切鉴定和PCR鉴定后，用于诱导表达分析。
将筛选并经鉴定确认的重组子，接种于5ml LB培养基中，37℃培养过夜，然后按1∶10比例接种到4ml LB培养液中，37℃继续培养至A600=0.6～0.9，加入8μl 1M的IPTG溶液(IPTG终浓度为2mM)，诱导3小时后取1ml菌液离心收集菌体，按Qiagen提供的方法提取细胞可溶性蛋白，进行12.5％SDS-PAGE电泳检测，结果如图3A所示，所有筛选的6个克隆均有ricPHGPx基因的高效表达，经凝胶扫描分析，重组蛋白的表达量约占细胞总可溶性蛋白的36.42％。另一方面根据Qiagen提供的少量纯化法提取ricPHGPx蛋白，如图3B所示亲和层析纯化出单一电泳带，根据标准分子量标记的所作出的标准曲线，计算重组蛋白表观分子量为22.35kD，略大于理论值19.23kD，说明ricPHGPx中的确存在着蛋白质修饰反应。2．表达ricPHGPx基因昀劂干菌细胞具有抗H2O2活性过氧化氢在一定浓度下对大肠杆菌有致死作用。为了测定转入水稻PHGPx基因的大肠杆菌对H2O2的抗性，本发明将ricPHGPx克隆进pQE30，构成pRPHGP质粒，并将该质粒转化大肠杆菌JM109，并命名为JP6菌株，同时将空白质粒pQE30转化JM109，作为对照，命名为JC6菌株。然后将培养过夜的JP6和JC6菌液按1∶100接种于新鲜LB培养液，37℃200rpm培养至A600=0.2后分别加入H2O2溶液至终浓度分别为0,5,10,20,50,100μg/ml，继续培养2小时后，取100μl菌液进行适当稀释后布LB平板，平板于37℃培养16小时后取出进行菌落计数，以计算细菌的存活率。存活率按下列公式计算 结果如表1所示。在H2O2浓度为20μg/ml时，含有ricPHGPx基因的大肠杆菌的存活率是对照的近4倍，充分表明ricPHGPx基因的存在可以明显提高该菌株对H2O2的抗性。
表1 表达与不表达水稻PHGPx的大肠杆菌对H2O2抗性的差异
实施例6 含有水稻PHGPx基因的植物表达载体的构建及转基因水稻的制备本实施例是将本发明的ricPHGPx基因编码区克隆入植物表达载体中，通过基因枪轰击或农杆菌侵染的方法将其导入水稻中，制作过量表达的水稻株系，来提高水稻抗病、抗衰老以及抗逆的能力。实验方案为1.水稻幼胚愈伤组织的获得1)取授粉后10-12天的水稻幼穗，消毒处理后分离幼胚；2)将幼胚接种于MS或N6脱分化培养基中诱导愈伤组织。含有ricPHGPx基因的植物表达载体的构建如实施例1所述，设计并合成PCR引物，用PCR法扩增ricPHGPx基因。将ricPHGPx基因克隆到质粒载体pUC19中，构建成载体pUCPHGPx。将质粒载体pB121.1(本发明人的实验室保存)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后产生的约2.0kb片段(含有β-GUS基因和NOS-终止子序列)克隆到质粒pCAMBIA3300(本发明人的实验室保存)中，构建成载体pCAMGUSBIA。将HindⅢ和BamHⅠ双酶切质粒pUBA(本发明人的实验室保存)后所产生的约2.0kb片段(含有泛素启动子)克隆到载体pCAMGUSBIA中，得到新的载体pCAMUBI。将扩增的ricPHGPx基因连接到pCAMUBI上，构建成目的载体pUBIBIAPHGPx。整个载体构建过程参见图4。目的基因的转化及转基因水稻植株的获得用基因枪轰击或农杆菌侵染的方法将质粒载体pUBIBIAPHGPx转入水稻幼胚愈伤组织中，通过抗性筛选获得正确整合并稳定表达PHGPx基因的水稻植株。SEQ ID NO:1GGGAGAGGGATTTCGATTTTTTTTTCTCCACGGCGAAATCCGCGAGGCGGAGGAGGAGGA 60GGAGGGCGAGATGGGGGCGGCGGAATCCGTGCCGGAGACCTCCATACACGAATTCACCGT120M G A A E S V P E T S I H E F T V 17CAAGGATTGCAACGGCAAGGAGGTGAGCCTGGAGATGTACAAGGGGAAGGTGCTAATCGT180K D C N G K E V S L E M Y K G K V L I V 37CGTCAACGTCGCCTCCAAATGTGGGTTCACGGAGACCAACTACACGCAGCTGACGGAGCT240V N V A S K C G F T E T N Y T Q L T E L 57CTATCAGAAACACAGGGACAAAGATTTTGAGATTCTAGCATTTCCCTGCAATCAGTTCTT300Y Q K H R D K D F E I L A F P C N Q F L 77GCGACAAGAGCCAGGATCTGACCAGCAAATAAAGGATTTTGCTTGCACAAGATTTAAAGC360R Q E P G S D Q Q I K D F A C T R F K A 97TGAATATCCCGTTTTTCAGAAGGTGCGTGTAAATGGTCCTGATGCTGCACCACTTTACAA420E Y P V F Q K V R V N G P D A A P L Y K 117ATTTTTGAAAGCTAGCAAGCCTGGCTTGTTTGGATCTAGAATCAAGTGGAACTTTACCAA480F L K A S K P G L F G S R I K W N F T K 137ATTTCTTATTGATAAGAATGGCAAAGTCATTAACAGATACTCGACTGCGACCAGTCCCTT540F L I D K N G K V I N R Y S T A T S P L 157GTCTTTTGAGAAAGACATCCTGAAGGCGCTCGAGGATTAGATCTCGTACCCTCCCCCATC600S F E K D I L K A L E D * 169CTTCATTTGCAGAAGTAGGCAAAGTATCTGGTTGTAATATCTAGACCTATGGGATGCTCA660ATAGTGAATTTTTGCAATATATTCCTTCTTTTGTGTAGTGTATTTGTTGTCTTTATATAT720TATTATATTGTAAGTAGAGGTTGGCTGGTTGGGTAGGCACTGTTTTGTCTATACTGGTTT780TATATGGCTTGGCTTGAAAATTTGTTTAGAAACCTAAGACATTATTATCAACGTGTAATA840TCGACAAGTTGAAATTGTATGTAGCGTAAGGTTTGTGTTTGCACTGTAAAAAAAAAAAAA900AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 92权利要求
1．一种多核苷酸，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2．一种多肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3．如权利要求1所示的多核苷酸，其为水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的基因。
4．含有权利要求1所述的多核苷酸序列的表达载体。
5．如权利要求4所述的表达载体，其为原核表达载体。
6．如权利要求4所述的表达载体，其为真核表达载体。
7．用权利要求4的表达载体转化的宿主细胞。
8．如权利要求7所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。
9．如权利要求7所述的宿主细胞，其为水稻细胞。
10．一种制备具有抗衰老、抗病以及抗逆的转基因水稻的方法，包括将权利要求1所述的多核苷酸导入水稻植物。
全文摘要
本发明涉及水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶基因,及其编码的谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶蛋白质。本发明还提供了含有上述基因的重组表达载体,以及含有这种表达载体的宿主细胞。本发明的水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶基因可用于保护细胞膜免受磷脂氢过氧化的损伤,制作延迟衰老的转基因植株,特别是延迟衰老、提高光合效率的转基因水稻。
文档编号C07K14/415GK1324817SQ0010931
公开日2001年12月5日 申请日期2000年5月19日 优先权日2000年5月19日
发明者刘进元, 李文君, 赵南明, 段芮, 范静华, 徐振彪, 张日清 申请人:清华大学