专利名称：固定化金属离子亲和层析胶的制备技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程下游蛋白质纯化技术。
固定化金属离子亲和层析技术是一种分离纯化带有His-tag蛋白质的方法，这种胶能特异性地与带有纯化标记His-tag的蛋白质螯合从而使蛋白质通过金属离子牢固地吸附在胶上，其他杂质蛋白由于不带有上述纯化标记则不能与金属离子螯合，也就不能吸附到胶上；然后用Washing Buffer(Washing Buffer(8x)∶480mM咪唑，4M NaCl，160mM Tris；用浓HCl调pH值为7．9)将没有吸附的杂质蛋白冲洗掉；再用Eluting Buffer(Elute Buffer(4x)∶4M咪唑，2M NaCl，80mM Tris；用浓HCl调pH值为7．9)把所需要的目的蛋白在层析仪上洗脱下来。这样，就可以获得只含有目的蛋白质的洗脱液，再将此洗脱液透析脱盐、浓缩，冷冻干燥就可以获得纯度很高的目的蛋白质，并且蛋白质的生物活性不受影响。随着“人类基因组计划”的逐步完成，“蛋白质组计划”即将全面展开，在“蛋白质组计划”中必须大量运用基因工程手段制备各种与人类健康有关的蛋白质。而在基因工程中，除了克隆、表达外，紧接的问题就是如何纯化表达出来的目的蛋白质，这是基因工程下游技术中一个非常重要的组成部分。固定化金属离子亲和层析胶就能满足这些要求，它可以用来特异性吸附带有His-tag纯化标记的蛋白质，并通过亲和层析纯化基因工程中表达的目的蛋白质。因此，该亲和层析胶在将来的生命科学研究领域以及生物制药中应用前景是非常广阔的。
目前，固定化金属离子亲和层析胶的制备技术在国外已有少数几个生物大公司(如QIAGEN公司、Amersham Pharmacia公司等)研究出并且已经在生产有关产品。这些公司产品所涉及的主要原料除了载体胶以外，还有亚氨基二乙酸钠(IDA-Na2)或次甲基三乙酸(NTA)等，这些原料难得且价格非常昂贵。再加上国外这些大公司的制备技术路线以及所用其他费用也较高，因此生产成本也就很高，价格很昂贵(一般每50ml价格为3000-4000元人民币)。
本发明的目的就是要提供一种固定化金属离子亲和层析胶的制备技术，既操作方便、过程简单、结果可靠，又成本低、花费小，能制备出在理化指标、纯化蛋白质的功能等方面都优于或等同于国外生物大公司的相关产品。本制备技术为我们首创，与国外公司有很大不同，如在这种胶的主要制备原料中，并没有象国外大公司那样用载体[琼脂糖(Agrose)或Sepharose4B或Sepharose6B]与亚氨基二乙酸二钠(IDA-Na2)或次甲基三乙酸(NTA)来合成亲和胶；而是直接用亚氨基二乙酸(IDA)作为起始原料与载体(Sepharose4B或6B)反应合成亲和胶。另外，在某些重要的反应条件上(如温度、pH值、反应时间等)也与上述生物大公司及有关资料上所描述的大不相同。特别本发明制备的胶的成本比国外生物大公司及有关资料上介绍制备的胶的成本要低的多；按我们的成本预测，用本制备技术生产的亲和层析胶的预测售价仅是每50ml为300-500元左右。
综上所述，本技术与目前国外(国内尚无)已有的技术相比，主要有以下优点
1、生产成本大大降低。我们用IDA作为起始原料，IDA比IDA-Na2的市场售价低很多(大约是1∶20)且非常易得(国内就有生产)；而IDA-Na2必须从国外进口，且价格很高。另外本发明用Sepharose做起始原料，比国外公司所用的琼脂糖(Agrose)要便宜许多；两方面综合起来核算，估计本研究的成本不到国外公司的生产成本的十分之一。
2、制备过程简便，一般的技术人员一学即会。
3、成品胶的理化指标及分离纯化蛋白的功能很好。我们采用原子吸收法对本发明制备的亲和层析胶测定了螯合Ni2+的量，并与国外大公司的产品及有关资料报道的结果进行了比较。结果表明，本发明制备的胶的理化指标比他们的指标均要高许多。此外，我们特地设计了一种带有His-tag标记的蛋白质(人B淋巴细胞刺激因子，hBLyS)，用来检测此合成胶的分离纯化的效果；结果也表明，本发明制备的金属离子Ni2+亲和层析胶在分离纯化带有His-tag标记的蛋白质方面，效果是非常令人满意的。
本发明的目的是通过如下的技术方案来实现的本制备技术的总体设计及反应流程如下 本发明的制备过程从亚氨基二乙酸及相应的载体开始，这是目前国内外尚未有的新技术。
具体制备步骤1、将载体(Sepharose6B或Sepharose4B)用G-3漏斗抽干，称取50g放入一个三角烧瓶中，加入CNBr或环氧氯丙烷(1-2倍载体胶体积)，用NaOH调pH值为6．5-12，再加入0．0375gNaBH4；在22℃-60C搅拌反应1-2小时后，加入10ml 0．2M NaOH及5mlCNBr或环氧氯丙烷，间隙搅拌5-12小时，使胶充分活化并在胶颗粒中的分子上的-OH基团接上环氧丙基；2、活化好的载体胶于G-3漏斗上抽干，再放回三角烧瓶中，加入IDA，在pH为6．5-12的条件下(用0．2M Na2CO3溶液调pH)与手臂IDA(亚氨基二乙酸)搅拌反应，反应温度是30℃-50℃；反应2-6小时；3、反应完的胶用G-3漏斗抽干；4、抽干的胶回转至三角瓶中，用2-5倍体积的1M的NiSO4溶液与之反应；反应条件为30℃-50℃、搅拌反应3-5小时；5、结合了Ni2+的胶在G-3漏斗上充分抽干，用稀HAc淋洗2-3次，再用双蒸水淋洗2-3次，抽干；6、用20％的乙醇保存于4℃冰箱；这样就制备了固定化Ni2+亲和层析胶；取出部分产物做分析实验。
对本发明制备产物的鉴定1、原子吸收检测取出上述发明制备的亲和胶(抽干)2g，用含有EDTA的溶液20ml将2g胶上的所有Ni2+螯合下来进入溶液，然后用标准曲线法在原子吸收仪上进行测定。
结果取上述含有2g胶中的Ni2+的EDTA溶液0．5ml用ddH2O稀释到250ml后，用原子吸收法测得其中[Ni2+]=0．0168mmol／L。
计算得到每克抽干胶中螯合的Ni2+为4．93mg或84μmol；每毫升沉淀胶中螯合的Ni2+为4．11mg或70μmol。
从上述测定结果看，比有关资料报道的数字15．7μmol of Ni2+／ml of gel[1]及8-12μmol Ni2+／ml胶[2](QIAGEN公司)均要高出许多。其中，实验样品的计算结果比8-12μmol Ni2+／ml of gel高出5．83-8．75倍；比15．7μmol of Ni2+／mlof gel高出近4．46倍。
2、分离纯化蛋白质的效果检测参考有关文献[3]，取2ml本研究制备的Ni2+亲和层析胶做成亲和层析柱，用Binding Buffer平衡好后，另取用大肠杆菌BL21菌株表达的含有目的蛋白质hBLyS的总蛋白上清液上样加入柱子，再用Washing Buffer冲洗掉不吸附的杂质蛋白，最后用洗脱液洗脱目的蛋白。电脑记录的洗脱图象呈单一锐峰。
可见，洗脱目的蛋白质hBLyS的纯度以及胶对目的蛋白hBLyS的吸附效果都是很好的(冲洗液经电泳检测不含有目的蛋白hBLyS)。另外，洗脱液不经透析、浓缩，直接进行电泳检测时，凝胶上也只见一条带子，这也说明此胶分离纯化蛋白质的效果是非常好的。
参考文献1、 Michele C. Smith,Thomas C. Furman,Charles Pidgeon.Immobilized IminodiaceticAcid Metal Peptide Complexes.Identification of Chelating Peptide Purification Handlesfor Recombinant Proteins.Inorg.Chem.1987,26,1965～19692、The QIAexpressionist(QIAGEN),2nd Edition,1992(因为是一本小册子，故只能附上相关的一页)。
3、pET System Manual(Novagen),7th Edition,1997(注因为是一本小册子，故未附上复印件)。
权利要求
1．一种固定化金属离子亲和层析胶的制备技术，其特征是将载体(Sepharose6B或Sepharose4B)用G-3漏斗抽干，放入一个三角烧瓶中，加入CNBr或环氧氯丙烷，用NaOH调pH值为6．5-12，再加入NaBH4，在22℃-60℃搅拌反应1-2小时后，加入NaOH及CNBr或环氧氯丙烷，间隙搅拌5-12小时，使胶充分活化；活化好的载体胶于G-3漏斗上抽干，再放回三角烧瓶中，加入IDA，在pH为6．5-12的条件下(用0．2M Na2CO3溶液调pH)与手臂IDA(亚氨基二乙酸)搅拌反应，反应温度是30℃-50℃，反应2-6小时，反应完的胶用G-3漏斗抽干，抽干的胶回转至三角瓶中，用2-5倍体积的NiSO4溶液与之反应；反应条件为30℃-50℃、搅拌反应3-5小时；把胶在G-3漏斗上充分抽干，用稀HAc淋洗2-3次，再用双蒸水淋洗2-3次，抽干；用20％的乙醇保存于4℃冰箱。
全文摘要
本发明是一种固定化金属离子亲和层析胶的制备技术,用Sepharose 6B和亚氨基二乙酸(IDA)作为主要原料,经活化、接臂、固定等反应合成出Ni
文档编号C07K1/00GK1280134SQ0011214
公开日2001年1月17日 申请日期2000年3月16日 优先权日2000年3月16日
发明者张双全, 刘平 申请人:南京师范大学