专利名称：利用丙烯腈清除剂去保护合成的寡核苷酸的制作方法
相关申请本申请要求2000年6月12日提交的美国临时申请60/210,757的利益，其全部内容结合在此作为参考。
背景技术：
寡核苷酸习惯上是利用β-氰基乙基亚磷酰胺化学在固体载体上合成的，大规模的用于反义治疗剂，小规模的用于诊断/分子生物学目的。这种化学是利用二氧化硅类CPG珠粒作为固体载体而开发的，以促进去保护和纯化。随后，这种化学转而利用刚性聚苯乙烯类载体合成寡核苷酸。另外，用于反义及相关疗法的大规模寡核苷酸合成已经变得日益重要，因为FDA批准了寡核苷酸类似物用于治疗CMV。若干其他寡核苷酸类似物当前处于临床试验阶段。目前，千克数量级的具有磷酸二酯或硫代磷酸二酯键的寡核苷酸是利用β-氰基乙基亚磷酰胺化学合成的，用于临床试验和其他应用。
关于药物应用，必须将所需的寡核苷酸从基本上全部在合成期间生成的杂质中分离出来。一般通过反相高效液相色谱法(HPLC)和/或离子交换色谱法除去杂质。不过，结构上与所需产物相似的那些杂质是难以除去的，因为它们与所需产物的结构相似性致使它们具有相似的色谱迁移率。因此，需要改进合成工艺，以便不产生结构与所需产物相似的杂质。
发明概述本发明涉及这样的发现，在β-氰基乙基磷酸酯保护基团从合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间所释放的丙烯腈能够与寡核苷酸或寡核苷酸类似物上的亲核基团反应，生成结构上与所需寡核苷酸或寡核苷酸类似物相似的杂质。
本发明的方法基本上防止了合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰。该方法涉及使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与丙烯腈清除剂在有机溶剂中的溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团的条件(例如足够高的温度和足够长的时间)下接触。叔丁胺是优选的丙烯腈清除剂。适合的有机溶剂包括亲核溶剂，例如吡啶；醚，例如四氢呋喃或二噁烷；腈，例如乙腈；卤代烷烃，例如二氯甲烷；酯，例如乙酸乙酯、丙酸甲酯和丙酸乙酯；醇，例如乙醇或甲醇；和二甲基甲酰胺。一组优选的溶剂包括卤代烷烃、酯、醇和二甲基甲酰胺。另一组优选的溶剂包括吡啶和乙腈。
在另一种实施方式中，该方法涉及使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂、例如叔丁胺的碱水溶液接触。碱溶液优选地是氢氧化铵水溶液。寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在足以从寡核苷酸或寡核苷酸类似物中除去至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触。
在另一种实施方式中，被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在与含有丙烯腈清除剂的碱水溶液接触之前先与含有有机溶剂和至少一种丙烯腈清除剂的溶液接触。
另外，当被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有丙烯腈清除剂的有机或碱水溶液接触时，能够除去至少一个核碱保护基团。另外，通过与含有丙烯腈清除剂的有机或碱水溶液接触，寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够同时从固体载体上裂解。
本发明还涉及制备寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法，其中基本上防止了寡核苷酸或寡核苷酸类似物的修饰。在制备寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法中，具有至少一个β-氰基乙基保护基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物通常是利用亚磷酰胺化学合成的。所合成的被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物然后与至少一种丙烯腈清除剂在有机溶剂中的溶液在一定温度下接触一段时间，温度和时间都足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团。在替代的实施方式中，所合成的被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在一定温度下接触一段时间，温度和时间都足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团。在另一种实施方式中，所合成的被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物先与至少一种丙烯腈清除剂在有机溶剂中的溶液、随后再与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在一定温度下接触一段时间，温度和时间都足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团。
通常，β-氰基乙基磷酸酯保护基团是这样从合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解的，将合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物用氢氧化铵水溶液处理。氢氧化铵处理后的粗产物的色谱图一般显示除所需寡核苷酸或寡核苷酸类似物以外的峰。这些异常主要见于富含胸腺嘧啶或鸟嘌呤碱基或者经过修饰已含有脂族胺的寡核苷酸的序列。如本文所述，用氢氧化铵处理后的寡核苷酸或寡核苷酸类似物粗产物的MALDITOF质谱表明，主要杂质的质量比所需寡核苷酸或寡核苷酸类似物的质量多52-54个单位，说明它来源于所需寡核苷酸用丙烯腈修饰，丙烯腈是β-氰基乙基保护基团裂解的副产物。
无意拘泥于任何理论的是，据信本发明方法的优点在于通过丙烯腈与丙烯腈清除剂的反应，从碱水溶液中除去在β-氰基乙基保护基团的除去期间所产生的丙烯腈。这减少了在裂解与去保护期间所生成的结构上与所需寡核苷酸产物相似的杂质的量，所需产物例如其中一个或多个核碱已经与丙烯腈反应的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。因此，所需产物的纯化是更容易的，所需产物的回收率更高。
图1A、1B和1C是离子交换HPLC色谱，如下所述。柱子类型是DNA PAC PA-100(柱s/n1305)。洗脱剂A是25mM Tris pH8。洗脱剂B是25mM Tris，375mM NaClO4 pH8。系统名称是IEX2。波道说明是260nm。梯度是在40min内10至60％B，流速1.5ml/min，温度45℃。
图1A是具有31个胸腺嘧啶碱基的磷酸二酯寡核苷酸的离子交换HPLC色谱，该寡核苷酸从聚苯乙烯固体载体上裂解，在50℃下用氢氧化铵处理16小时进行去保护。
图1B是来自与图1A磷酸二酯相同合成批次的磷酸二酯寡核苷酸的离子交换HPLC色谱，该寡核苷酸从固体载体上裂解，在50℃下用含10％叔丁胺的氢氧化铵处理16小时进行去保护。
图1C是来自与图1A磷酸二酯相同合成批次的磷酸二酯寡核苷酸的离子交换HPLC色谱，该寡核苷酸从固体载体上裂解，在50℃下用含5％DTT的氢氧化铵处理16小时进行去保护。
图2A是图1A磷酸二酯寡核苷酸的MALDITOF质谱。PSI NH4OHTIPPED法是DNA1。模式是线性。加速电压是25000。栅压是92.500％。导线电压是0.150％。平均扫描是156。压力是3.09e-07。激光在2620。阴离子是OFF。低质量门是500.0。延迟是250 ON。
图2B是图1B磷酸二酯寡核苷酸的MALDITOF质谱。PSI NH4OH+10％叔丁胺法是DNA1。模式是线性。加速电压是25000。栅压是92.500％。导线电压是0.150％。平均扫描是54。压力是3.05e-07。激光在2620。阴离子是OFF。低质量门是500.0。延迟是250 ON。
图2C是图1C磷酸二酯寡核苷酸的MALDITOF质谱。PSI NH4OH+DDT TIPPED法是DNA1。模式是线性。加速电压是25000。栅压是92.500％。导线电压是0.150％。平均扫描是54。压力是3.05e-07。激光在2620。阴离子是OFF。低质量门是500.0。延迟是250 ON。
发明详述本发明涉及这样的发现，向用于裂解β-氰基乙基保护基团的碱水溶液加入丙烯腈清除剂，能够改善或基本上防止在β-氰基乙基磷酸酯保护基团裂解期间所生成的丙烯腈对合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的修饰。作为替代选择，在有机溶剂中将被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物用丙烯腈清除剂处理，能够防止丙烯腈对合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的修饰。
β-氰基乙基保护基团通常用于在合成期间保护与寡核苷酸或寡核苷酸类似物磷骨架连接的氧或硫。β-氰基乙基保护基团可以由下列结构式代表 可以通过碱处理除去β-氰基乙基保护基团。关于除去β-氰基乙基保护基团的条件，参见Sinha等，Nucleic Acids Research(1984)，12(11)4539和Sinha，美国专利No.4,725,677，全部内容结合在此作为参考。
本文所用的术语“碱水溶液”表示水溶液，或者含有水互溶性有机溶剂的水溶液，例如醇、四氢呋喃、乙腈和二甲基甲酰胺。当水溶液含有有机溶剂时，它的浓度通常小于50％。碱通常是氨、取代或未取代的脂族胺、取代或未取代的芳族胺、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。含水氢氧化铵是优选的碱溶液。在优选的实施方式中，还通过含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液处理除去核碱保护基团。
当通过碱处理除去β-氰基乙基保护基团时，例如氢氧化铵，生成丙烯腈(例如参见流程I)。 流程Iβ-氰基乙基保护基团的去保护流程I中，X1和X2各自独立地是氧或硫。在β-氰基乙基保护基团的除去期间生成的丙烯腈是一种Michael受体，因此能够在碱性反应条件下与寡核苷酸或核苷酸类似物上的环外或环内亲核基团反应。例如，丙烯腈能够通过N3加成与胸腺嘧啶核苷碱基反应，如流程II所示。 流程II核碱在氢氧化铵处理期间的氰基乙基化作用在本发明的方法中，用含有至少一种丙烯腈清除剂的溶液除去β-氰基乙基保护基团，能够改善或基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的氰基乙基化作用。如果在除去至少一个β-氰基乙基保护基团的处理之后不存在分子量比所需寡核苷酸或寡核苷酸类似物高52-53个质量单位的杂质，或者这类杂质的可检测量当与所需寡核苷酸或寡核苷酸类似物相比时小于0.5％，那么基本上防止在除去至少一个β-氰基乙基保护基团的处理期间丙烯腈对寡核苷酸或寡核苷酸类似物的修饰。
丙烯腈清除剂是能够与丙烯腈反应的化合物，使其对寡核苷酸或寡核苷酸类似物的亲核基团是无反应性的，例如核碱的那些。优选地，丙烯腈清除剂还能够裂解被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的β-氰基乙基保护基团，生成所需的寡核苷酸或寡核苷酸类似物骨架(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯等)。丙烯腈清除剂优选地是位阻的，以避免与核碱的反应。例如，未受阻的伯胺能够与胞嘧啶和腺苷反应，置换胞嘧啶的N4-胺和腺苷的N6-胺(Hsiung等，NucleicAcid Research(1983)，11(10)3227)。因此，主要为脂族伯胺或脂族伯硫醇的丙烯腈清除剂应当是空间位阻的。空间位阻的硫醇或空间位阻的脂族伯胺是与脂族仲或叔碳原子键合的硫醇或胺，或者是与伯碳键合的硫醇或胺，其条件是该伯碳与仲或叔碳原子或芳族或杂芳族基团连接。可以采用的丙烯腈清除剂包括取代或未取代的脂族羟基化合物。优选的丙烯腈清除剂是取代或未取代的空间位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羟基化合物(例如酚)、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空间位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。更优选地，丙烯腈清除剂是叔丁胺。
由于丙烯腈清除剂优选地裂解β-氰基乙基保护基团，因此将被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物用含有丙烯腈清除剂的有机溶剂在足够高的温度下、优选约15℃至约30℃处理足够长的时间、优选约0.5小时至约2小时，以除去至少一个β-氰基乙基，能够基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的修饰。丙烯腈清除剂在有机溶剂中的浓度经常约0.5％(vol/vol)至约50％(vol/vol)，优选约3％(vol/vol)至约25％(vol/vol)，更优选约1％(vol/vol)至约15％(vol/vol)。
在另一种实施方式中，使具有至少一个β-氰基乙基保护基团的合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在足够高的温度下接触足够长的时间，以除去至少一个β-氰基乙基。丙烯腈清除剂在碱水溶液中的浓度经常约0.5％(vol/vol)至约50％(vol/vol)，优选约3％(vol/vol)至约25％(vol/vol)，更优选约1％(vol/vol)至约15％(vol/vol)。
当寡核苷酸或寡核苷酸类似物的核碱的胺基被碱不稳定性保护基团保护时，例如生成酰胺保护基团，当寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液接触时，能够除去该保护基团。另外，如果寡核苷酸通过碱不稳定性连接剂、例如琥珀酰胺连接剂或草酰胺连接剂而与固体载体连接，那么通过与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液接触能够从固体载体上裂解。类似地，如果丙烯腈清除剂是一种胺，例如取代或未取代的脂族仲胺或取代或未取代的空间位阻脂族伯胺，那么当寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的有机溶液接触时，能够除去核碱保护基团，寡核苷酸能够从固体载体上裂解。
在本发明的方法中，寡核苷酸或寡核苷酸类似物通常与含有丙烯腈清除剂的碱水溶液接触至多约48小时。通常，碱水溶液的温度约20℃至约100℃。寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有丙烯腈清除剂的碱水溶液接触的时间长度和溶液的温度取决于是否有所要除去的核碱保护基团和所用核碱保护基团的类型。例如，当腺嘌呤和胞嘧啶的胺基被苯甲酰基保护基团保护、鸟嘌呤的胺基被异丁酰基保护基团保护时，对寡核苷酸与含有丙烯腈清除剂的碱水溶液接触来说足够的时间和温度是约6小时至约16小时和约45℃至约65℃，优选55℃。不过，当使用快速去保护基团时(用于腺嘌呤和鸟嘌呤的胺基的苯氧基乙酰基，用于胞嘧啶的胺基的异丁酰基)，约2小时至约4小时和约室温足矣。如果没有所要除去的核碱保护基团，那么约0.5小时至约2小时和20℃至35℃、优选25℃一般足以除去β-氰基乙基保护基团，在某些有利的实施方式中，还足以从固体载体上除去寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
如上所述，可以在有机溶剂中将被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物用丙烯腈清除剂溶液处理，以除去β-氰基乙基保护基团，当丙烯腈清除剂是脂族仲胺或空间位阻脂族伯胺、例如叔丁胺时，还可以除去从寡核苷酸或寡核苷酸类似物除去核碱保护基团，从固体载体裂解寡核苷酸或寡核苷酸类似物。当使用含有丙烯腈清除剂的有机溶液除去核碱保护基团和从固体载体裂解寡核苷酸或寡核苷酸类似物时，使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与加热至约35℃至约100℃的有机溶液接触约6小时至约48小时。优选地，使寡核苷酸与有机溶液接触约6小时至约16小时，有机溶液优选地被加热至约45℃至约65℃。
在另一种实施方式中，可以首先使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有丙烯腈清除剂的有机溶剂在上述用含有丙烯腈清除剂的有机溶液裂解β-氰基乙基的条件下接触。然后使寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在上述用含有丙烯腈清除剂的碱水溶液裂解β-氰基乙基的条件下接触。
核碱包括天然存在的核碱，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，和经过修饰的碱，例如7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-去氮杂腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑并-5-甲基胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和4-三唑并-5-甲基尿嘧啶。
被保护的核碱是其中该碱的反应性官能团被核碱保护基团保护的核碱。通常，核碱具有能够被胺保护基团保护的胺基。胺保护基团是本领域技术人员已知的。关于胺保护基团的实例，参见Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis(1991)，John Wiley & Sons，Inc.，p.309-405，其内容全部结合在此作为参考。优选地，胺被保护成酰胺。腺嘌呤和胞嘧啶的胺基通常被苯甲酰基保护基团保护，鸟嘌呤的胺基通常被异丁酰基保护基团保护。不过，也可以利用其他保护流程。例如，关于快速去保护，腺嘌呤和鸟嘌呤的胺基可以被苯氧基乙酰基保护，胞嘧啶的胺基可以被乙酰基或异丁酰基保护。用于除去核碱保护基团生成原始官能团的条件将取决于所使用的保护基团。当氨基通过生成酰胺基而被保护时，它通常是这样除去的，将寡核苷酸用浓氢氧化铵溶液在约20℃至约65℃下处理约2小时至约48小时。
合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是化学合成的那些，不是从生物材料提取的。本发明的方法特别可用于富含胸腺嘧啶和/或鸟嘌呤核碱的合成的寡核苷酸和寡核苷酸类似物，例如其中至少约5％的核碱是胸腺嘧啶或鸟嘌呤的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。优选地，寡核苷酸或寡核苷酸类似物的至少约10％的核碱是鸟嘌呤或胸腺嘧啶。更优选地，至少约25％的核碱是鸟嘌呤或胸腺嘧啶。进而更优选地，至少约50％的核碱是鸟嘌呤或胸腺嘧啶。最优选地，所有核碱都是鸟嘌呤或胸腺嘧啶。
用于寡核苷酸合成的固体载体是不溶于用于寡核苷酸合成的试剂的有机或无机聚合物。通常，使用刚性聚苯乙烯或受控多孔(controlled-pore)玻璃硅胶作为寡核苷酸合成中的固体载体。另外，如果需要的话还可以采用微孔或软凝胶载体，尤其是聚(丙烯酰胺)载体，例如更常用于肽固相合成的那些。优选的聚(丙烯酰胺)载体是胺官能化载体，尤其是从通过丙烯酰基-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺与双-丙烯酰基乙二胺的共聚作用所制备的载体衍生的那些，例如商业上可得到的(Polymer Laboratories)载体，在销售时的目录名为PL-DMA。载体的制备操作已经描述在Atherton，E.和Sheppard，R.C.，SolidPhase Peptide SynthesisA Practical Approach，(1984)IRL Press atOxford University Press，其中的微孔载体结合在此作为参考。这类载体上的官能团是甲基酯，最初通过与烷基二胺、例如乙二胺的反应转化为伯胺官能度。
用在本发明方法中或者由本发明方法产生的寡核苷酸包括磷酸二酯(例如脱氧核糖核酸和核糖核酸)或寡核苷酸类似物。寡核苷酸类似物被理解为在本文中表示含有化学修饰的核苷酸的DNA或RNA寡核苷酸分子。例如，寡核苷酸类似物可以具有经过修饰的核碱，例如7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-去氮杂腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑并-5-甲基胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和4-三唑并-5-甲基尿嘧啶。寡核苷酸类似物还可以在糖部分被修饰。例如，糖部分的羟基可以通过加入2’-O-甲基而被修饰，或者糖可以是L-核糖或L-脱氧核糖，代替天然存在的D-核糖或D-脱氧核糖。寡核苷酸类似物还包括在磷酸酯骨架被修饰的寡核苷酸。例如，硫代磷酸酯、磷酸甲酯或膦酸甲酯是寡核苷酸类似物。寡核苷酸类似物可以具有一定比例的非核酸分子，例如PNA(Egholm等，J.Am.Chem.Soc.(1992)，1141895)或吗啉代反义低聚物(Summerton和Weller，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.(1997)，7187)，其条件是至少一个β-氰基乙基保护基团用在寡核苷酸类似物的合成中。另外，寡核苷酸类似物可以是已在3’-或5’-末端被如下修饰的寡核苷酸荧光染剂，例如荧光素或若丹明；连接剂，例如烷基胺或被保护的巯基烷基连接剂；嵌入剂，例如吖啶；增加细胞摄取的基团，例如胆固醇；半抗原，例如二硝基酚；或标记或报道基团，例如生物素或地高辛配基。
脂族巯基、脂族羟基或脂族胺基是与取代或未取代的脂族基团共价键合的巯基、羟基或胺基。脂族伯胺是与一个脂族基团连接的胺(例如叔丁胺)。脂族仲胺是与两个脂族基团连接的胺(例如二异丙胺、吗啉或哌嗪)。空间位阻脂族伯胺或空间位阻脂族硫醇是与脂族仲或叔碳原子键合的胺或硫醇，或与伯碳键合的胺或硫醇，其条件是该伯碳与至少一个仲或叔碳原子或芳族或杂芳族基团连接。叔丁胺是与脂族叔碳原子连接的胺的实例。仲丁胺是与脂族仲碳原子连接的胺的实例。苄硫醇是与伯碳连接的硫醇的实例，该伯碳还与芳族基团连接。
本文所用的脂族基团包括直链或支链C1-C18烃，它们是完全饱和的或者含有一个或多个未共轭双键，或环状C3-C18烃，它们是完全饱和的或者含有一个或多个未共轭双键，其条件是至少一个与巯基、羟基或胺基键合的碳不是双键的一部分。低级烷基是完全饱和的直链或支链C1-C8烃或C3-C8环烃。若丙烯腈清除剂是空间位阻的脂族硫醇、脂族羟基化合物、脂族仲胺或空间位阻的脂族伯胺，则脂族基团优选为低级烷基。
脂族基团可以是取代的或未取代的。适合于脂族基团的取代基包括取代或未取代的芳族基团、取代或未取代的杂芳族基团、取代或未取代的杂环烷基、卤代芳族基团、卤代低级烷基(例如三氟甲基和三氯甲基)、-O-(脂族基团或取代的脂族基团)、-O-(芳族基团或取代的芳族基团)、卤代、氰基、硝基、-S-(脂族基团或取代的脂族基团)和-S-(芳族基团或取代的芳族基团)。
本文所用的术语“卤代烷烃”包括直链或支链C1-C8烃，它们是完全饱和的，并且含有1至18个卤代基团。另外，术语“卤代烷烃”包括环状C3-C8烃，它们是完全饱和的，并且含有1或16个卤代基团。卤代基团包括氟代、氯代、溴代和碘代基团。
芳族基团包括碳环系统(例如苯基)和稠合多环的碳环系统(例如萘基、蒽基和1，2，3，4-四氢萘基)。
酯包括由下式代表的基团 其中R和R1各自独立地是脂族基团、芳族基团或芳烷基。
醇包括由下式代表的基团R2-OH其中R2是脂族基团。
本文所用的芳烷基包括通过优选具有一至约六个碳原子的脂族基团与其他部分连接的芳族取代基。
本文所用的杂芳族基团包括杂芳基环系(例如噻吩基、吡啶基、吡唑、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、吲唑基、呋喃、吡咯、咪唑、吡唑、三唑、嘧啶、吡嗪、噻唑、异噁唑、异噻唑、四唑或噁二唑)和其中碳环芳族环、碳环非芳族环或杂芳基环与一个或多个其他杂芳基环稠合的杂芳基环系(例如苯并(b)噻吩基、苯并咪唑、吲哚、四氢吲哚、吖吲哚、吲唑、喹啉、咪唑并吡啶、嘌呤、吡咯并[2，3-d]嘧啶和吡唑并[3，4-d]嘧啶)。
本文所用的杂环烷基是具有5至7个原子并且包括至少一个杂原子、例如氮、氧或硫的非芳族环系。杂环烷基的实例包括吗啉、哌啶和哌嗪。
适合于芳族基团、杂芳族基团或杂环烷基的取代基包括卤代、硝基、氰基、卤代低级烷基、低级烷基醚和低级烷基硫醚。
本发明的另一种实施方式是制备寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法。制备方法涉及下列步骤合成寡核苷酸或寡核苷酸类似物，然后使寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在足够高的温度下接触足够长的时间，以除去至少一个β-氰基乙基保护基团。
寡核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任意用于合成寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法加以合成，包括固相和溶液相的方法，只要所合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物具有至少一个β-氰基乙基保护基团。通常，寡核苷酸或寡核苷酸类似物是利用亚磷酰胺化学合成的(参见Caruthers，M.H.，Science(1985)，230281，其全部内容结合在此作为参考)。其他合成寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法包括磷酸二酯与磷酸三酯法(参见Caruthers，M.H.，Acc.Chem.Res.(1980)，13155；Itakura等，Ann.Rev.Biochem.(1984)，53323；Khorana等，J.Molecular Biology(1972)，72209；Khorana等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.(1966)，3139，其全部内容结合在此作为参考)或H-膦酸酯法(参见Andrus等，Tetrahedron Lett.(1988)，29861；Froehler，B.C.，Tetrahedron Lett.(1986a)，275565；Froehler，B.C.，Tetrahedron Lett.(1986b)，275575；Gregg等，Tetrahedron Lett.(1987)，274051，其全部内容结合在此作为参考)。在优选的实施方式中，一部分寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以通过亚磷酰胺化学合成，另一部分寡核苷酸可以通过另一种方法合成，例如磷酸二酯法、磷酸三酯法或H-膦酸酯法。在更优选的实施方式中，寡核苷酸或寡核苷酸类似物是完全利用亚磷酰胺化学合成的。
实验实施例1对比去保护结果按照亚磷酰胺化学的标准方案，在DNA合成仪8909 Expedite(Applied Biosystems)上，在刚性聚苯乙烯固体载体上，分两批合成各自具有31个胸腺嘧啶核苷碱基的磷酸二酯寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸。在合成周期结束时加上5’-二甲氧基三苯甲基保护基团。在链延长结束时，将具有完全被保护的磷酸二酯或硫代磷酸酯寡核苷酸的固体载体分成三份。将每份单独在50℃下用下列物质处理16小时(i)浓氢氧化铵，(ii)含10％(vol/vol)叔丁胺的浓氢氧化铵，或(iii)含5％(vol/vol)DTT的浓氢氧化铵。通过离子交换HPLC和MALDITOF质谱分析这些样本(参见图1A-1C和2A-2C关于利用磷酸二酯寡核苷酸所得结果)。在磷酸二酯和硫代磷酸酯样本中，HPLC色谱图都显示用氢氧化铵处理的样本显示在产物峰后附近存在另外的峰。在用氢氧化铵和丙烯腈清除剂处理的其他两份样本中，另外的峰是可以忽略的。
用浓氢氧化铵从固体载体上裂解的31聚的聚胸腺嘧啶核苷磷酸二酯的MALDITOF质谱(见图2A)在9368.32显示一个峰，代表所需的产物。另外，在9390.56和9409.46的峰分别代表所需产物的钠盐和钾盐。有大量氰基乙基化的磷酸二酯，质量为9423.08。相形之下，在用氢氧化铵与10％(vol/vol)叔丁胺(图2B)或氢氧化铵与5％(vol/vol)DTT(图2C)从固体载体上裂解的31聚的聚胸腺嘧啶核苷磷酸二酯中，代表氰基乙基化磷酸二酯的9423.08峰不存在。
实施例2两步去保护法按照亚磷酰胺化学的标准方案，在DNA合成仪8909 Expedite(Applied Biosystems)上，在刚性聚苯乙烯固体载体上，分两批合成各自具有31个胸腺嘧啶核苷碱基的磷酸二酯寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸。在合成周期结束时加上5’-二甲氧基三苯甲基保护基团。在链延长结束时，将具有完全被保护的磷酸二酯或硫代磷酸酯寡核苷酸的固体载体用含有15％叔丁胺的乙腈溶液处理45分钟。然后将与磷酸二酯或硫代磷酸酯寡核苷酸键合的载体单独在50℃下用含10％(vol/vol)叔丁胺的浓氢氧化铵处理16小时。通过离子交换HPLC和MALDITOF质谱分析这些样本，得到与图1B和2B所示关于磷酸二酯寡核苷酸相似的结果。
等价方式尽管已经参照优选的实施方式确切地显示和描述了本发明，不过将为本领域技术人员所理解的是，可以在其中进行各种形式和细节上的改变，而不背离由权利要求书所涵盖的发明范围。
权利要求
1.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰的方法，包含使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含至少一种丙烯腈清除剂和选自卤代烷烃、酯、醇或二甲基甲酰胺的有机溶剂的溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触的步骤，其条件是当该丙烯腈清除剂包含脂族伯胺或脂族伯硫醇时，该脂族伯胺或脂族伯硫醇是空间位阻的。
2.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰的方法，包含使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触的步骤，其条件是当该丙烯腈清除剂包含脂族伯胺或脂族伯硫醇时，该脂族伯胺或脂族伯硫醇是空间位阻的。
3.权利要求2的方法，进一步包含在使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与碱水溶液接触之前使该寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含有机溶剂和至少一种丙烯腈清除剂的溶液接触的步骤。
4.权利要求3的方法，其中该有机溶剂选自由吡啶、四氢呋喃、乙腈、卤代烷烃、酯、醇和二甲基甲酰胺组成的组。
5.权利要求4的方法，其中该丙烯腈清除剂是叔丁胺，该有机溶剂是吡啶或乙腈。
6.权利要求2的方法，其中该β-氰基乙基保护基团是从磷酸三酯寡核苷酸上除去的。
7.权利要求2的方法，其中该β-氰基乙基保护基团是从硫代磷酸酯寡核苷酸类似物上除去的。
8.权利要求2的方法，其中该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过共价键与固体载体连接的。
9.权利要求8的方法，其中该固体载体是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚丙烯酰胺。
10.权利要求9的方法，其中该寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱溶液接触而从固体载体上裂解的。
11.权利要求2的方法，其中该丙烯腈清除剂是取代或未取代的空间位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羟基化合物、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空间位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。
12.权利要求11的方法，其中该丙烯腈清除剂是叔丁胺。
13.权利要求2的方法，其中该碱溶液包含碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。
14.权利要求2的方法，其中该碱溶液是氢氧化铵溶液。
15.权利要求14的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约100℃。
16.权利要求15的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约35℃。
17.权利要求16的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约25℃。
18.权利要求14的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约48小时。
19.权利要求18的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约2小时。
20.权利要求2的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约5％。
21.权利要求20的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约25％。
22.权利要求21的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约50％。
23.权利要求22的方法，其中所有核碱都是胸腺嘧啶和鸟嘌呤。
24.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团和至少一个核碱保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰的方法，包含使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含至少一种丙烯腈清除剂和选自卤代烷烃、酯、醇或二甲基甲酰胺的有机溶剂的溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团和至少一个核碱保护基团的条件下接触的步骤，其条件是当该丙烯腈清除剂包含脂族伯胺或脂族伯硫醇时，该脂族伯胺或脂族伯硫醇是空间位阻的。
25.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团和至少一个核碱保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰的方法，包含使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团和至少一个核碱保护基团的条件下接触的步骤，其条件是当该丙烯腈清除剂包含脂族伯胺或脂族伯硫醇时，该脂族伯胺或脂族伯硫醇是空间位阻的。
26.权利要求25的方法，进一步包含在使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与碱水溶液接触之前使该寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含有机溶剂和至少一种丙烯腈清除剂的溶液接触的步骤。
27.权利要求26的方法，其中该有机溶剂选自由吡啶、四氢呋喃、乙腈、卤代烷烃、酯、醇和二甲基甲酰胺组成的组。
28.权利要求27的方法，其中该丙烯腈清除剂是叔丁胺，该有机溶剂是吡啶或乙腈。
29.权利要求25的方法，其中该β-氰基乙基保护基团和核碱保护基团是从磷酸二酯寡核苷酸上除去的。
30.权利要求25的方法，其中该β-氰基乙基保护基团和核碱保护基团是从硫代磷酸酯寡核苷酸类似物上除去的。
31.权利要求25的方法，其中该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过共价键与固体载体连接的。
32.权利要求31的方法，其中该固体载体是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚(丙烯酰胺)。
33.权利要求32的方法，其中该寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱溶液接触而从固体载体上裂解的。
34.权利要求25的方法，其中该丙烯腈清除剂是取代或未取代的空间位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羟基化合物、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空间位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。
35.权利要求34的方法，其中该丙烯腈清除剂是叔丁胺。
36.权利要求25的方法，其中该碱溶液包含碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。
37.权利要求25的方法，其中该碱溶液是氢氧化铵溶液。
38.权利要求37的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约100℃。
39.权利要求38的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约45℃至约65℃。
40.权利要求39的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约55℃。
41.权利要求37的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约48小时。
42.权利要求41的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约6小时至约16小时。
43.权利要求25的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约5％。
44.权利要求43的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约25％。
45.权利要求44的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约50％。
46.权利要求45的方法，其中所有核碱都是胸腺嘧啶和鸟嘌呤。
47.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团和至少一个核碱保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰的方法，包含使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含叔丁胺和选自卤代烷烃、酯、醇或二甲基甲酰胺的有机溶剂的溶液在足以除去至少一个核碱保护基团和至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触的步骤。
48.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β-氰基乙基保护基团和至少一个核碱保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上裂解期间的修饰的方法，包含使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有叔丁胺的氢氧化铵溶液在足以除去至少一个核碱保护基团和至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触的步骤。
49.权利要求48的方法，进一步包含在使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与碱水溶液接触之前使该寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含有机溶剂和至少一种丙烯腈清除剂的溶液接触的步骤。
50.权利要求49的方法，其中该有机溶剂选自由吡啶、四氢呋喃、乙腈、卤代烷烃、酯、醇和二甲基甲酰胺组成的组。
51.权利要求50的方法，其中该有机溶剂是吡啶或乙腈。
52.权利要求48的方法，其中该β-氰基乙基保护基团和核碱保护基团是从磷酸三酯寡核苷酸上除去的。
53.权利要求48的方法，其中该β-氰基乙基保护基团和核碱保护基团是从硫代磷酸酯寡核苷酸类似物上除去的。
54.权利要求48的方法，其中该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过共价键与固体载体连接的。
55.权利要求54的方法，其中该固体载体是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚(丙烯酰胺)。
56.权利要求55的方法，其中该寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱溶液接触而从固体载体上裂解的。
57.权利要求48的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约100℃。
58.权利要求57的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约45℃至约65℃。
59.权利要求58的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约55℃。
60.权利要求48的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约48小时。
61.权利要求60的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约6小时至约16小时。
62.权利要求48的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约5％。
63.权利要求62的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约25％。
64.权利要求63的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约50％。
65.权利要求64的方法，其中所有核碱都是胸腺嘧啶和鸟嘌呤。
66.制备寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法，其中基本上防止了寡核苷酸或寡核苷酸类似物在β-氰基乙基保护基团除去期间的修饰，包含下列步骤a)合成具有至少一个β-氰基乙基保护基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物；和b)使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含至少一种丙烯腈清除剂和选自卤代烷烃、酯、醇或二甲基甲酰胺的有机溶剂的溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触，其条件是当该丙烯腈清除剂包含脂族伯胺或脂族伯硫醇时，该脂族伯胺或脂族伯硫醇是空间位阻的，由此除去β-氰基乙基保护基团，而基本上没有修饰寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
67.制备寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法，其中基本上防止了寡核苷酸或寡核苷酸类似物在β-氰基乙基保护基团除去期间的修饰，包含下列步骤a)合成具有至少一个β-氰基乙基保护基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物；和b)使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液在足以除去至少一个β-氰基乙基保护基团的条件下接触，其条件是当该丙烯腈清除剂包含脂族伯胺或脂族伯硫醇时，该脂族伯胺或脂族伯硫醇是空间位阻的，由此除去β-氰基乙基保护基团，而基本上没有修饰寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
68.权利要求67的方法，进一步包含在使被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与碱水溶液接触之前使该寡核苷酸或寡核苷酸类似物与包含有机溶剂和至少一种丙烯腈清除剂的溶液接触的步骤。
69.权利要求68的方法，其中该有机溶剂选自由吡啶、四氢呋喃、乙腈、卤代烷烃、酯、醇和二甲基甲酰胺组成的组。
70.权利要求69的方法，其中该丙烯腈清除剂是叔丁胺，该有机溶剂是吡啶或乙腈。
71.权利要求67的方法，其中该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是利用亚磷酰胺化学合成的。
72.权利要求71的方法，其中当该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱水溶液接触时，裂解至少一个核碱保护基团。
73.权利要求67的方法，其中所制备的寡核苷酸是磷酸二酯寡核苷酸。
74.权利要求67的方法，其中所制备的寡核苷酸类似物是硫代磷酸酯寡核苷酸类似物。
75.权利要求67的方法，其中该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过共价键与固体载体连接的。
76.权利要求75的方法，其中该固体载体是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚(丙烯酰胺)。
77.权利要求76的方法，其中该寡核苷酸或寡核苷酸类似物是通过与含有至少一种丙烯腈清除剂的碱溶液接触而从固体载体上裂解的。
78.权利要求67的方法，其中该丙烯腈清除剂是取代或未取代的空间位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羟基化合物、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空间位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。
79.权利要求78的方法，其中该丙烯腈清除剂是叔丁胺。
80.权利要求67的方法，其中该碱溶液包含碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。
81.权利要求67的方法，其中该碱溶液是氢氧化铵溶液。
82.权利要求81的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约100℃。
83.权利要求82的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约35℃。
84.权利要求83的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约25℃。
85.权利要求81的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约48小时。
86.权利要求85的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约2小时。
87.权利要求72的方法，其中该碱溶液是氢氧化铵溶液。
88.权利要求87的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约20℃至约100℃。
89.权利要求88的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约45℃至约65℃。
90.权利要求89的方法，其中该氢氧化铵溶液的温度是约55℃。
91.权利要求87的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约0.5小时至约48小时。
92.权利要求91的方法，其中使该合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与氢氧化铵溶液接触约6小时至约16小时。
93.权利要求72的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约5％。
94.权利要求93的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约25％。
95.权利要求94的方法，其中胸腺嘧啶和鸟嘌呤核碱在寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的总百分率是至少约50％。
96.权利要求95的方法，其中所有核碱都是胸腺嘧啶和鸟嘌呤。
97.制备寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法，包含利用权利要求1-65任意一项的方法从被β-氰基乙基保护的寡核苷酸或寡核苷酸类似物除去至少一个β-氰基乙基。
全文摘要
本发明涉及防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物在至少一个β－氰基乙基保护基团从寡核苷酸或寡核苷酸类似物上除去期间的修饰的方法。该方法涉及使寡核苷酸或寡核苷酸类似物与含有至少一种丙烯腈清除剂、例如叔丁胺的碱溶液接触，接触的温度和时间足以除去至少一个β－氰基乙基保护基团。本发明还涉及制备合成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法。
文档编号C07H21/04GK1444595SQ01813659
公开日2003年9月24日 申请日期2001年6月12日 优先权日2000年6月12日
发明者N·D·辛哈 申请人:艾夫西亚生物科技公司