用cd2-结合剂治疗或预防皮肤病症的方法

专利名称：用cd2-结合剂治疗或预防皮肤病症的方法
技术领域：
本发明涉及CD2-结合剂，例如所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物(例如LFA-3/IgG融合多肽)，结合与辅助剂，例如UVB辐射组合治疗病症，例如牛皮癣，或其它以异常T细胞活性或增殖为特征的表皮或皮肤病症的应用。
背景技术：
皮肤病症，如牛皮癣，湿疹，毒蕈样霉菌病，光化性角化病，和扁平苔藓已知感染了百分之一到二的美国人口，每年出现150,000-260,000的新病例(“Research Needs in 11 Major Areas in Dermatology”I Psoriasis.J.Invest.Dermatol.73402-13，1979)。许多这样的皮肤病症以皮肤和表皮中的T细胞活化增加和异常的抗原呈递为特征(Cooper，“Immunoregulation in the Skin”，在Cutaneous Lymphoma，Curr.Probl.Dermatol.，eds.van Vloten等19，pp.69-80在pp.73，74，76(1990))。例如，在接触性变应性皮炎可观察到皮内T细胞的活化。已知表现为特应性皮炎的病人皮肤含有数量增多的郎格汉斯细胞(Cooper，“Immunoregulation in the Skin”，Cutaneous Lymphoma，Curr.Probl.Dermatol.，eds.van Vloten et al.，19，p.74(1990))。在牛皮癣皮肤中，有数量增多的抗原呈递细胞，其由携带MHC II的抗原呈递细胞即郎格汉斯细胞和非郎格汉斯细胞组成(Cooper，“Immunoregulation in the Skin”，Cutaneous Lymphoma，Curr.Probl.Dermatol.，eds.van Vloten et al.，19，p.75(1990))。
皮肤T细胞淋巴瘤以皮肤和表皮的T细胞恶性克隆群体扩增为特征。病灶表皮细胞中含有数量增多的CD1+DR+抗原呈递细胞(Cooper，“Immunoregulation in the Skin”，Cutaneous Lymphoma，CurrProbl.Dermatol.，eds.van Vloten et al.，19，p.76-77(1990))。
对上述皮肤病现在已知的疗法是有限的。类固醇或环孢菌素A通常用于牛皮癣，扁平苔藓，荨麻疹，特应性皮炎，UV损伤，坏疽性脓皮病，白癜风，眼天疱疮样瘢痕(ocular cicatricial pemphigoid)，局限性脱发，变应性和刺激性接触性皮炎以及皮肤T细胞淋巴瘤。另外，对于这些的皮肤病症，一些疗法包括类维生素A，PUVA，氮芥子气，干扰素，化学疗法，氨甲蝶呤，光疗法(例如，UV光和PUVA)，抗生素和抗组胺。通常见，Fitzpatrick，Dermatology in General Medicine，3rded.，McGraw hill(1987)。UV光疗法，UVA和UVB疗法，都是将皮肤暴露于320-400nm(UVA辐射)或290-320nm(UVB辐射)的UV辐射。PUVA疗法是光化学疗法的一种形式，其包括在皮肤被感染区域重复局部应用补骨脂素或补骨脂素-基料的化合物，随后将那个区域暴露于UVA辐射。另一种用于治疗增生性皮肤病，特别是牛皮癣和毒蕈样霉菌病的方法是光动力疗法(PDT)。
已知这些疗法的副作用。对于环孢素A最常遇到的缺点包括免疫抑制造成的毒性，以及肾和神经毒性。类固醇广为所知的副作用包括诱导库兴氏综合症。一些其他前述疗法的副作用包括皮肤癌，骨髓瘤和全身中毒(constitutional toxicities)，韧带钙化，肝脏纤维化和其他病症。对于光疗法，延长用这些类疗法治疗皮肤病能导致包括红斑，瘙痒，皮肤癌和慢性光-诱导的皮肤损害在内的明显急性和慢性副作用(Stem等N.E.J.of Med.300809-812，1979)。
因而，需要改善预防和治疗表现出T细胞激活和异常抗原呈递的皮肤病症的疗法模式。

发明内容
本发明部分基于如下发现将CD2-结合剂，例如，LFA-3/IgG融合多肽与辅助剂，例如UVB辐射结合对治疗牛皮癣病灶十分有效。所述辅助剂为具有一种或多种下述特性的辅助剂(一)它降低了干扰素悖..IFNγ(IFNγ)的生成和/或水平；(二)它减少了被感染组织中T细胞的数量，特别是CD69+T细胞的数量；(三)它降低了CD40配体(CD40L，即CD154)的表达；或(四)它增加了T细胞死亡，例如，细胞程序死亡。虽不希望被理论所束，据信此治疗通过降低牛皮癣病灶中Th1-型细胞的数量和活性来起作用。从而，本发明提供了治疗和预防以异常T细胞活性或增殖为特征的表皮或皮肤病症的方法和组合物。
通常，本发明特征限定一种治疗或预防受试者的皮肤病症，例如，以异常(例如增加)T细胞，例如Th1-型细胞的活性或增殖为特征的表皮或皮肤病症的方法。此方法包括向受试者给药CD2-结合剂，LFA-3-结合剂，或所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，与辅助剂联合应用的CD2-结合剂。上述辅助剂，例如具有一种或多种下述特性的辅助剂(一)它降低了干扰素γ(IFNγ)的生成和/或水平；(二)它减少了被感染组织中的T细胞，例如记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)的数量，特别是CD69+T细胞的数量；(三)它降低了CD40配体(CD40L)的表达；或(四)它增加了T细胞死亡，例如，细胞程序死亡。
在优选实施方案中，所述皮肤病症表现下述一种或多种特征(一)IFNγ水平升高，例如T细胞IFNγ生成增加；(二)T细胞群体(populations)水平升高，例如，CD3-，CD4-，CD8，CD45-和/或CD69-阳性T细胞；(三)CD40配体表达升高；或(四)角质形成细胞过度增生。
在优选实施方案中，所述皮肤病症为慢性炎症病症，例如牛皮癣。
在优选实施方案中，所述皮肤病症为自身免疫病症，例如慢性自身免疫病症，例如，牛皮癣。
在优选实施方案中，所述皮肤病症选自一种或多种如下病症牛皮癣，特应性皮炎，皮肤T细胞淋巴瘤如毒蕈样霉菌病，变应性和刺激性接触性皮炎，扁平苔藓，脱发，例如局限性脱发，坏疽性脓皮病，白癜风，眼天疱疮样瘢痕，或荨麻疹。优选，所述皮肤病症为牛皮癣，特应性皮炎，变应性皮炎，或局限性脱发。最优选，所述病症为牛皮癣。
在优选实施方案中，此CD2-结合剂为所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，抗-CD2抗体同系物；LFA-3的可溶性CD2-结合片段；与另一部分偶联，例如融合的LFA-3的可溶性CD2-结合片段，此另一部分可为，例如整个或部分的血浆蛋白，如整个或部分的免疫球蛋白(例如IgG(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA(例如IgAl，IgA2)，IgD，和IgE，但优选IgG)或其片段(例如免疫球蛋白恒定区)，血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或合成的亲水聚合物如PEG化物(pegylation)(例如PEG)；CD2-结合小分子或模拟肽(peptidomimetic)；例如，通过噬菌体展示或用肽组合文库来鉴定的CD2-结合多肽片段。
在优选实施方案中，此CD2结合剂为LFA-3的CD2-结合片段，所述LFA-3与全部或部分的免疫球蛋白铰链和重链恒定区或其一部分融合(例如LFA-3/IgG融合多肽，例如，LFA-3/IgG融合多肽，其具有在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ IDNO7和8所示的核苷酸和氨基酸序列)。然而，另一优选LFA-3/IgG融合蛋白具有

图1所示的氨基酸序列，并由该表所示的核苷酸序列编码而成。
在优选实施方案中，所述CD2结合剂为可溶性的LFA-3多肽，例如选自LFA-3序列中的氨基酸1-92，1-80，50-65，20-80的多肽，此LFA-3序列见在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ ID NO3所示。
在优选实施方案中，此CD2结合剂为抗-CD2抗体同系物，例如单克隆抗-CD2抗体(例如，重组体(例如，嵌合或人源化抗-CD2抗体)或其抗原结合片段(例如抗-CD2抗体同系物的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段或完整免疫球蛋白重链)。
在优选实施方案中，此CD2结合剂包括结合CD2的第一部分和募集效应细胞的第二部分。所述第一部分可为LFA-3的CD2结合片段，例如本文所述的片段，或结合CD2的抗体同系物，例如，本文所述的抗体同系物。所述第二部分可为能募集效应细胞如自然杀伤细胞(NK)的多肽。优选，所述第二部分包括免疫球蛋白恒定区片段，例如本文所述的免疫球蛋白片段；或Fc受体(例如FcγRI或FcγRII)结合抗体同系物。
在特别优选实施方案中，所述CD2结合剂为嵌合，例如融合多肽，其包括LFA-3的CD2-结合片段和能募集效应细胞的多肽。优选实施方案中所述嵌合或融合多肽包括LFA-3的CD2结合片段，例如本文所述的片段，或结合CE2的抗体同系物，例如本文所述的抗体同系物，与免疫球蛋白恒定区的片段，例如本文所述的免疫球蛋白片段；或Fc受体结合抗体同系物。
在优选实施方案中，所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物为LFA-3-结合剂，例如，抗-LFA-3抗体同系物；CD2的可溶性LFA-3结合片段；与另一部分融合的CD2的LFA-3结合片段，该另一部分为，例如血浆蛋白，如免疫球蛋白(例如，IgG(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA(例如IgA1，IgA2)，IgD，和IgE，优选IgG)或其片段(例如免疫球蛋白恒定区)，血清白蛋白(例如人血清白蛋白)，或PEG化物；LFA-3-结合小分子或模拟肽；通过噬菌体展示或用肽组合文库鉴定的LFA-3-结合多肽片段。
在优选实施方案中，所述LFA-3-结合剂为抗-LFA-3抗体同系物，例如单克隆抗LFA-3抗体(例如重组体(例如嵌合或人源化抗-LFA-3抗体)或其抗原结合片段(例如抗-LFA-3抗体同系物的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段或完整免疫球蛋白重链)。
在优选实施方案中，所述辅助剂为直接或间接造成一种或多种如下结果的辅助剂(一)干扰素-γ(IFNγ)的生成和/或水平的降低；(二)受感染组织的T细胞数量，例如记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45RO+细胞或CD4/CD45RO+细胞)的数量，特别是CD69+T细胞的数量的减少；(三)CD40配体(CD40L)的表达降低；或(四)T细胞死亡，例如，细胞程序死亡的增加。所述效应可由于如下一种或多种原因所致T细胞，例如，记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)的数量或活性的下降；IFNγ生成免疫细胞(例如T细胞)的数量或活性的下降；IFNγ的隔离(sequestration)或其它灭活；干扰免疫细胞合成和/或分泌IFNγ；诱导细胞-(例如，效应细胞-)介导的对T细胞(例如，IFNγ-生成免疫细胞)的杀伤。辅助剂举例包括光疗法(例如UVA，UVB或PUVA)；氨甲蝶呤；类维生素A(retinoid)，环孢素(cyclosporine)，依曲替酯(etretinate)；细胞因子抑制物，例如，大内酰胺(macrolactam)(例如，pimecrolimus)；IFNγ结合剂，例如，抗-IFNγ抗体或其抗原结片段；IFNγ拮抗物，或IFNγ-受体，例如，抑制IFNγ-受体相互作用的抗体或此抗体的抗原-结合片段，小分子或模拟肽抑制物。
在优选实施方案，所述辅助剂选自紫外辐射，例如UVA或UVB辐射，PUVA辐射，氨甲蝶呤，类维生素A，环孢素，依曲替酯，大内酰胺(例如，藤霉素(tacrolimus)(FK506)或子囊霉素大内酰胺(ascomycinmacrolactam)(例如pimecrolimus))，或其任意组合。优选辅助剂为UVB辐射。
在优选实施方案中，所述方法还包括监测受试者的例如症状，或细胞因子(例如IFNγ)水平的变化，或免疫细胞群体(例如T细胞，例如，记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；生成IFNγ-的免疫细胞)的步骤。所述受试者可在治疗开始前，治疗过程中，或在给药治疗一个或多个疗程(elements)后接受监测。监测可被用作评估用同种制剂继续治疗或用附加制剂进行附加治疗的需要。通常，细胞因子，例如，IFNγ水平的下降，或选择的免疫细胞群体(例如，T细胞，例如记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；或生成IFNγ免疫细胞)的下降是受试者病症改善的指示。
治疗可包括与其它制剂联合。因此，在优选实施方案中，所述方法还包括给药受试者可抑制T细胞受体共刺激信号的制剂，例如B7-CD28，ICAM-LFA-1或CD40-CD40L相互作用的抑制物，或其任意组合。所述制剂可为任意分子(例如，干扰配体(例如B7，ICAM，CD40)与其对应物(例如CD28，LFA-1，CD40L)相互作用的抗体或其片段，可溶性多肽，小分子或模拟肽)。优选，所述制剂为抗LFA-1或CD40L的抗体同系物，例如，人源化抗-LFA-1抗体。
在优选实施方案中，所述方法还包括给药受试者局部应用的制剂，例如一种或多种类固醇，维生素(例如维生素D)，焦油(tar)，蒽林(anthralin)，大环内酯类，或大内酰胺，例如藤霉素(FK506)或子囊霉素大内酰胺(例如pimecrolimus)。
在优选实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，灵长类，优选高等灵长类，例如人。在实施方案中，所述受试者为患有表皮或皮肤病症的病人(例如，患有轻度，中度或重度类型的牛皮癣的病人)。
在优选实施方案中，所述皮肤病症可感染表皮，皮肤或皮下组织。优选，所述皮肤病感染表皮组织。
在优选实施方案中，所述CD2-结合剂和所述辅助剂可同时给药。在其它实施方案中，所述CD2-结合剂和辅助剂可顺序给药，例如通过首先给药CD2-结合剂，随后给药辅助剂，或反之。所述CD2-结合剂和辅助剂可与局部疗法结合给药(例如类固醇，维生素(例如维生素D)或焦油，蒽林或大内酰胺，例如藤霉素(FK506)或子囊霉素大内酰胺(例如pimecrolimus)。
在其它实施方案中，所述CD2-结合剂和所述辅助剂可轮换给药。例如，给药CD2-结合剂后再实行局部疗法的轮换计划，例如，类固醇疗法过程后为维生素(例如，维生素D3)治疗，再之后为蒽林。可以使用局部制剂的任意结合和顺序。
在优选实施方案中，所述CD2-结合剂和所述辅助剂的给药，例如，在空间或时间上足够紧密接近，从而所需效应例如，IFNγ水平的下降，或症状的减少，比给药辅助剂而没有CD2-结合剂，或给药CD2-结合剂而没有辅助剂所观察到的效应要显著。
在优选实施方案中，在IFNγ水平被降低IFNγ的制剂降低的期间给药所述CD2-结合剂。例如，将所述CD2-结合剂在使用如下的一种或多种局部疗法的同时，之前或之后给药受试者，即患有轻度类型牛皮癣的病人。所述局部疗法为类固醇，维生素(例如维生素D)，焦油，蒽林，大环内酯类，或大内酰胺，例如藤霉素(FK506)或子囊霉素大内酰胺(例如pimecrolimus)，或其任意组合。在受试者，例如患有中度到重度类型牛皮癣的病人，给药所述CD2-结合剂可以在光疗法(例如用UVB和/或PUVA治疗)的同时，之前，或之后。在其它实施方案中，所述CD2-结合剂可以在与维生素A，氨甲蝶呤或环孢素中一种或多种组合的光疗法的同时，之前或之后给药。在一个实施方案中，可在如下的任意时间用CD2-结合剂治疗中度到重度的牛皮癣病人。此时间安排表包括先为光疗法和类维生素A，其后为氨甲蝶呤，再之后为环孢素。
在一些实施方案中，所述CD2-结合剂可系统给药(例如用输入装置静脉内，肌内；或皮下)。在其它实施方案中，所述CD2-结合剂可局限给药(例如局部地)受累及的区域，例如，牛皮癣病灶。
在优选实施方案中，所述CD2-结合剂为LFA-3/IgG融合多肽并系统给药。在实施方案中，所述LFA-3/IgG融合多肽在十二个星期的治疗过程中给药受试者一星期一次。
在优选实施方案中，所述辅助剂局部给药，例如通过光照射，例如UVA，UVB或PUVA辐射。在其它实施方案中，所述辅助剂(例如氨甲蝶呤，口服类维生素A，环孢素，大内酰胺(例如藤霉素或pimecrolimus)可系统给药。
在优选实施方案中，所述辅助剂为UVB，例如在290-320nm范围的紫外光，更优选以在311nm的窄带UVB的形态。
所述CD2-结合剂和所述辅助剂给药形式的任意组合都在本发明范围内。
所述CD2-结合剂和所述辅助剂可在疾病活动期，或缓解期或亚活动期给药。所述CD2-结合剂和所述辅助剂可在治疗前，与治疗同时，治疗后或在所述疾病缓解时给药。
从另一个角度，本发明的特征还在于治疗或预防受试者牛皮癣的方法。所述方法包括给药受试者融合多肽，该多肽包含与IgG恒定区的片段相融合的LFA-3的CD2-结合片段，并联合足以降低受试者表皮中的IFNγ水平的量的UVB，从而治疗或预防所述牛皮癣。有利地，本联合治疗方法相对于任意单个制剂的方法可显著增强疾病缓解(包括清除)的程度和/或显著延长疾病缓解期或清除期。
在优选实施方案中，所述LFA-3的片段与免疫球蛋白铰链和重链恒定区的全部或部分相融合，例如，LFA-3/IgG融合多肽，其为含有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的核酸所编码，并具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列(SEQ ID NO7和SEQ ID NO8参见在此引入作为参考的美国专利6,162,432)。而另一优选LFA-3/IgG融合蛋白具有图1所示的氨基酸序列，并由该表所示的核苷酸序列所编码。
在优选实施方案中，所述CD2结合的LFA-3多肽包括LFA-3序列中的氨基酸1-92，1-80，50-65，20-80，此LFA-3序列见在此引入作为参考的美国专利6,162,432的SEQ ID NO3所示。
在优选实施方案中，所述方法还包括监测受试者例如症状，或细胞因子(例如IFNγ)水平的变化，或免疫细胞群体(例如T细胞，例如，记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；或生成IFNγ-的免疫细胞)的步骤。所述受试者可在治疗开始前，或在给药治疗一个或多个疗程后接受监测。该监测可被用作评估用同种制剂继续治疗或用附加制剂进行附加治疗的需要。通常，细胞因子，例如，IFNγ水平的下降，或选择的免疫细胞群体(例如，T细胞，例如记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；或IFNγ-生成的免疫细胞)的下降是受试者病症改善的指示。
治疗可包括与其它制剂联合。因此，在优选实施方案中，所述方法还包括给药受试者可抑制T细胞受体共刺激信号的制剂，例如B7/CD28，ICAM-LFA-1或CD40-CD40L(即CD154)互相作用的抑制物，或其任意组合。所述制剂可为任意分子(例如，干扰配体(例如B7，ICAM，CD40)与其对应物(例如CD28，LFA-1，CD40L)相互作用的抗体或其片段，可溶性多肽，小分子或模拟肽)。优选，所述制剂为抗LFA-1抗体的同系物，例如，人源化抗-LFA-1抗体。
在优选实施方案中，所述方法还包括给药受试者局部应用的制剂，例如一种或多种如下的制剂类固醇，维生素(例如维生素D)，焦油或蒽林。
在优选实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，灵长类，优选高等灵长类，例如人，例如，患有表皮或皮肤病症的病人(例如，患有轻度，中度或重度类型的牛皮癣的病人)。
在优选实施方案中，所述融合多肽和所述UVB同时给药。在其它实施方案中，所述CD2-结合剂和所述辅助剂顺序给药，例如通过首先给药融合蛋白，之后UVB治疗，或反之。如果给药UVB在先，应在UVB治疗效果，例如，IFNγ水平下降仍存在时给药此融合蛋白，。如果首先给药此融合蛋白，应在融合蛋白治疗效果，例如，IFNγ水平下降仍存在时给药所述UVB。
给药所述融合多肽和所述UVB可联合局部疗法(例如，类固醇，维生素(例如维生素D)或焦油，蒽林，或大内酰胺，例如藤霉素(FK506)或子囊霉素大内酰胺(例如pimecrolimus)。在其它实施方案中，融合多肽和所述UVB可轮换给药。在实施方案中，给药CD2-结合剂后实行局部疗法的轮换计划，例如，类固醇疗法后为维生素(例如，维生素D3)治疗，再之后为蒽林。
可以使用局部和/或系统制剂的任意组合和顺序。
在优选实施方案中，给药融合蛋白和所述UVB，例如，在空间或时间上要足够紧密接近，从而其效应例如，IFNγ水平的下降，或症状的减少，比观察所见的给药UVB而没有融合蛋白，或给药融合蛋白而没有UVB的效应要显著。
在一些实施方案中，所述融合多肽可系统给药(例如，通过输入(例如，用输入装置)静脉内，肌内；或皮下)。在一个实施方案中，对受试者给药所述融合蛋白，每十二星期的治疗期一次。
在优选实施方案中，所述辅助剂为UVB，例如在290-320nm范围的紫外光，更优选以在311nm的窄带UVB的形态。
在优选实施方案中，所述UVB局部给药，例如，通过光照射，例如，UVB辐射。
所述融合多肽和/或UVB可在疾病活动期，或在缓解期或亚活动期给药。
从另一角度，本发明以治疗或预防受试者的病症，例如炎症病症的方法为特征。所述炎症病症可为慢性炎症病症，例如，以T细胞，例如，Th1-型细胞的活性或增殖异常(例如增高)为特征的慢性炎症病症，所述方法包括给药受试者所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，本文所述的抑制物，结合辅助剂，例如本文所述的制剂，从而治疗或预防所述慢性炎症病症。
在优选实施方案中，所述方法还包括监测细胞因子(例如IFNγ)水平的变化，或免疫细胞群体((例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；或生成IFNγ的免疫细胞)的变化的步骤。其中细胞因子，例如IFNγ水平，或免疫细胞群体的下降为所述受视者病症改善的指示。
在优选实施方案中，所述慢性炎症病症是牛皮癣。
从另一角度，本发明以治疗或预防受试者患的自身免疫病症的方法为特征。所述自身免疫病症可为以T细胞，例如，Th1-型细胞的活性或增殖异常(例如增高)为特征的慢性自身免疫病症。所述方法包括给药受试者所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如本文所述的抑制物，与辅助剂结合，例如本文所述的制剂，从而治疗或预防所述自身免疫病症。
在优选实施方案中，所述方法还包括监测细胞因子(例如IFNγ)水平变化，或免疫细胞群体((例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；或生成IFNγ的免疫细胞)的变化的步骤。其中细胞因子，例如IFNγ水平，或免疫细胞群体的下降为所述受试者病症改善的指示。
在优选实施方案中，所述自身免疫病症是牛皮癣，糖尿病，关节炎(包括类风湿关节炎，青年类风湿关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎)，多发性硬化，脑脊髓炎，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自身免疫甲状腺炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)。
在优选实施方案中，所述自身免疫病症累及在体表或接近体表的细胞，组织或器官，例如，表皮，皮肤，眼睛，口腔，和/或鼻咽粘膜。在其它实施方案中，所述自身免疫病症会累及可利用递送装置，例如内窥镜或针接近的细胞，组织或器官。
在优选实施方案中，所述自身免疫病症选自牛皮癣或皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)。
从另一角度，本发明以治疗或预防受试者的牛皮癣的方法为特征。此法包括给药受试者所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，CD2-结合剂，结合选自辐射组的制剂(例如，UVB或PUVA辐射)，氨甲蝶呤，类维生素A(例如，口服类维生素A)和环孢素，从而治疗或预防牛皮癣。
在优选实施方案中，所述制剂为辐射，例如UVB辐射。
从又另一角度，本发明以调节(例如降低)T细胞(例如记忆性效应T淋巴细胞(例如，CD8/CD45 RO+细胞或CD4/CD45 RO+细胞)；或IFNγ-生成的免疫细胞)的活性或增殖的方法为特征。所述方法包括使所述T细胞与足够量的CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，CD2-结合剂相接触，结合辅助剂，例如，足够量的本文所述的制剂来调节，例如降低所述T细胞活性或增殖。
所述测试方法可用于无细胞环境(例如，重构系统)，细胞培养物，例如在体外或回体(ex vivo)(例如含有T细胞的培养物)。例如，细胞可在体外培养基中培养并将如本文所述的抑制物和/或制剂引入此培养基中。在其它实施方案中，所述T细胞可在接触步骤前与受试者分开。之后该处理后的细胞再返回到受试者。或者，此法可在受试者中存在的细胞上操作，例如，作为体内实验(例如，治疗或预防性)疗法方案的一部分。
从另一角度，本发明的特征在于一种组合物(例如，药物组合物)。该组合物包括所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，本文所述的CD2/LFA-3相互作用的抑制物，结合辅助剂，例如本文所述的制剂，以及药学上可接受的载体。
从另一角度，本发明包括一种试剂盒，该试剂盒包括CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，本文所述的CD2/LFA-3相互作用的抑制物，与其组合的辅助剂，例如本文所述的制剂，或者关于如何应用这些制剂的组合的使用说明书。
在优选实施方案中，所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物为LFA-3/Ig融合多肽。优选，所述LFA-3/Ig融合多肽为冻干的。
其他本发明的特征和优点将在如下具体说明和权利要求书中更为显而易见。
附图简述图1描述了LFA-3/IgG融合蛋白的氨基酸和核苷酸序列。此信号肽对应图1的氨基酸1-28；该成熟LFA-3区对应图1氨基酸29-120；且IgG1区对应图1氨基酸121-351。
具体实施方案为了便于更容易理解本发明，首先定义某些术语。附加定义在具体说明书中阐述。
本文所用术语“CD2”为与天然形成LFA-3多肽相互作用(例如结合)的CD2多肽，其具有或与在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ ID NO5所示的氨基酸序列同源(例如，至少85％同源)。或者该CD2多肽编码自(a)天然形成的哺乳动物CD2核酸序列(例如，在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ ID NO5)；(b)天然形成的CD2核酸序列的简并核酸序列；(c)至少与天然形成哺乳动物CD2核酸序列(例如在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ ID NO5)85％同源的核酸序列；或(d)与前述核酸序列之一在等同于低于Tm温度大约20℃-27℃，1M氯化钠的条件杂交的核酸序列，例如，与前述核酸序列之一在严格条件下例如在十分严格的条件下杂交的核酸序列。
本文所用术语“LFA-3”为与天然形成的CD2多肽结合的LFA-3多肽，其具有或与在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列同源(例如，至少85％同源)。或者该多肽编码自(a)天然形成的哺乳动物LFA-3核酸序列(例如，在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQID NO1或SEQ ID NO3)；(b)与天然形成的LFA-3核酸序列的简并核酸序列；(c)至少与天然形成哺乳动物LFA-3核酸序列(例如在此引入作为参考的U.S.6,162,432的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3)85％同源的核酸序列；或(d)与前述核酸序列之一在等同于低于Tm温度大约20℃-27℃，1M氯化钠的条件杂交的核酸序列，例如，与前述核酸序列之一在严格条件下例如在十分严格的条件下杂交的核酸序列。
术语“CD2-结合剂”为与CD2相互作用(例如，结合)的制剂，并优选调节(优选降低)所述CD2/LFA-3相互作用和/或调节CD2信号。CD2-结合剂举例包括天然形成CD2配体的可溶性LFA-3结合片段；LFA-3或其CD2结合片段与另一种蛋白或多肽(例如，免疫球蛋白或其片段)的可溶性融合物，即LFA-3/CD2融合多肽；结合CD2的抗体，例如重组抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，CDR-嫁接的抗体，人源化抗体，人或啮齿动物的抗体；以及小分子或模拟肽。
术语“LFA-3-结合剂”为与LFA-3相互作用(例如，结合)的制剂，并优选调节(优选降低)所述CD2/LFA-3相互作用和/或调节LFA-3信号。LFA-3-结合剂举例包括天然形成LFA-3配体的可溶性CD2结合片段；CD2或其LFA-3结合片段与另一种蛋白或多肽(例如，免疫球蛋白或其片段)的可溶性融合物，即LFA-3/CD2融合多肽；结合LFA-3的抗体，例如重组抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，CDR-嫁接的抗体，人源化抗体，人或啮齿动物的抗体；以及小分子或模拟肽。
术语“LFA-3/IgG”融合多肽为包括LFA-3序列的融合多肽，该LFA-3序列结合了CD2和全部或部分的免疫球蛋白序列，例如，与Fc受体相互作用的免疫球蛋白序列的一部分。所述LFA-3序列可为全长LFA-3或其CD2-结合片段。在优选实施方案中，此LFA-3序列为人LFA-3，并优选与受试者一个或两个等位基因相同的序列。其他实施方案可包括被修饰的LFA-3序列，例如与人LFA-3序列相异至少1个，但少于3，4，5或6个残基的LFA-3序列。(所述人LFA-3的完整氨基酸序列被发现存在于引入作为参考的US6,162,432的SEQ ID NO1或3上)。特别优选的LFA-3/IgG融合蛋白编码自具有SEQ IDNO7所示的核苷酸序列的核酸，并具有SEQ IDNO8所示的氨基酸序列，所述SEQ ID NO7和8见在此引入作为参考的US6,162,432。而另一优选的LFA-3/IgG融合蛋白(也参见本文的“大的剪切产物”)具有图1所示的氨基酸序列，并由相同图所示的核苷酸序列来编码。所述信号肽对应图1氨基酸1-28；所述成熟LFA-3区对应图1氨基酸29-120；所述IgG1区对应图1氨基酸121-351。
本文所用术语“可溶性的LFA-3多肽”或“可溶性的CD2多肽”为不能自身锚定在生物膜上的LFA-3或CD2多肽。所述可溶性的多肽包括，例如，CD2和LFA-3多肽，它们缺乏使该肽锚定的充分的跨膜结构域部分或已被修饰从而使跨膜结构域无功能。本文所用可溶性的LFA-3多肽包括全长或截短(例如具有内部缺失)的PI-连接的LFA-3。
本文所用术语“抗体同系物”为包含一种或多种多肽的蛋白，所述多肽选自可结合一个或多个抗原的免疫球蛋白轻链，免疫球蛋白重链及其抗原结合片段。由一个以上多肽组成的抗体同系物的所述组成多肽可任选为二硫键-连结或者为共价交联。从而，抗体同系物包括IgA，IgG，IgE，IgD，IgM型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的轻链可为kappa或lambda型。抗体同系物也包括保留抗原结合特异性的完整免疫球蛋白的部分，例如Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段，重链单体或二聚体，轻链单体或二聚体，含有一个重链和一个轻链的二聚体，等等。
本文所用术语“人源化重组抗体同系物”为通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中结合抗原所需的人免疫球蛋白轻链或重链上的一些或所有氨基酸已为非人哺乳动物免疫球蛋白的轻链或重链上对应的氨基酸所取代。
本文所用术语“嵌合重组抗体同系物”为通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中免疫球蛋白轻链，重链或两者的铰链和恒定区的全部或部分已经为另一免疫球蛋白轻链或重链的对应区所取代。
与本文公开的序列相近或同源(例如至少具有约85％序列同一性)的序列也是本申请中的一部分。在一些实施方案中，该序列同一性可为大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。或者，当所述核酸片段在选择杂交条件(例如非常严格杂交条件)下与该链的互补链杂交，此两条链存在基本同一性。所述核酸可在整体细胞中，在细胞溶解物中，或以部分纯化或基本纯的形式存在。
两个序列间的“同源性”或“序列同一性”(此术语在本文可以互换)计算按如下进行。为了最适比较的目的将所述序列比对(例如，为最佳比对向第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个引入间隙，非同源序列可忽略不作比较之用)。在优选实施方案中，做比较用的参照比对序列的长度至少是所参照序列长度的30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，并再更优选至少70％，805，905，100％。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置上的所述氨基酸残基或核苷酸。当所述第一序列的位置为第二序列的对应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸所占据，在那个位置上的此分子是相同的(在本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”)。考虑到所述两个序列最佳比对所需引入的间隙的数量，和每个间隙的长度，所述两个序列的同一性百分比是这些序列所共有的相同位置的数量的函数。
所述序列比较及两个序列间同一性百分比的确定可用数学算法来完成。在优选实施方案中，此两个氨基酸序列的同一性百分比可用被合并入GCG软件包中的GAP程序(可从http//www.gcg.com获得)Needleman和wunsch((1970)J.Mol.Biol.48444-453)算法来测定。该算法应用Blossum 62矩阵或者PAM250矩阵，其间隙权重(weight)16，14，12，10，8，6或4，其长度权重1，2，3，4，5或6。在另一优选实施方案中，两个核苷酸序列的同一性百分比用GCG软件包中的GAP程序(可从http//www.gcg.com获得)来测定，应用NWSgapdna.CMP矩阵，且间隙权重为40，50，60，70或80，长度权重为1，2，3，4，5，或6。特别优选的参数组(此参数适用于，当操作者不确定应该用什么参数来测定一个分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制范围内的时候)为Blossum 62评分矩阵，其间罚隙罚分为12，间隙延长罚分为4，移码间隙罚分为5。
本文所用术语“同源的”与“相似性”同义，所指为所需序列由于存在一或多个氨基酸取代(尽管modest氨基酸插入或缺失也可能存在)与参照序列相异。现在计算与参照序列的同源性或相似性程度的优选方法是通过应用BLAST和Pfam算法。此二者都可以通过华盛顿大学的http//blast.wustl.edu和http//ffam.wustl.edu得到，其中每个都使用算法的缺省值或推荐参数来测定测试序列相关的显著性。两个氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比也可用E.Meyers和W.miller((1989)CABIOS，411-17)的算法来测定，已被合并入ALIGN程序(2.0版)的这二种算法使用PAM120权重残基表，其间隙长度罚分为12，间隙罚分为4。
本文所用术语“在严格条件下杂交”描述了杂交及洗涤的条件。对于本领域技术人员严格条件是已知的并可在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6上找到。那篇参考文献已描述了水或非水方法，且每种都可以应用。优选的严格杂交条件举例为，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，约45℃杂交，其后在0.2XSSC，0.1％SDS，50℃洗涤一次或多次。另一严格杂交条件的举例为，在6XSSC，大约45℃杂交，其后在0.2XSSC，0.1％SDS，55℃洗涤一次或多次。又一严格杂交条件的举例为，在6XSSC，大约45℃杂交，其后在0.2XSSC，0.1％SDS，60℃洗涤一次或多次。优选地，严格杂交条件为，在6XSSC，大约45℃杂交，其后在0.2XSSC，0.1％SDS，65℃洗涤一次或多次。特别优选高度严格条件(此条件适用于，当操作者不确定应该用什么条件来测定一个分子是否在本发明的杂交限制范围内的时候)为0.5M磷酸钠，7％SDS，65℃，其后在0.2XSSC，1％SDS，65℃洗涤一次或多次。
须知本发明的所述多肽可有附加的对多肽功能无实质本影响的保守或非必需氨基酸取代。是否特定取代会被耐受，即不对所需生物特性，如结合活性有不良影响可如在Bowie，JU等(1990)Science 2471306-1310)所描述的那样来测定。
“保守氨基酸取代”所指为氨基酸残基为具有相似侧链的氨基酸残基所置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域被确定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β-分支例链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
“非必需”氨基酸残基是指可从杂交抗体的野生型序列变化而不消除生物活性，或更优选，基本不改变生物活性的氨基酸残基。相对而言，“必需”氨基酸残基会导致此种改变。
皮肤病症本发明所述方法是用于通过给药所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物来预防或治疗哺乳动物，例如灵长类，或人的以在皮肤和表皮的T细胞激活增加和抗原呈递异常为特征的皮肤病症。所述病症包括牛皮癣，UV损伤，特应性皮炎，皮肤T细胞淋巴瘤，如毒蕈样霉菌病，变应性接触性皮炎和刺激性接触性皮炎，扁平苔藓，脱发，例如局限性脱发，坏疽性脓皮病，白癜风，眼类天疱疮样瘢痕和荨麻疹。须知治疗和预防皮肤病症，如坏疽性脓皮病和荨麻疹的方法包括在本发明的范围内。后者这些皮肤病症也是环孢素A敏感性皮肤病，因而涉及T细胞激活。优选，本发明所述方法用于牛皮癣，特应性皮炎，变应性皮炎，或局限性脱发，更优选地，牛皮癣的预防或治疗。
本发明所述方法可用于任意受试者，例如哺乳动物，优选人。本文所用术语“受试者”可包括人类和非人类的动物。优选的人类动物包括患有以皮肤和表皮的T细胞激活增加和抗原呈递异常为特征的皮肤病症的人类患者。本发明的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人类灵长类(特别高等灵长类)，绵羊，狗，啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，豚鼠，山羊，猪，猫，兔子，牛，和非哺乳动物，如鸡，两栖动物，蜥蜴等等。
CD2/LFA-3相互作用的抑制物任意CD2/LFA-3相互作用的抑制物在本发明的方法中都是可用的。这些抑制物包括抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2抗体同系物，可溶性的LFA-3多肽，可溶性的CD2多肽，小分子，例如(例如，分子量小于2500Da优选小于1500Da的化学制剂，化学制品，例如小有机分子，例如，组合文库的产物)，LFA-3和CD2模拟制剂及其衍生物。优选抑制物为可溶性的LFA-3多肽和抗-LFA-3抗体同系物。
特异性可溶性的CD2多肽，可溶性的LFA-3多肽，抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2抗体同系物或CD2和LFA-3模拟制剂在本发明方法中的应用，可很容易通过测定它们抑制LFA-3/CD2相互作用的能力来确定。此种能力可用例如，简单的细胞结合试验来测定，该试验可用视觉(在放大情况下)评估此假定抑制物抑制LFA-3和CD2分子在含有这些分子的细胞上相互作用的能力。Jurkat细胞优选作为CD2+的附着物(substrate)，而绵羊红细胞或人类JY细胞优选作为LFA-3+的附着物。在本发明中可用的所述可溶多肽，抗体同系物和模拟物的结合性质可用一些已知方法测定，如通过放射标记抗体同系物，多肽或制剂(例如35S或125I)然后使所述标记多肽，模拟物或抗体同系物与LFA-3+细胞的CD2+适当接触。也可用适宜的酶标第二抗体来测定结合性质。还可应用如Seed等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.3365-69(1987))描述的那些玫瑰花结竞争试验来测定。
抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物本发明方法中很多型抗-LFA-3或抗-CD2抗体同系物都是可用的。这些包括单克隆抗体，重组抗体，嵌合重组抗体，人源化重组抗体，和上述的抗原-结合部分。
在所述抗-LFA-3抗体同系物中，优选使用单克隆抗-LFA-3抗体。更优选应用由杂交瘤生产出的单克隆抗-LFA-3抗体或已知为TS2/9的单克隆抗体(Sanchez-Madrid等，“Three Distinct Antigens Associated with HumanT-Lymphocyte-Mediated CytolysisLFA-1，LFA-2 and LFA-3”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.7489-93(1982))。所述杂交瘤选自登录号为ATCC HB10693(1E6)，ATCC HB 10694(HC-1B11)，ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB10696(8B8)的杂交瘤。最优选，所述单克隆抗-LFA-3抗体由选自登录号为ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB 10693(1E6)的杂交瘤生产。
在所述抗-CD2抗体同系物中，优选使用单克隆抗-CD2抗体，如已知为T111表位的抗体的抗-CD2单克隆抗-CD2抗体，包括TS2/18(Sanchez-Madrid等，“Three Distinct Antigens Associated with HumanT-Lymphocyte-Mediated CytolysisLFA-1，LFA-2 and LFA-3”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.7489-93(1982))。
所述生产单克隆抗体的技术是已知的。简言之，将无限增殖细胞系(通常为骨髓瘤细胞)与来自用含有特定抗原的制品免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，然后所得杂交瘤细胞的培养物上清可用于筛选抗此种抗原的抗体。通常可参见Kohler等，Nature，“Continuous Cultures of FusedCells Secreting Antibody of Predefined Specificity”，256，pp.495-97(1975)。用于本发明目的的可用免疫原包括CD2-或LFA-3-携带细胞，及含有LFA-3，CD2或其对应的受体结合片段(例如，结合LFA-3的CD2片段或结合CD2的LFA-3片段)的无细胞制品。
可用标准步骤完成免疫。所述单位剂量和免疫方案依赖所免疫哺乳动物的种类，其免疫状态，哺乳动物的体重等等。通常，从免疫过的哺乳动物取血，用适宜的筛选试验测定每份血样品的血清中的特定抗体。例如，可用的抗-LFA-3或抗-CD2抗体可通过检测免疫血清对Jurkat细胞的绵羊红细胞玫瑰花结的阻遏能力得以鉴定，该玫瑰花结源于这些细胞各自表面上LFA-3和CD2的存在。生产淋巴瘤细胞所用的所述淋巴细胞通常分离自免疫过的哺乳动物，用此筛选试验已测定出所需抗体在该动物血清中的存在为阳性。
通常，该无限增殖细胞系(例如骨髓瘤细胞系)衍生自与淋巴细胞相同的哺乳动物种系。优选无限增殖细胞系为对含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)的培养基敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。
通常，用聚乙二醇(“PEG”)3350使HAT-敏感小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。之后可用HAT培养基来选择从融合所得的杂交瘤细胞，该培养基可杀死未融合的和无增殖性的融合的骨髓瘤细胞(未融合脾细胞因为它们未被转化在数日后死亡)。通过筛选杂交瘤培养上清可检测生产所需抗体的杂交瘤，例如通过筛选该上清结合到它们各自对应的受体的能力，或它们阻遏Jurkat细胞与绵羊红细胞粘着的能力。通常进行有限稀释来亚克隆所述杂交瘤培养物，以确保单克隆性。
为生产抗-LFA-3或抗-CD2单克隆抗体，将上述筛选试验中检测为阳性的杂交瘤细胞在营养培养基中，在足以使杂交瘤细胞分泌所述单克隆抗体到培养物培养基的条件下及时间内进行培养，对杂交瘤细胞适宜的组织培养技术及培养物培养基是已知的。可收集条件杂交瘤培养物上清，并通过众所周知的方法可选地继续纯化所需抗体。
或者，可通过向降植烷(pristane)致敏的小鼠的腹膜腔内注射杂交瘤细胞来生产所需抗体。所述杂交瘤细胞在腹膜腔中增殖，分泌抗体，该抗体在该抗体在腹水中累积。可通过用注射器从腹膜腔抽取腹水来收获所述抗体。
在本发明可用的抗-CD2和抗LFA-3抗体同系物也可为转化有DNA的宿主细胞所产生的重组抗体，该DNA编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链。重组抗体可用众所周知的基因工程技术生产。参见例如，在此引入作为参考的美国专利4,816,397。
例如，可通过克隆编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的cDNA或基因组DNA来生产重组抗体，该所需抗体来自可生产本发明可用的抗体同系物的杂交瘤细胞。所述编码那些多肽的cDNA或基因组DNA被插入表达载体从而两基因都可操作地与他们自己的转录和翻译表达控制序列相连接。选择的表达载体和表达控制序列要与所用的表达宿主相容。通常，两基因可插入同一个表达载体。
可用原核或真核宿主细胞。优选在真核宿主细胞中表达，因为此种细胞比原核细胞更容易组装并分泌适当折叠并有免疫活性的抗体。然而，任意所产生的由于不适当折叠而无活性的抗体可根据众所周知的技术来复性(Kim和Baldwin，“Specific Intermediates in the Folding Reactions of SmallProteins and the Mechanism of Protein Folding”，Ann.Rev.Biochem.，51，p.459-89(1982))。所述宿主细胞可能会产生完整抗体的一部分，如轻链二聚体或重链二聚体，根据本发明它们也是抗体同系物。
须知在本发明中可用上述方法的有所变化的方法。例如，用编码抗体同系物的轻链或重链(但不是两者都)的DNA转化宿主细胞是需要的。重组DNA技术也可用于去除一些或全部编码对CD2或LFA-3对应的受体结合所不需要的轻链和/或重链的DNA。从该截短的DNA分子表达的分子可用于本发明方法。另外，可生产双功能抗体，该抗体中一条重链和一条轻链为抗-CD2或抗-LFA-3抗体同系物，而另外的重链和轻链对除CD2或LFA-3以外的抗原，或CD2或LFA-3的其它表位具有特异性。
嵌合重组抗-LFA-3或抗-CD2抗体同系物可通过用合适表达载体转化宿主细胞来产生，该图达载体含有编码所需免疫球蛋白轻链和重链的DNA，其中全部或一些编码重链和/或轻链的铰链和恒定区的DNA被不同种属的免疫球蛋白轻链或重链的对应区域的DNA所取代。当原始重组抗体为非人类，且所述抑制物将给药于人时，优选取代对应的人类序列。嵌合重组抗体的实例为具有小鼠的可变区和人类的铰链和恒定区。通常参见美国专利4,816,397；Morris等，“Chimeric Human Antibody MoleculesMouseAntigen-Binding Domains With human Constant Region Domains”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.6851-55(1984))；Robinson等，International PatentPublication PCT/US86/02269；Akira等，European Patent Application 184，187；Taniguchi，M.，European Patent Application 171，496；Neuberger等，International Patent Application WO86/01533；Better等，(1988 Science2401041-1043)；Liu等，(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.NatlCancer inst.801553-1559)。
人源化重组抗-LFA-3或抗-CD2抗体可通过用人类Fv可变区的等同序列置换不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列来生产。通常生产人源化抗体的方法可参见Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4214，和Queen等US 5,585,089，US 5,693,761和US5,693,762。所有所述内容都在此引入本文作为参考。那些方法包括分离，操纵和表达编码全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列，所述Fv可变区来自重链或轻链的至少一个。所述核酸来源在本领域技术人员是已知的，例如可自产生抗-LFA-3或抗-CD2抗体的杂交瘤获得。然后可将编码所述人源化抗体或其片段的核酸克隆入适宜的表达载体。
人源化或CDR-移植抗体分子或免疫球蛋白可以通过CDR-移植或CDR取代来生产，其中免疫球蛋白链的一，二或所有CDR可被置换。参见例如美国专利5,225,539；Jones等1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等1988Science 2391534；Beidler等1988 J.Immunol.1414053-4060；Winter US5,225,539。所有所述内容都在此清楚引入本文作为参考。Winter介绍一种CDR-移植方法，可用于制备本发明的人源化抗体(英国专利申请GB2188638A，于1987年3月26日提交；Winter US 5,225,539)所述内容都在此清楚引入本文作为参考。具体的人类抗体的所有CDR都可以被非人类CDR的至少部分置换或只有一些CDR可被非人类CDR置换。只有置换使人源化抗体结合到预定抗原，例如LFA-3或CD2，所需数量的CDR才是必要的。
同样在本发明范围有人源化抗体，包括特异性氨基酸被取代，删除或添加的免疫球蛋白。特别地，优选的人源化抗体在框架区有氨基酸取代，如为了提高与抗原的结合。例如，人源化免疫球蛋白链上选择性的少量的受体框架残基可被对应的供体氨基酸置换。优选取代位置包括与CDR相邻的氨基酸残基，或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如，US5,585,089)。从供体选择氨基酸的标准见US 5,585,089，例如，US 5,585,089的12-16栏所述，其内容在此引入本文作为参考。其他使免疫球蛋白链，包括抗体人源化的技术的描述见1992年12月23日公开的Padlan等EP 519596A1。
针对人LFA-3或CD2的人单克隆抗体(mAbs)可用携带完整的人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠来生产。这些用所需抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞可用于生产杂交瘤，该杂交瘤分泌对人蛋白的表位具有特异亲和力的人mAbs(参见例如，Wood等国际申请WO 91/00906，Kucherlapati等PCT公开WO 91/10741；Lonberg等国际申请WO 92/03918；Kay等国际申请92/03917；Lonberg，N.等1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等1994Nature Genet.713-21；M或rison，S.L.等1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等1993 Year Immunol 733-40；Tuaillon等1993PNAS 903720-3724；Bruggeman等1991 Eur J Immunol 211323-1326)。
也可用那些重组DNA技术领域的技术人员已知的其它方法来生产单克隆抗体。参照“组合抗体展示”方法，已经开发出一种可选方法，以鉴定并分离具有特定的抗原特异性的抗体片段，该方法还可用于生产单克隆抗体(对于组合抗体展示的描述，见例如，Sastry等1989 PNAS 865728；Huse等1989 Science 2461275；和Orlandi等1989 PNAS 863833)。如上所述在用免疫原免疫动物之后，克隆所得B细胞库的所述抗体的所有组成成分。众所周知获得不同群体免疫球蛋白分子可变区的DNA序列的方法是通过使用寡聚体引物的混合物和PCR。例如，与所述5′先导(信号肽)序列和/或框架1(FR1)序列对应的混合寡核苷酸引物，以及与保守3′恒定区对应的引物。所述引物可用于PCR扩增一些鼠抗体的重链和轻链可变区(Larrick等，1991，Biotechniques 11152-156)。也可用相似策略扩增人抗体的人重链和轻链可变区(Larrick等，1991，MethodCompanion to Method in Enzymology 2106-110)。
在例证性实施方案中，用标准流程从B淋巴细胞分离RNA，例如，外周血细胞，骨髓，或脾制品(例如，美国专利4,683,202；Orlandi，等PNAS(1989)863833-3837；Sastry等，PNAS(1989)865728-5732；和Huse等(1989)Science 2461275-1281)。合成cDNA第一链所用引物为对所述重链及每个所述的旰碗轻链的恒定区特异的引物，以及对信号序列特异的引物。用可变区的PCR引物，可单独或一起扩增重链和轻链的所述可变区，之后连接入适宜载体以继续操作生产所述展示性包装物。扩增流程中可用的寡核苷酸引物可以是独特的或简并的或在简并位置引入肌苷。也可将限制性内切酶识别序列引入所述引物以使该扩增片段被克隆入载体的预定阅读框架从而被表达。
从所述免疫-衍生抗体的所有组成成分克隆的V-基因文库可用一群展示性包装物，优选丝状噬菌体衍生的展示性包装物来表达，以形成抗体展示文库。理想地，所述展示性包装包含一系统，其可从很大的有斑(variegated)抗体展示文库取样，在每轮亲和分离后迅速分类，并从纯化的展示性包装物容易地分离所述抗体基因。除了可生产噬菌体展示文库的商品化的试剂盒(例如，the Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录no.27-9400-01；及theStrataGene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录no.240612)之外，特别适用于生产有斑抗体展示文库的方法和试剂的例子可见，例如，Ladner等美国专利5,223,409；Kang等International Publication No.WO 92/18619；Dower等International Publication No.WO 91/17271；Winter等International PublicationWO 92/20791；Markland等International Publication No.WO 92/15679；Breitling等International Publication WO 93/01288；McCafferty等International Publication No.WO 92/01047；Garrard等InternationalPublication No.WO 92/09690；Ladner等International Publication No.WO90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等(1992)HumAntibod Hybridomas 381-85；Huse等(1989)Science 2461275-1281；Griffths等(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol 226889-896；Clackson等(1991)Nature 352624-628；Gram等(1992)PNAS 893576-3580；Garrad等(1991)Bio/technology 91373-1377；Hoogenboom等(1991)NucAcid Res 194133-4137；and Barbas等(1991)PNAS 887978-7982。
在某些实施方案中，重链和轻链的所述V区结构域可在同一多肽表达，用灵活的连接子连接以形成单链Fv片段，之后将所述scFV基因克隆入所需表达载体或噬菌体基因组中。如通常McCafferty等，Nature(1990)348552-554所述，用灵活的(Gly4-Ser)3连接子连接的抗体的完整VH和VL结构域，可用于生产能使展示包装基于抗原亲和力可分离的单链抗体。之后与所述抗原免疫反应的分离的scFV抗体可配制成药物制品用于被试方法。
所述抗体文库一旦在展示包装(例如，丝状噬菌体)的表面展示，就用所述抗原或其肽片段进行筛选，以鉴定并分离表达对所述抗原具有特异性的抗体的包装。可从所述展示包装(例如，从噬菌体基因组)回收编码所选抗体的核酸并通过标准重组DNA技术将其亚克隆至其它表达载体。
可根据本领域技术人员已知的方法生产对表面蛋白具有高亲和力的特异性抗体，所述方法例如，包括文库筛选的方法(Ladner，R.C.，等，美国专利5,233,409；Ladner，R.C.，等，美国专利5,403,484)。所述的这些文库方法还可用于筛选以获得作为抗体结构决定簇模拟物的结合决定簇。
具体地，特定抗体分子的Fv结合表面根据蛋白-蛋白相互作用原理与其靶配体相互作用，因而VH和VL(后者可能为κ或λ链型)的序列数据是本领域技术人员已知的蛋白工程技术的基础。所述包含结合决定簇的蛋白表面的细节，可通过应用自NMR研究或晶体学数据获得的其它抗体的业已确定的三维结构的模型步骤(modeling procedure)，从抗体序列信息获得。见例如Bajorath，J.and S.Sheriff，1996，ProteinsStruct.，Funct.，and Genet.24(2)，152-157；Webster，D.M.and A.R.Rees，1995，“Molecular modeling ofantibody-combining sites，”S.Paul，Ed.，Methods in Molecular Biol.51，Antibody Engineering Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，pp 17-49；andJohnson，G，Wu，T.T.and E.A.Kabat，1995，″SeqhuntA program to screenaligned nucleotide and amino acid sequences，″Methods in Molecular Biol.51，op.cit.，pp 1-15。
也可用已述方法筛选具有所需结合活性的多种组合文库以获得抗原结合区，并鉴定活性种类。
在一个实施方案中，用一群展示包装表达有斑肽文库以形成肽展示文库。
理想地，所述展示包装包含一系统，该系统允许从很大的有斑肽展示文库取样，在每轮亲和分离后迅速分选，并从纯化的展示包装中容易地分离到编码所述肽的基因。肽展示文库可在，例如，可迅速扩增的，相对容易操作的，并可生成大量克隆的原核生物和病毒内。优选的展示包装包括，例如，植物(vegetative)细菌细胞，细菌芽孢，和最优选的细菌病毒(特别是DNA病毒)。然而，本发明也考虑应用真核细胞，包括将酵母及它们的孢子作为潜在的展示包装。噬菌体展示文库如上所述。
其它技术包括用适宜″受体″分离结合剂的亲和层析，之后用常规技术(例如，质谱分析法和NMR)鉴定分离的结合剂或配体。优选地，所述可溶受体与标记(例如，荧光团，比色酶，放射性同位素，或发光化合物)偶联，从而可被检测以指示配体的结合。可选，固定的化合物可被选择性释放并扩散过膜以与受体相互作用。
合成化合物的组合文库也可用“标签”来破译所述文库(见例如，W.C.Still等，国际申请WO 94/08051)中每个成员的身份(identity)。通常，此种方法限定使用附着在固体支持物或所述化合物上的，无惰性的但却容易检测的标签。当检测活性化合物时，通过鉴定独特的相伴随的(accompanying)标签来确定所述化合物的身份。此种标签方法可合成大的化合物文库，该文库中的部分或所有化合物在很低的水平都可鉴定。
为不完整抗体的抗-CD2和抗-LFA-3抗体同系物在本发明也可用。这些同系物可衍生自任意上述抗体同系物。例如，抗原-结合片段，以及衍生自上述可用抗体的全长单体，二聚体或三聚体多肽。这种可用抗体的同系物包括(i)Fab片段，包含VL，VH，CL和CH1结构域的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含用二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其包含VH和CH1结构域；(iv)Fv片段，其包含抗体单臂的VL和VH结构域(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，其包含VH结构域；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)。而且，尽管所述Fv片段的两个结构域，VL和VH，为分离的基因所编码，可以用重组方法用合成的连接子连接它们使成为一个单蛋白链，其中所述VL和VH区配对形成一价分子(已知为单链Fv(scFv)；见例如，Bird等(1988)Science 242423-426；及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8558795883)。此种单链抗体应该包括在术语抗体的“抗原-结合片段”中。这些抗体片段是用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且此片段被筛选从而以同种方式象完整抗体一样被应用。抗-LFA-3重链是优选的抗-LFA-3抗体片段。
抗体片段也可用化学方法生产，例如，通过用蛋白酶，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶剪切完整的抗体，并可选用还原介质处理所剪切产物。可选，可用片段可用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞来生产。可通过用还原介质，如二硫苏糖醇，处理完整抗体，之后通过纯化分离所述链，来生产重链和轻链单体。也可用编码所需重链或轻链(但不是两者都)的DNA转化的宿主细胞生产重链和轻链单体。见例如，Ward等，“Binding Activitiesof a Repertoire of SingleImmunoglobulin Variable Domains SecretedEscherichia coli”，Nature，341，pp.544-46(1989)；Sastry等，“Cloning of theImmunological Repertoire in Escherichia coli for generation of monoclonalCatalytic AntibodiesConstruction of a Heavy chain Variable Region-SpecificcDNA Library”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，pp.5728-32(1989)。
可溶性的CD2和LFA-3多肽本发明方法可用抑制所述LFA-3和CD2相互作用的可溶性的LFA-3多肽或可溶性的CD2多肽。优选可溶LFA-3多肽。
可溶性的LFA-3多肽可衍生自LFA-3的跨膜形式，特别是胞外结构域(例如，在此引入本文作为参考的US 6,162,432的SEQ ID NO2的AA1-AA187)。此种多肽见引入本文作为参照的美国专利4,956,281及共有的处于审查过程中的美国专利申请序列号07/667,971(与本申请共享一个受让方(assignee))所述。优选可溶性的LFA-3多肽包括由SEQ ID NO2的AA1-AA92，SEQ ID NO2的AA1-AA80，SEQ ID NO2的AA50-AA65和SEQID NO2的AA20-AA80组成的多肽，其中SEQ ID NO2见引入本文作为参考的US 6,162,432所示。含有编码SEQ ID NO2(例如，SEQ ID NO1)的DNA序列的载体保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland登录号75107，其中SEQ ID NO1和2见在此引入作为参考的US 6,162,432所示。
最优选的这种融合蛋白含有成熟LFA-3氨基末端的92个氨基酸，包含认为参与链内二硫键的两个半胱氨酸残基的人IgG1铰链区的C-末端的10个氨基酸，还有人IgG1重链恒定结构域的CH2和CH3区(例如，SEQ IDNO8)。这种融合蛋白参见本文的“LFA3TIP.”编码举例LFA3TIP的质粒pSAB 152保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，登录号ATCC 68720。所述pSAB152插入子的DNA序列为SEQ ID NO7。SEQ IDNO7和8见在此引入作为参考的US 6,162,432所示。
比U.S.6,162,432所示更长的LFA-3TIP的剪切变体的氨基酸和核苷酸序列见图1。所述较长LFA-3TIP变体的信号肽对应图1的氨基酸1-28；所述成熟LFA-3区对应图1的氨基酸29-120；而且所述IgG1区对应图1的氨基酸121-351。此LFA-3TIP的较长剪切变体通过将六个氨基酸加到C-末端而与较短变体不同。
本发明的方法所用的一种生产LFA3TIP的方法见共同待审，一般转让的美国专利申请顺序号码07/770,967所述。通常，用pSAB152转染的COS7或CHO细胞的条件培养基用AMICON S1Y30 spiral cartridge系统(AMICON，Danvers，Massachusetts)浓缩后，将其用蛋白A-Sepharose 4B(Sigma，St.Louis，Missouri)层析法处理。洗脱所结合的蛋白并用Superose-12(Pharmacia/LKB，Piscataway，New Jersey)凝胶过滤层析法处理。
如SDS-PAGE胶和通过蛋白质印迹法分析所确定，含有最少量污染蛋白的LFA3TIP的Superose-12级分(见例如，Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，pp.4350-54(1979)；AntibodiesA Laboratory Manual，pp.474-510(Cold Spring Harb或Laboratory(1988))被汇集并在YM30 Centricon(AMICON)中浓缩。LFA3TIP可用兔抗-LFA-3多克隆抗血清，其后用可检测的标记的山羊抗-兔IgG，用蛋白质印迹法来检测。所述纯化的COS7或CHO细胞的LFA3TIP为两个单体的LFA-3-Ig融合蛋白用二硫键所连接的二聚体。
另一个优选融合蛋白含有融合到所述人IgG1的铰链CH2和CH3区的第一和第二LFA-3结构域，在此参照LLFA3-Ig。
可溶性的LFA-3多肽也可衍生自所述LFA-3的PI-连接形式，如PCT专利申请序号WO 90/02181所述的那些。含有编码PI-连接的LFA-3的DNA序列(例如，SEQ ID NO3)的载体保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland登录号68788。须知所述LFA-3的PI-连接形式和所述LFA-3的跨膜形式具有同一的通过完全胞外结构域的氨基酸序列。相应地，优选的PI-连接LFA-3多肽与所述LFA-3的跨膜形式的多肽是相同的。
可溶性的CD2多肽可衍生自全长CD2，特别是所述胞外结构域(例如，SEQ ID NO6的AA1-AA185)。所述多肽可包含CD2的全部或部分的胞外结构域。举例可溶性的CD2多肽见在此引入本文作为参照的PCT WO90/08187所述。
可用很多本领域各种已知的方法生产本发明可用的可溶多肽。例如，所述多肽可通过用特异性内肽酶结合外肽酶作蛋白水解，Edman降解，或两者都用，衍生自完整跨膜LFA-3或CD2分子或完整的PI-连接LFA-3分子。所述的完整LFA-3分子或完整CD2分子，可用常规方法纯化自其天然来源。可选，所述的完整LFA-3或CD2可用使用cDNAs的已知重组DNA技术(见例如，美国专利4,956,281 Wallner等；Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.，84，pp.2941-45(1987)；Sayre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.2941-45(1987))来生产。
优选，直接生产所述本发明可用的可溶多肽，从而消除了用完全LFA-3分子或完全CD2分子作为开始物质的需要。可通过常规的化学合成技术或通过众所周知的重组DNA技术完成，其中只有那些编码所需肽的DNA序列在转化的宿主中表达。例如，用应用寡核苷酸合成子的化学方法合成编码所需可溶性的LFA-3多肽或可溶CD2多肽的基因。基于所需可溶性的LFA-3多肽或可溶CD2多肽的氨基酸序列设计所述寡核苷酸。编码所需肽的特定DNA序列也能通过分离特异性限制性内切酶片段或通过所述特定区的PCR合成衍生自其全长DNA序列。
可用标准方法合成编码本发明可用的可溶性的LFA-3多肽或可溶性的CD2多肽的基因。例如，所述完全的氨基酸序列可用于构建反-翻译基因(back-translated gene)。含有编码本发明可用的可溶性的LFA-3多肽或可溶性的CD2多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体可一步合成。可选，合成编码部分所需多肽的几个较小寡核苷酸之后将其连接。优选，本发明可用的可溶性的LFA-3多肽或可溶性的CD2多肽将被合成为几个分开的寡核苷酸，最后将其连接在一起。单个寡核苷酸通常包含5′或3′突出端以作互补装配。
一旦装配，优选的基因的特征就在于可被限制性内切酶识别的序列(包括直接装配入克隆或表达载体的特别限制位点)，考虑到所用宿主的表达系统优选的密码子和转录时生产稳定高效翻译的mRNA的序列。可用核苷酸测序，限制性图谱和在适宜宿主表达生物活性多肽来确认适宜的装配。
如本领域技术人员所理解的那样，由于遗传密码简并性，包含很多其它核苷酸序列的DNA分子也能够编码上述特定DNA序列所编码的可溶LFA-3和CD2多肽。这些简并序列也编码本发明可用的多肽。
该DNA序列可在单细胞宿主表达。本领域众所周知的是，为获得转染基因在宿主中的高表达水平，该基因必须可操作地与在所选表达宿主中有功能的转录和翻译的表达控制序列相连接。优选，所述表达控制序列和所需基因将包含在还进一步含有细菌选择标记和复制起始点的表达载体中。如所述表达宿主为真核细胞，该图达载体还应包含表达宿主可用的附加的表达标记。
编码所需可溶多肽的DNA序列可编码或不编码信号序列。如果表达宿主为原核生物，通常优选不编码信号序列的DNA序列。如果表达宿主为真核生物，通常优选编码信号序列的DNA序列。
氨基末端的甲硫氨酸可在或不在表达产物上。如果所述末端甲硫氨酸未被所述表达宿主剪切，如果需要可用标准技术将其用化学方法去除。
可应用各种表达宿主/载体的组合。对真核生物宿主可用的表达载体包括，例如，含有SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对细菌宿主可用的表达载体包括已知细菌质粒，如来源于大肠杆菌的质粒，包括col E1，pCR1，pBR322，pMB9和它们的衍生物，较宽宿主范围的质粒，如RP4，噬菌体DNA，例如，噬菌体λ的许多衍生物，例如，NM989和其它DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。对酵母细胞可用的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。对昆虫细胞可用的载体包括pVL 941。
另外，各种表达控制序列的任一种都可用于这些载体。此种可用表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相连的表达控制序列。可用表达控制序列的范例包括，例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC或TRC系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd被膜蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，例如，Pho5，所述酵母α-交配系统的启动子和已知控制原核生物或真核生物细胞或它们的病毒表达的其它序列，及它们的各种组合。
可用各种单细胞宿主细胞。这些宿主可包括众所周知的真核生物和原核生物宿主，如以下各属的菌株大肠杆菌属，假单胞菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属，真菌，酵母的菌株，昆虫细胞如草地夜蛾(SF9)，动物细胞如CHO和小鼠细胞，非洲绿猴细胞如COS 1，COS 7，BSC 1，BSC 40，和BMT 10，和人细胞，以及组织培养物中的植物细胞。为动物细胞表达，我们优选CHO细胞和COS 7细胞。
当然应该理解并非所有载体和表达控制序列都功能同样良好地表达本文所述DNA序列。也不是存在同一表达系统的所有宿主都能同样良好地行使功能。然而，本领域技术人员可在无不恰当实验的情况下对这些载体，表达控制序列和宿主中做选择。例如，选择载体时须考虑所述宿主，因为所述载体必须在其中复制。也应考虑所述载体的拷贝数，其控制所述拷贝数的能力，和任一由所述载体编码的其它蛋白的表达，如抗生素标记。
选择表达控制序列时，也应考虑各种因素。这些因素包括，例如，所述序列的相对强度，其可控性，及其与在此讨论的DNA序列，特别在考虑到潜在的二级结构时的相容性。选择单细胞宿主应考虑到它们与所选载体的相容性，所述DNA序列编码的产物的毒性，它们的分泌特征，它们正确折叠所述可溶多肽的能力，它们的发酵或培养条件，和由所述DNA序列编码的产物的纯化的容易性。
在这些参数中，本领域技术人员可选择各种在发酵物或大规模动物培养物中(例如用CHO细胞或COS 7细胞)，表达所需DNA序列的载体/表达控制序列/宿主的组合。
所述可溶LFA-3和CD2多肽可从所述发酵物或细胞培养物分离并用任一种常规方法纯化。本领域技术人员可选择最适宜的分离和纯化技术。
重组DNA技术为生产具有多于20个氨基酸的序列的有用的可溶性的CD2多肽或可溶性的LFA-3多肽的优选方法，而具有少于大约20个氨基酸的较短的CD2或LFA-3多肽优选用常用的化学合成技术来生产。本发明合成产生的可用的多肽可有利地以极高产量生产并易于纯化。
优选，所述可溶性的CD2多肽或可溶性的LFA-3多肽用溶液相或固相多肽合成法来合成，并且可选用羧肽酶来消化(去除C-末端氨基酸)或通过人工Edman降解法来降解(去除N-末端氨基酸)。所述多肽的适当折叠可如Kent，“Chemical Synthesis of Peptides and Proteins”，Ann.Rev.Biocherm.，57，pp.957-89(1988)所述，在对二硫桥形成有利的氧化条件下完成。以这种方式生产的多肽可用本领域广泛已知的分离技术纯化，优选应用反相HPLC。应用溶液相合成法可有利地使某些衍生的氨基酸如酪氨酸的O-硫酸酯直接添加到延长的多肽链。这就避免了之后对本发明可用多肽的任一残基进行修饰的衍生步骤的必要。
LFA-3和CD2模拟物或小分子制剂在本发明方法同样可用LFA-3和CD2模拟物。这些模拟物可为肽，半(semi)-肽化合物或非-肽化合物(例如，小有机分子)，其为所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物。优选的CD2和LFA-3模拟物在抑制CD2/LFA-3的相互作用上至少同抗-LFA-3单克隆抗体7A6或抗-CD2单克隆抗体TS2/18(如上所述)一样好。
在优选实施方案中，被测的模拟物为一组合文库成员，例如，肽或有机物的组合文库，或天然产物文库。在优选实施方案中，许多被测化合物，例如，文库成员，至少包括10，102，103，104，105，106，107或108个化合物。在优选实施方案中，多种被测化合物，例如，文库成员，有共同的结构或功能特征。
在一个实施方案中，本发明提供了LFA-3和/或CD2抑制物的文库。该组合文库的合成在本领域众所周知并见如下综述(参见例如，E.M.Gordon etal.，J.Med.Chem.(1994)371385-1401；DeWitt，S.H.；Czarnik，A.W.Acc.Chem.Res.(1996)29114；Armstrong，R.W.；Combs，A.P.；Tempest，P.A.；Brown，S.D.；Keating，T.A.Acc.Chem.Res.(1996)29123；Ellman，J.A.Acc.Chem.Res.(1996)29132；Gorn，E.M.；Gallop，M.A.；Patel，D.V.Acc.Chem.Res.(1996)29144；Lowe，G.Chem.Soc.Rev.(1995)309，Bondelle et al.，Trends Anal.Chem.(1995)1483；Chen et al.，J.Am.Chem.Soc.(1994)1162661；美国专利5,359,115，5,362,899，和5,288,514；PCT公开号WO92/10092，WO93/09668，WO91/07087，WO93/20242，WO94/08051)。
本发明化合物的文库可根据各种方法制备，其中一些在本领域已知。例如，“分离-合并(split-pool)”策略可以如下方式实施将功能性多聚体支持物珠子置于数个反应容器中；已知各种适宜固相肽合成法的多聚体支持物，并且一些是可商购的(例如，参见例如，M.Bodansky“Principles ofPeptide Synthesis”，2nd edition，Springer-Verlag，Berlin(1993))。向每等份珠子加入不同的活化的氨基酸的溶液，并且使所述反应进行以产生数个固定化的氨基酸，一种氨基酸在一个反应容器中。洗涤所述等份的衍生珠子，并“合并”(即重组)，将合并的珠子再次分份，每等份置于不同的反应容器。之后向每等份珠子加入另外的活化氨基酸。重复所述合成循环直至获得所需的肽长度。可随机选择在每轮合成循环添加的氨基酸残基；可选，选择氨基酸以提供“偏向性的(biased)”文库，例如，非随机选择文库中某些抑制物部分，例如，提供一种抑制物，其与能够与抗体相互作用的已知肽具有已知的结构类似性或同源性，例如，抗-独特型抗体的抗原结合位点。各种肽，模拟肽段，或非-肽化合物可容易地以此种方式生成。
所述“分离-合并”策略可产生肽，例如抑制物的文库，该文库可用于制备本发明测试化合物的文库。在其它阐述的合成中，“多样体(diversomer)文库”是用Hobbs DeWitt等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909(1993))的方法制造的。其它合成方法，包括Houghten的“茶袋(fea-bag)”技术(见例如，Houghten et al.，Nature 35484-86(1991))也能用来合成本发明化合物的文库。
可筛选化合物文库以确定所述文库是否有任一成员具有所需活性，而且如果有，就鉴定该活性种类。筛选组合文库的方法已有描述(见例如，Gordon等，J.Med.Chem.，上文)。可用亲和层析法来筛选可溶化合物的文库，用适宜受体来分离该受体所对应的配体，其后用常规技术鉴定所分离的配体(例如，质谱分析法，NMR，等等)。可通过使该化合物与可溶受体接触来筛选固定化的化合物；优选，所述可溶受体与标记(例如，荧光团，比色酶，放射性同位素，发光化合物，等等)偶联从而被检测以指示配体结合。可选，固定化化合物被选择性释放并扩散过膜以结合受体。筛选本发明文库可用的试验举例见下述。
在一个实施方案中，筛选本发明化合物与CD2或LFA-3多肽相互作用的能力，可通过测定每种化合物直接结合所述多肽的活性，或抑制CD2/LFA-3相互作用的活性，可通过例如，将测试化合物与CD2或LFA-3多肽和裂解物，例如，T或APC细胞裂解物，例如，在多孔板(如标准的96-孔微量滴定板)的一个孔中孵育。在本实施方案中，可确定每单个化合物的活性。用不含有测试化合物的一或多个孔做对照。孵育后，通过测定每个孔可确定每个测试化合物的活性。因而，可平行确定数个测试化合物的活性。
在另一实施方案中，可同时检测大量测试化合物的结合活性。例如，测试化合物可在固体树脂珠子上用“一珠子-一化合物”合成法合成；所述化合物可通过对光不稳定的连接子固定在树脂支持物上。之后数个珠子(例如，100,000珠子或更多)可与酵母细胞结合并喷射成为数个“纳米(nano)-小滴”，其中每个小滴包括一个珠子(因而，是单个测试化合物)。将该纳米-小滴置于UV光下之后造成所述化合物从此珠剪切。可以理解，这种试验方法可使被测化合物的大文库以迅速被筛选。
合成化合物的组合文库可用“标签”来破译每个文库成员的身份(见例如，W.C.Still等，美国专利5,565,324和PCT公开号WO 94/08051和WO 95/28640)。通常，此方法的特征是使用附着在固体支持物或所述化合物上的，惰性的但却容易检测的标签。当检测到一活性化合物(例如，用上述一种技术)时，通过鉴定独特的随同标签可确定所述化合物的身份。此种标签方法可合成大的化合物文库，该文库可在很低的水平被鉴定。所述标签方案在，例如，上述的“纳米-小滴”筛选试验中是可用的，以鉴定所述珠子所释放的化合物。
在优选实施方案中，所述本发明化合物的文库至少包含30种化合物，更优选至少100种化合物，并更优选至少500种化合物。在优选实施方案中，本发明化合物的文库包含少于109种化合物，更优选少于108种化合物，及更优选少于107种化合物。
衍生的抑制物本发明方法也可用衍生的CD2/LFA-3相互作用的抑制物，例如，任一所述抗体同系物，可溶CD2和LFA-3多肽，或在此所述的CD2和LFA-3模拟物。该抑制物与独立选自抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物，可溶LFA-3和CD2多肽，CD2和LFA-3模拟物，细胞毒性制剂或药物制剂中的一或多个成员(通过化学偶联，基因融合或另外的方式)功能性连接。
通过两种或更多抑制物(同型或不同型)的交联来生产衍生抑制物。适宜的交联物包括那些异基双功能(heterobifunctional)的交联物，其具有由适宜间隔区分开的两个完全不同的反应基因(例如，m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或同基因双功能的(homobifunctional)交联物(例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸)。所述连接子可得自Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois。
另一个交联的可能性是利用在PI-连接的LFA-3，或其片段中的PI连接信号序列。具体地，将编码所述PI连接信号序列(例如，SEQ ID NO4的AA162-AA212)的DNA与编码所需多肽，优选可溶性的LFA-3多肽的DNA下游连接。如果此构建体在适宜的真核生物细胞表达，所述细胞会识别该PI连接信号序列并将PI和所述多肽共价连接。然后可利用此PI的疏水性质来形成所述多肽的微团聚集。
也可用的是与一或更多细胞毒性或药物制剂连接的抑制物。可用药物制剂包括生物活性肽，多肽和蛋白，如对除CD2或LFA-3外的人多肽，或其部分特异的抗体同系物。可用的药物制剂和细胞毒性制剂也包括环孢素A，强的松，FK506，氨甲蝶呤，类固醇，类维生素A，干扰素，和氮芥子气。
用药物制剂衍生的优选抑制物包括重组-生产的多肽，该多肽中可溶性的LFA-3多肽，可溶性的CD2多肽，或肽基CD2或肽基LFA-3模拟物与免疫球蛋白的全部或部分的重链铰链区和全部或部分的重链恒定区相融合。优选制备所述融合蛋白的多肽为可溶性的LFA-3多肽。最优选为包含LFA-3的AA1-AA92的融合蛋白(例如，SEQ ID NO2)，该蛋白与人IgG1铰链区(包括所述铰链区C末端的10个氨基酸，该铰链区包含认为参与链内二硫键的两个半胱氨酸残基)和所述IgG1重链恒定结构域的CH2和CH3区的一部分相融合。所述融合蛋白可望呈现延长的血清半衰期并使得抑制物二聚化。
联合治疗所述结合剂，例如，CD2-或LFA-3结合剂，可与其它疗法联合应用，如光疗法(例如，UVA，UVB或PUVA)；化学疗法(例如，氨甲蝶呤；类维生素A；环孢素；依曲替酯)；或局部疗法(例如，类固醇，维生素(例如，维生素D)，焦油，蒽林，大环内酯类，或大内酰胺(例如，藤霉素或pimecrolimus)。所述联合治疗可有利地利用较低剂量的治疗剂或预防制剂。
在此所用的“联合”，是指在受试者在受病症折磨时给予其两种(或更多种)不同治疗，例如，在受试者被诊断出所述病症后、该病症被治愈或消除前给予所述两种或更多种治疗。在一些实施方案中，在一种治疗仍进行时可开始给予第二种治疗，所以存在重叠。有时这可参照本文的“同时给予”或“并行(concurrent)给予”在其它实施方案中，一种治疗结束后再开始给予其它治疗。在任一情况的实施方案中，由于联合给药该治疗更为有效。例如，第二种治疗更有效，例如，较少量的第二种治疗仍可见相同效果，或者如与在首次治疗缺无时给药第二种治疗相比，第二种治疗可更大程度地降低症状，或第一种治疗可见类似的情况。在一些实施方案中，这样给予可使所述症状的降低，或其它病症相关参数，例如，IFNγ水平的降低或T细胞程序死亡的发生，诱导，或CD40L表达的下降，比给予一种治疗而其他治疗缺无时所见更大。此两种治疗的效果可部分累加，完全累加，或超过累加。这样给予可使给予第一种治疗的效果在给予第二种治疗时仍可检测到，例如，当首先给予UVB时，IFNγ的降低在给予LFA-3/Ig融合体时仍可检测到。
在优选实施方案中，给予第一种治疗及给予第二种治疗在两者之间1，2，5，10，15，或30天内发生。
在此所述的结合剂可用作皮肤病症，如牛皮癣常规治疗的助剂。例如，可在牛皮癣的顺序疗法之前，同时，或之后引入结合剂(综述于Koo，J.(1999)JAm Acad Dermatol.41(3 Pt 2)S25-8)。术语“顺序疗法”参照治疗策略，该法包括根据特别设计(deliberate)的顺序应用特具体的治疗剂以使治疗结果最优化。对于牛皮癣而言此种策略的合理性在于该病是需要长期维持疗法，而症状需要迅速缓解的慢性疾病，因而对牛皮癣可用的一些治疗较适合迅速清除而其它的更适宜长期维持。顺序疗法包括3个主要步骤(1)清除，或“迅速-固定(fix)”阶段；(2)过渡阶段，和(3)维持阶段。
顺序系统疗法举例包括应用迅速起作用的辅助剂，例如，以最大皮肤病剂量(每天5mg/kg)应用的环孢素，或氨甲蝶呤。大约一个月后，随着逐渐引入CD2-结合剂和/或其它辅助剂，例如，作为维持剂的阿昔曲丁(acitretin)，开始过渡阶段。一旦确立CD2-结合剂和/或其它辅助剂，例如，阿昔曲丁的最大耐受剂量，迅速起作用的辅助剂，例如，环孢素，就被逐渐地削减(tapered)，而所述CD2-结合剂和/或其它辅助剂，例如，阿昔曲丁，将继续用作长期维持。如果需要，可结合添加光疗法(UVB或PUVA)来改善控制。
在其它举例实施方案中，可延长CD2-结合剂的给药时间疗程(例如，十二周的治疗疗程)。在疾病缓解或亚活动过程中，可单独给药所述CD2-结合剂或结合局部应用制剂(例如，类固醇，维生素(例如，维生素D)，焦油，蒽林，大环内酯类，或大内酰胺(例如，藤霉素(FK506)或pimecrolimus))和/或光疗法(例如，UVA，UVB或PUVA，但优选，UVB)。在疾病活动过程中，可给药迅速起作用却有毒性的辅助剂，如氨甲蝶呤和/或环孢素，一个短疗程。
子囊霉素大内酰胺衍生物如pimecrolimus(ASM 981膏1％)为炎症性细胞因子的选择性抑制物，现应用于炎症性皮肤病症，如特应性皮炎，变应性接触性皮炎，刺激性接触性皮炎和牛皮癣的治疗(Stuetz，A.et al.，(2001)Semin.Cutan.Med.Surg.20(4)233-41；Bomhovd，E.et al.，(200 1)J.Am.Dermatol.45(5)736-43)。
在优选实施方案中，可(例如通过输入(例如，用输入装置)静脉内，肌肉内，皮下，关节内，鞘内，骨膜内，肿瘤内，病灶内，病灶周围；口服，局部或通过吸入)系统给药所述CD2-结合剂(例如，LFA-3/Ig融合物)或包含它的药物组合物。优选，通过肌肉内或静脉内给药所述CD2-结合剂。在其它实施方案中，所述CD2-结合剂被局部(例如，体表)给药于患病区域，例如，牛皮癣病灶。
光疗法在一个实施方案中，在此公开的所述结合剂，例如，在此所述的CD2-结合剂，与光疗法(也参照本文“光疗法”)结合给药。光疗法应用皮肤对紫外(UV)辐射的光学吸收来迅速杀死正在迅速生长的细胞并使其增殖停滞。现在，将皮肤暴露于320-400nm(UVA辐射)或290-320nm(UVB辐射)的UV辐射下的UVA和UVB疗法，可有效并广泛用于治疗皮肤病症。在优选实施方案中，290-320nm范围的UVB辐射，更优选以在311nm的窄带UVB的形式应用。在其它实施方案中，也可用PUVA治疗，一种光化学治疗的形式，其包括在皮肤患病区重复局部应用补骨脂素或补骨脂素-基础上的化合物，其后将该区暴露于UVA辐射。在其它实施方案中，光动力疗法(PDT)可用于治疗皮肤病症，特别是牛皮癣和毒蕈样霉菌病。此法中，将光敏感剂，一种选择性滞留在癌细胞内的药物，给药受试者。光吸收之后(通常在320-700nm之间，由药物决定)所述光敏感剂经历了光化学反应，导致生成了所述细胞毒性单态氧，该物质最终造成皮肤内肿瘤血管破坏(Anderson，et al.(1992)Arch.Dermatol.1281631-1636)。
很多情况下可重复给予一种，或两种所述CD2-结合剂(例如，LFA-3/Ig融合体)和光疗法(例如，UVB)。可在相等或不等的时间间隔给予所述CD2-结合剂。例如，可每3-12天，例如，一周一次给予所述CD2-结合剂。此给予可重复3，6，12，15，24，或更多次。第二种治疗的一个或更多个疗程，例如，给予光疗法(例如，UVB)，可在给予融合蛋白的疗程之前，之后或同时重叠给予。
药物组合物本发明提供了通过给药哺乳动物一种或更多种CD2-结合剂，例如，所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，或其衍生形式，并与辅助剂相结合，来预防或治疗上述受试者皮肤病症的方法。
优选地，给药所述CD2-结合剂或其衍生形式的有效量。“有效量”是指能够减轻在此所述的皮肤病症的扩散或严重性的量。
对本领域技术人员显而易见的是，所述抑制物有效量将取决于，给药时间表，单位给药剂量，该抑制物是否与其它治疗剂结合给药，所述病人的免疫状态和健康，该特殊给药抑制物的治疗或预防活性及其血清半衰期以及其它的因素。
优选，所述CD2-结合剂以每kg体重约0.001到约50mg抑制物的剂量给药，更优选，每kg体重约0.01到约10mg抑制物，最优选每kg体重约0.1到约4mg抑制物。
给药单位剂量应截止到可观察到效应。所述效应可用各种方法测定，包括，体外T细胞活性试验和患病皮肤区域的清除。优选，给药单位剂量约每周一到三次或每天一到三次。更优选，给药约每天一到三次约3到7天，或以一个月为基础，约每天一到三次约3到7天。然而，可理解的是可应用较低或较高剂量以及其它给药计划。
所述CD2-结合剂或其衍生形式也优选以包含药学可接受载体的组合物形式给药。″药学可接受载体”指不在给药病人引起过敏反应或其它的不想要的效应的载体。
适宜的药学可接受载体包括，例如，一种或更多种水，盐水，磷酸盐缓冲的盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等等，及它们的组合。药学可接受载体还可包含可提高该抑制物的存放期限或有效性的少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液。
如上所述，该药物组合物或CD2-结合剂可与其它辅助治疗剂或预防制剂联合给药。这些包括，例如，环孢素A，类固醇，类维生素A，氮芥子气，干扰素，氨甲蝶呤，抗生素和抗组织胺。
这些辅助剂可以与抑制物组成单剂量形式(即，作为同种药物组合物的一部分)给药，可以以与该抑制物分离的多剂量形式，同时该药，或以其中两种成分分别但顺序给药的多剂量形式给药。可选，所述CD2结合剂及所述其它活性介质可以是单个偶联分子的形式。所述两种成分的偶联可用本领域广为所知的标准交联技术来得到。单个分子也可以呈现重组融合蛋白的形式。而且，本发明可用的所述抑制物，或药物组合物，可结合其它疗法应用如，PUVA，化学疗法和UV光。所述结合疗法可有利地应用较少剂量的所述治疗剂或预防剂。
所述CD2-结合剂，或药物组合物，可以是各种形式。这些形式包括，例如，固体，半-固体和液体剂量形式，如药片，丸剂，粉末，液体，透明溶液，分散剂或悬浮液，脂质体，栓剂，可注射的，可灌输的和局部用的制品。所述优选形式依赖于给药和疗法应用的所需模式。该优选形式为可注射的或可灌输的溶液。
此发明包括适合局部应用的防晒剂或UV-防护剂的制剂。优选实施方案包括LFA3TIP制品。所述活性成分可配制在脂质体中。该产物可在暴露于UV之前，之中，或之后，或发(redness)红之前，之中，或之后应用。
试剂盒从另一方面，本发明提供的试剂盒包括在此所述的CD2-结合剂，与其联合应用的辅助剂，例如，本文所述的制剂，或如何应用所述制剂的说明书。
在优选实施方案中，所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物为LFA3/Ig融合多肽。优选，所述LFA-3/Ig融合多肽是冻干的。
其后的发明可继续用如下例子来阐述，该例不应成为进一步的限制。本申请全文所引用的参考文献，审查中的专利申请和已公开的专利的全部内容，在此清楚引入本文作为参照。
实施例实施例1LFA3TIP共同-培养后的IFN愕奶逋庖种萍℃D25水平的下降用非-牛皮癣和牛皮癣志愿者的外周血单个核细胞(PBMC′s)对LFA3TIP进行的体外检测表明，LFA3TIP共同-培养后IFNγ显著抑制及CD25水平下降。IFN-γ水平的下降也在LFA3TIP治疗的病人的T细胞的体内检测中反映出来。倘若LFA3TIP对PMBC′s在体外有显著的作用，我们希望确定是否体内给药LFA3TIP对被治疗志愿者的PBMC′s也有作用。为证实这一点，加入本方案的所抽外周血与每个角质物(keratome)样品时间上一致以使我们能够检测所述LFA3TIP治疗人群的PBMC′s的IFNγ和CD25水平。用Ficoll操作并用与本领域已知的PBMC方案一致的方案来刺激该PBMC制品。从所述体内LFA3TIP治疗的病人获得的PBMC′s可用于下一步的流式细胞仪试验。所述外周血试验在每个时间点给每个病人的方案增加另外的15个试验点。这包含对CD3，CD69，CD25，CD2，IFNγ，CD40L和Apo2.7的染色。而且，对所述体内治疗病人的PBMC′s也检测CD40L的表达。
实施例2人LFA-3/IgG1融合蛋白抑制正常人和牛皮癣患者外周血T细胞的IFNγ的产生并提高UVB的作用。
牛皮癣部分由活化T细胞产生的干扰素γ(IFNγ)介导。Alefacept(人LFA-3/lgG1融合蛋白，LFA3TIP，现由Biogen，Inc.以商品名AmeviveTM来开发)表现出对体外和体内T细胞的抑制效果。alefacept的阶段3临床试验正在牛皮癣上进行。UVB照射仍被认为是最有效的牛皮癣的治疗之一，前面我们已经介绍单独的体内UVB暴露可选择性地降低T细胞的IFNγ产生。
为调查alefacept对T细胞IFNγ产生的效果，活化正常个体(n-7)或牛皮癣病人(n-7)的PBMC并用流式细胞仪测定IFNγ产生。对于8μg/ml alefacept-治疗的非-牛皮癣PBMC，IFNγ+T细胞的量在5/7的病例中降低(20-90％降低)，1/7升高或在1/7的病例保持不变。在牛皮癣PBMC中，8μg/ml alefacept治疗可造成在6/7的测试病人IFYγ的产生降低，其均值为降低56±0.12％，(p＜0.005)。PBMC群体可基于IFNγ产生分为两组，高(＞10％)或低(＜10％)IFNγ+CD3+。当分别考虑时，非-牛皮癣和牛皮癣高生产者被8μg/ml alefacept有效抑制，其降低均值分别为56％和65％。相比，低生产者表现出较差抑制。抗-FcγRI和RIII mAb通过alefacept预治疗消除了IFNγ的减低。当PBMC群体用UVB辐射(0-20ml/cm2)预治疗时，alefacept可增强UVB-诱导的程序死亡并进一步降低IFNγ32.2％(p＝0.009，n＝3)。
这些结果表明alefacept可抑制T细胞的IFNγ产生，与含有FcγR细胞的相互作用是必需的，并且其与UVB的联合被证明在降低牛皮癣病灶的Th1-型细胞的数量和活性上是有效的。
实施例3治疗牛皮癣的人LFA-3/IgG1融合蛋白可降低渗入病灶皮肤IFNγ+-生成T细胞的数量牛皮癣为通过活化的病灶T细胞(倾向于Th1)产生的IFNγ来部分介导的慢性炎症性皮肤疾病。Alefacept(人LFA-3/IgG1融合蛋白，LFA3TIP，现用以商标名称AMEVIVETM来开发)为一种新的重组蛋白，其导致CD3+CD45RO+血T细胞的可逆降低。
为研究对皮肤T细胞的影响，在6个病人进行开放-标记的alefacept阶段III的牛皮癣研究，其中每个病人连续12周，每周给予alefacept 7.5mg IV。可用流式细胞仪分析所述CD3+T细胞和产生IFNγ的CD3+群体在总的表皮或真皮细胞的百分比，并以细胞数/mm2计算出CD3+或IFNγ+CD3+的细胞密度。
5/6的病人在13周表现出临床改善，生产IFNγ(IFNγ+CD3+)的表皮T细胞密度降低到基线的0.26±0.3％。全部6个病人的IFNγ+CD3+细胞密度均值在基线为182±91/mm2，而在12周alefacept治疗后为77±45/mm2(p＝0.05)。对全部6个病人，所述PASI改善与IFNγ+CD3+表皮细胞改变的％相关，r＝0.80，p＝0.06。有趣的是，在治疗的开始阶段，几个病人在第3周表现出IFNγ+CD3+病灶T细胞的密度短暂增加，并伴有表皮厚度的短暂增加；之后几周所述IFNγ+CD3+T细胞和表皮厚度就降低了。
我们的结果提示alefacept可显著降低与临床改善相关的渗入的Th1-型IFNγ+CD3+T细胞的数量。因为IFNγ据信是牛皮癣发病原因的关键因子，皮肤内Th1细胞的下降可视为牛皮癣临床改善的关键步骤。
保藏本发明可用的小鼠杂交瘤细胞和抗-LFA-3抗体的举例根据布达佩斯条约在1991年3月5日保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，U.S.A.，并被鉴定为命名ATCC登录号1E6HB 10693HC-1B11HB 106947A6HB 106958B8HB 10696携带编码跨膜LFA-3的质粒的噬菌体根据布达佩斯条约在1987年5月28日以登录号IVI-10133保藏在In Vitro International，Inc.，Linthicum，Maryland，U.S.A.。此保藏在1991年6月20日被转运到美国典型培养物保藏中心并鉴定为命名ATCC登录号λHT16[λgtl0/LFA-3]75107用编码PI-连接的LFA-3的质粒转化的大肠杆菌根据布达佩斯条约在1988年7月22日以登录号IVI-10180保藏在In Vitro Internationl，Inc.。此保藏在1991年6月20日被转运到美国典型培养物保藏中心并鉴定为命名ATCC登录号p2468788序列下述为描述于US 6,162,432并在本申请中全文参照的序列汇总SEQ ID NO1 跨膜LFA-3的DNA序列SEQ ID NO2 跨膜LFA-3的氨基酸序列SEQ ID NO3 PI-连接的LFA-3的DNA序列SEQ ID NO4 PI-连接的LFA-3的氨基酸序列SEQ ID NO5 CD2的DNA序列SEQ ID NO6 CD2的氨基酸序列SEQ ID NO7 LFA3TIP的DNA序列SEQ ID NO8 LFA3TIP的氨基酸序列等同情况本领域技术人员会识别，或能够确认只是应用常规实验方法的，本发明所述的特定实施方案的很多等同情况。所述等同是应包括在下述权利要求中的。
其它实施方案也包括在下述权利要求中。
序列表<110>比奥根公司(Biogen，Inc.)<120>用CD2结合剂治疗或预防皮肤病症的方法<130>10274-041US1<140>US10/329,599<141>2002-12-26<150>PCT/US02/02314<151>2002-01-25<150>60/265,964<151>2001-02-01<160>10<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>753<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(750)<221>sig_pepide<222>(1)...(84)<221>mat_peptide<222>(85)...(750)<400>1atg gtt gct ggg agc gac gcg ggg cgg gcc ctg ggg gtc ctc agc gtg48Met Val Ala Gly Ser Asp AlA Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val-25 -20 -15gtc tgc ctg ctg cac tgc ttt ggt ttc atc agc tgt ttt tcc caa caa96Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln-10 -5 1ata tat ggt gtt gtg tat ggg aat gta act ttc cat gta cca agc aat144Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn5 10 15 20gtg cct tta aaa gag gtc cta tgg aaa aaa caa aag gat aaa gtt gca192Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala25 30 35gaa ctg gaa aat tct gaa ttc aga gct ttc tca tct ttt aaa aat agg240Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg40 45 50gtt tat tta gac act gtg tca ggt agc ctc act atc tac aac tta aca288Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr55 60 65tca tca gat gaa gat gag tat gaa atg gaa tcg cca aat att act gat336Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp70 75 80acc atg aag ttc ttt ctt tat gtg ctt gag tct ctt cca tct ccc aca384Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr85 90 95 100cta act tgt gca ttg act aat gga agc att gaa gtc caa tgc atg ata432Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile105 110 115cca gag cat tac aac agc cat cga gga ctt ata atg tac tca tgg gat480Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp120 125 130tgt cct atg gag caa tgt aaa cgt aac tca acc agt ata tat ttt aag528Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys135 140 145atg gaa aat gat ctt cca caa aaa ata cag tgt act ctt agc aat cca576Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro150 155 160tta ttt aat aca aca tca tca atc att ttg aca acc tgt atc cca agc624
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<221>SIGNAL<222>(1)...(28)<400>4Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val-25 -20 -15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln-10 -5 1Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn5 10 15 20Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala25 30 35Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg40 45 50Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr55 60 65Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp70 75 80Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr85 90 95 100Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile105 110 115Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp120 125 130Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys135 140 145Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro150 155 160Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser165 170 175 180Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala185 190 195
Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Met Tyr Ala Phe200 205 210<210>5<211>1056<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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<221>CDS<222>(1)...(1053)<400>9atg gtt gct ggg agc gac gcg ggg cgg gcc ctg ggg gtc ctc agc gtg48Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val1 5 10 15gtc tgc ctg ctg cac tgc ttt ggt ttc atc agc tgt ttt tcc caa caa96Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln20 25 30ata tat ggt gtt gtg tat ggg aat gta act ttc cat gta cca agc aat144Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn35 40 45gtg cct tta aaa gag gtc cta tgg aaa aaa caa aag gat aaa gtt gca192Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala50 55 60
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权利要求
1.一种治疗或预防被试者以异常T细胞活性或增殖为特征的表皮或真皮病症的方法，其含有给药所述被试者CD2/LFA-3相互作用的抑制物，以及与其联合应用的辅助剂，从而治疗或预防所述表皮或真皮病症。
2.权利要求1的所述方法，其中所述表皮或真皮病症以T细胞IFNγ产生增加为特征。
3.权利要求1的所述方法，其中所述表皮或真皮病症为慢性炎症性病症。
4.权利要求1的所述方法，其中所述表皮或真皮病症为自体免疫病症。
5.权利要求1的所述方法，其中所述表皮或真皮病症为牛皮癣。
6.权利要求1的所述方法，其中所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物为CD2-结合介质。
7.权利要求1的所述方法，其中所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物为与免疫球蛋白或其片段融合的LFA-3的CD2-结合片段。
8.权利要求1的所述方法，其中所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物为LFA-3/IgG融合多肽。
9.权利要求1的所述方法，其中所述辅助剂选自光疗法，氨甲蝶呤，类维生素A，大环内酯，大内酰胺，环孢素或依曲替酯。
10.权利要求1的所述方法，其中所述辅助剂为UVB辐射。
11.权利要求1的所述方法，还包含监测所述被试者的症状，或细胞因子水平变化或免疫细胞群变化的步骤。
12.权利要求1的所述方法，还包含给药所述被试者局部应用制剂的步骤，该制剂选自类固醇，维生素，焦油，蒽林或大内酰胺。
13.权利要求1的所述方法，其中所述被试者为哺乳动物。
14.治疗或预防被试者的牛皮癣的方法，含有给药所述被试者融合多肽，该融合多肽包括与所述IgG的恒定区片段融合的LFA-3的CD2-结合片段，以及与该融合多肽联合应用的足以降低所述被试者表皮干扰素γ水平的量的UVB，从而治疗或预防所述牛皮癣。
15.治疗或预防被试者的炎症性病症的方法，包括给药所述被试者所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，以及与其联合应用的辅助剂，从而治疗或预防所述炎症性病症。
16.治疗或预防被试者的自体免疫病症的方法，包括给药所述被试者所述CD2/LFA-3相互作用的抑制物，以及与其联合应用的辅助剂，从而治疗或预防所述自体免疫病症。
17.权利要求16的所述方法，其中所述自体免疫病症选自牛皮癣，糖尿病，关节炎，类风湿关节炎，青年类风湿关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，多发性硬化，脑脊髓炎，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自身免疫甲状腺炎，皮炎，特应性皮炎和湿疹性皮炎。
18.治疗或预防被试者的特应性皮炎的方法，包括给药所述被试者融合多肽，该融合多肽包括与IgG的恒定区片段融合的LFA-3的CD2-结合片段，以及与该融合多肽联合应用的足以降低所述被试者表皮干扰素γ水平的量的UVB，从而治疗或预防所述特应性皮炎。
全文摘要
本发明公开了使用CD2－结合剂，例如，CD2－LFA3相互作用的抑制物(例如，LFA－3/IgG融合多肽)，结合辅助剂，例如，UVB辐射，治疗或预防表皮或皮肤病症，例如，牛皮癣的方法。
文档编号C07K19/00GK1527723SQ02807919
公开日2004年9月8日 申请日期2002年1月25日 优先权日2001年2月1日
发明者阿克谢伊·K·韦施纳, 凯文·D·库珀, 丹尼尔·施雷格, 托马斯·S·麦考密克, S 麦考密克, 施雷格, D 库珀, 阿克谢伊 K 韦施纳 申请人:比奥根公司, 克利夫兰大学医院