专利名称：：一种升麻总苷的提取方法及其抗肿瘤作用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物升麻地上部分总苷的提取制备及其在肿瘤的化学预防和治疗中的应用。
背景技术：
：升麻是毛莨科升麻属(CimicifugeaeS.I.)植物，包括升麻或西升麻(Cimicifugafoetida)、北升麻或兴安升麻(Cimicifugadahurica)以及总状升麻(Cimicifuga.racemosa)。兴安升麻是我国特有品种，与总状升麻(又称欧洲升麻)同属不同种。升麻族植物多以地下部分入药。据记载，升麻药材具有清热解毒、升举阳气、发表透疹的功能，主治风热头痛、齿痛、咽喉肿痛、子宫脱垂等症。兴安升麻(C.dahurica)的根茎作为常用中药已载入中国药典(2000版)，而地上部分通常作为废弃物。近一两年才开始对地上部分化学成分进行研究，结果表明，三萜及其皂甙是其主要成分。然而地上部分的药理研究几乎为一空白。总状升麻和国产升麻(C.foetida)的总三萜及其皂甙可提高去势大鼠血清雌二醇水平，而使黄体生成激素(LH)浓度降低，并能抑制由于内分泌紊乱、雌激素缺乏而引起的骨质疏松和更年期综合症。升麻中的阿魏酸、异阿魏酸等具有抗炎镇痛的作用，咖啡酸及其衍生物具有抗氧化活性。同时服用总状升麻根茎的40％异丙醇提取物，可以增强雌激素依赖性肿瘤治疗中的抗雌激素作用，在体外可增强他莫西芬对人乳腺癌(MCF-7)细胞的增殖抑制作用。另外，总状升麻提取物还适用于治疗良性及恶性前列腺肥大。含有升麻，黄连和Zanthoxylin的提取物可以用作口腔癌的替代疗法。从总状升麻根茎中提取的化合物升麻醇3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖(cimigenol3-O-a-L-arabinopyranoside)和23-O-乙酰升麻醇-3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖(23-O-acetylshengmanol3-O-a-L-arabinopyranoside)对人口腔鳞状细胞癌(HSC-2)有抑制作用，半数抑制率分别为30um和18um。提取自兴安升麻地上部分的23-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷(23-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside)，24-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷(24-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside)，25-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷(25-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside)在体外具有抗肿瘤作用，能够抑制人肝细胞癌(HepG2)，人肝细胞癌耐药株(HepG2-R)，人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)，及原代培养正常小鼠肝细胞，诱导HepG2细胞和HL-60细胞凋亡和周期阻滞，以及抗自由基氧化作用。本发明的目的是提取制备兴安升麻地上部分总苷并在研究其细胞毒性、对细胞形态学、细胞周期、自由基氧化和DNA损伤的影响的基础上，提供其在肿瘤临床预防治疗中的实际应用。
发明内容本发明所说的兴安升麻地上部分总苷提取自兴安升麻(cimicifugadahurica)地上部分。原材料于1999年9月采自内蒙古自治区喀喇泌旗茅荆坝，经鉴定为升麻属植物兴安升麻(CimicifugadahuricaThurezMaxim)的地上部分。所说总苷的提取制备工艺是将原材料粉碎过筛后，进行化学成分预试验。研究结果表明，兴安升麻地上部分主要含有三萜皂甙类成分。总皂苷的提取方法确定如下将升麻地上部分药材粉碎过筛后，以10倍量的80％乙醇加热回流提取3次，每次1小时。提取完毕，过滤，滤液减压浓缩至波密度为1.12时加入吸附剂(硅胶或硅藻土)进行柱层析。先以工业己烷洗去油脂，然后用乙酸乙酯洗脱，得到的乙酸乙酯部分经减压浓缩得总苷，收率为6-7％。由总苷分离的30个三萜类化合物在总苷中所占比例编号化合物在总苷中所占比例(％)1升麻内酯A1.02升麻内酯1.43兴安升麻苷C2.34兴安升麻苷D1.75兴安升麻苷E1.76兴安升麻苷F1.77兴安升麻苷G5.08兴安升麻苷H1.29兴安升麻苷I1.610兴安升麻苷J1.71123-O-乙酰升麻醇木糖苷1.71225-O-乙酰-7，8-二脱氢升麻1.2醇木糖苷1325-O-乙酰升麻醇木糖苷6.614升麻苷H-21.01525-脱水升麻醇木糖苷1.01624-epi-7，8-二脱氢升麻醇木1.2糖苷17升麻醇木糖苷5.8187，8-二脱氢升麻醇木糖苷1.21925-O-甲基升麻醇木糖苷1.72015a-羟基升麻苷H-21.0217β-羟基升麻醇木糖苷2.02212β-羟基升麻醇木糖苷1.02324-O-乙酰-7，8-二脱氢升麻1.2醇木糖苷2424-O-乙酰升麻醇木糖苷2.02525-O-甲基-24-O-乙酰升麻醇2.0木糖苷2612β-O-乙酰小升麻苷A8.42712β-O-乙酰小升麻苷B4.228小升麻苷A1.529小升麻苷B1.830升麻醇1.7将兴安升麻地上部分总苷用DMSO溶解配成2.50g/ml的浓缩液，分别进行细胞毒性试验、细胞形态学试验、细胞周期试验、DPPH自由基清除试验(抗氧化)、羟自由基清除试验、羟自由基引起的DNA损伤试验、环氧酶2蛋白表达试验。细胞毒性试验结果表明，兴安升麻地上部分总苷对血液瘤、实体瘤均有较好的抑瘤作用。细胞毒强度与已获得专利申请号的23-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷，24-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷，25-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷相当。对小鼠正常肝细胞的IC50值均大于其它肿瘤细胞株，说明兴安升麻地上部分总苷在抑制肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒性较低。细胞形态学试验和细胞周期试验结果表明，兴安升麻地上部分总苷主要通过诱导肿瘤细胞凋亡和G0/G1细胞周期阻滞来起作用的。兴安升麻地上部分总苷有很好的清除自由基的作用，并可有效抑制羟自由基对DNA造成的损伤。因此，本发明中的兴安升麻地上部分总苷可望用作临床肿瘤预防和治疗药物。发明效果本发明涉及的兴安升麻地上部分总苷在体外对血液瘤(HL-60)和实体瘤(HepG2，SF-268，MCF-7)均有良好的杀伤作用，而对正常小鼠肝细胞损伤作用相对微弱；细胞形态学和细胞周期试验证明，兴安升麻地上部分总苷主要是通过诱导细胞凋亡和G0/G1阻滞来起作用，而环氧酶-2是诱导细胞凋亡和G0/G1阻滞的机制之一；兴安升麻地上部分总苷有很好的清除自由基以及DNA损伤保护作用，可以预防自由基氧化对生物大分子的损伤及其可能导致的癌变。兴安升麻地上部分总苷的细胞毒性与从中提取的三个单体化合物的作用强度相当，但清除自由基和DNA损伤保护作用强于三个单体化合物，而且与三个单体化合物相比，升麻总苷的提取工艺简单，收率提高(约达6-7％)，成本显著降低(较单体化合物成本降低10倍以上)，更有利于其在制备肿瘤预防和治疗药物中的实际应用。下面所列实施例有助于本领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1细胞毒性试验1、材料人肝癌细胞株(HepG2)，人乳腺癌细胞株(MCF-7)，人神经胶质瘤细胞株(SF-268)，人急性早幼粒白血病细胞株(HL-60)，均够自美国ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。小鼠肝细胞分离自昆明种小鼠(购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号广东省科委实验动物检测所合格证)肝脏，经原代培养获得。培养基RPMI1640，DMEM，胎牛血清均购自Gibico公司。四氮唑溴MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)为AMRESCO公司产品，由上海生物工程有限公司分装，批号0481B50.2、小鼠肝细胞原代培养小鼠麻醉后消毒暴露肝脏，门静脉插管，依次用肝素、前灌液、胶原酶灌流，取下肝脏用无钙镁Hanks液清洗两次，然后转移至一洁净培养皿中将肝细胞抖落于胶原酶溶液中，过筛离心，以DMEM培养基洗3次，然后用DMEM10％胎牛血清重悬，台盼蓝染色计数，活细胞率在80％以上。3.组织培养HepG2，MCF-7，SF-268和HL-60细胞均用RPMI1640培养基加10％胎牛血清常规培养传代。接种细胞到96孔板，接种密度为10000-20000/孔。小鼠肝细胞原代培养用DMEM培养基加10％胎牛血清，接种密度为8000个/孔。5％CO2孵箱37℃培养24小时后，按常规加药，对照组加等容积的DMSO。继续在5％CO2和37℃培养箱中培养48小时。加MTT，终浓度为50ug/ml。5％CO2孵箱37℃孵育4小时后，Bio-RADModel680MicroPlateReader上测定吸光度值。计算抑制率。4.结果兴安升麻地上部分总苷能够抑制HepG2，MCF-7，SF-268，HL-60以及小鼠正常肝细胞的生长(图1)，IC50见表1。由表1可知兴安升麻地上部分总苷对HepG2，MCF-7，SF-268，HL-60的IC50相近，说明其对血液瘤、实体瘤均有较好的抑瘤作用。兴安升麻地上部分总苷对小鼠正常肝细胞的IC50大于其它肿瘤细胞株，说明兴安升麻地上部分总苷在抑制肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒性较弱。表1.升麻地上总苷对五个细胞株的IC50(μg/ml)值实施例2细胞形态学试验(细胞凋亡)1、方法35*10mm培养皿中加入400ul吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)溶液(100ug/mlAO溶液，100ug/mlEB溶液，用PBS配制)，1∶1混均，立即在40*10荧光倒置显微镜下观察。AO对活细胞及死细胞均能染色，EB只对失去膜整合性的细胞染色，活细胞仍呈现均匀的绿色。早期凋亡细胞呈绿色，由于染色质凝聚及核裂解，其细胞核中有鲜绿色的斑点。凋亡晚期细胞可被EB染成橙色，但与死细胞不同，凋亡晚期细胞的核凝聚并常常裂解。坏死细胞染成橙色，但具备活细胞样的核形态，没有染色质凝聚。2、结果观察兴安升麻地上部分总苷对HepG2和HL-60细胞形态学的影响，发现在25μg/ml和50μg/ml对两个细胞株均能引起凋亡的形态学变化，阳性药三尖杉酯碱也能引起相似的凋亡形态学变化(图2-7)。实施例3细胞周期试验1、材料RNaseA，USB公司产品，81。4units/mg，批号110266-007；碘化丙啶(PI，propidiumiodide)，sigma公司产品，批号042k3655.2、方法常规方法培养HepG2和HL-60细胞，给药后收集细胞，用PBS洗两次后以70％酒精固定过夜。1000rpm/10min离心去乙醇，用含1％胎牛血清的PBS洗两次，再以2ml含1％胎牛血清的PBS重悬，加RNase酶(终浓度0.5mg/ml)消化1小时，然后加PI(2.5ug/ml)染色，冰上放置20min后上流式细胞仪检测。3、结果兴安升麻地上部分总苷在50μg/ml，作用24小时后，可使HepG2停止在G0/G1期。在25μg/ml，12小时使HL-60细胞停止在G0/G1期(表2)及(图8-11)。表2.兴安升麻地上部分总苷对HepG2和HL-60细胞周期的影响实施例4二苯代苦味肼基(DPPH)自由基清除抗氧化试验1、材料与方法DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一种比较稳定的自由基，其N上有1个游离电子，因此在517nm处有最大的吸收蜂，其甲醇溶液呈紫色。加入抗氧化剂以后，DPPH捕捉1个电子与游离电子配对，在517nm处的吸收消失，紫色褪去。因此通过测定加入抗氧化剂后，DPPH在517nm处吸收值的下降可以看出抗氧化剂对DPPH的清除作用。加兴安升麻地上部分总苷至DPPH(浓度为2.4mg/mlMeOH)中，反应1.5小时后，在UV上测定其吸光度，检测波长为515nm。空白样品+甲醇对照二甲基亚砜(DMSO)+DPPH样品样品+DPPH自由基清除率SR＝(1-A1/A0)*100％A1样品的吸光度A0对照的吸光度2、结果兴安升麻地上部分总苷能使吸光度值降低，有很好的清除自由基的作用，且呈剂量依赖关系(图12)。实施例5羟自由基清除及其DNA损伤保护试验1、材料TOPCOUNT发光测定仪、PH测定仪、BMG96孔板、邻菲罗啉(3500uM)、硫酸铜(500Um)、维生素C(3500uM)、过氧化氢(3％)、DNA，Sigma产品、醋酸、醋酸钠其他试剂均为市售分析纯2、方法Cu2+-抗坏血酸-H2O2作用可产生羟自由基，后者与邻菲罗啉(phen)作用产生化学发光。在这一体系中加入DNA，羟自由基同时可与DNA作用，引起DNA结构损伤，并且伴随这一过程在445-450nm有一大于与phen单独作用时发光强度的特征性发光。因此，分别检测加入DNA前后的发光强度，可间接反映药品对羟自由基的清除能力及其对DNA损伤的保护程度。取BMG96孔黑色不透光板一块，放置冰块上预冷。分别加入预冷的Cu2+-phen10μl/孔，Vc10μl/孔，DNA(10ug/ml)10μl/孔(测羟自由基清除试验时不加)，H2O220ul/孔，(空白孔不加H2O2)，待筛样品10μl/孔(对照孔加等量溶剂)，各孔用醋酸缓冲液(0.1M，PH5.5)补至100ul。充分混匀，立即上Topcount测定发光强度值。并计算抑制率。抑制率(％)＝(对照-样品)/(对照-空白)*100％。丹酚酸B作为阳性对照。3、结果以发光强度为纵坐标，以时间为横坐标，记录样本发光动力学曲线，结果见图13-16。加入DNA后可见反应的峰值较未加前有明显升高。兴安升麻地上部分总苷和阳性药丹酚酸B都能使发光曲线发生明显变化，表现为发光强度峰值和曲线下面积的显著降低。表明兴安升麻地上部分总苷和阳性药丹酚酸B对羟自由基有明显的清除作用并且能有效防止羟自由基造成的DNA损伤(表3，图13-16)。表3.兴安升麻地上部分总苷对羟自由基清除及其DNA损伤的保护作用实施例6升麻地上总苷抑制还氧酶-2的表达1、材料兔多克隆抗环氧酶-2抗体，抗兔IgG抗体，均购自SantaCruzBiotechnology，Inc.(SantaCruz，CA).蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitorcocktailtablets)，蛋白质标准(BenchMarkTMPre-standProteinladder)购自Invitrogen.蛋白质杂交检测试剂(ECL)购自AmershamPharmaciaBiotech.硝酸纤维素膜购自Schleicher&Schuell(Keene，NH).，其他试剂均为市售分析纯。2、方法在HepG2细胞70％汇合时加入不同浓度的待测药品，以溶剂作对照。5％CO2孵箱37℃培养4.5小时后以冰冷的磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞两次，然后用裂解液裂解细胞，挑出大DNA，收集裂解液以bradford法测定蛋白含量。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白上样量25ug。电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素抹上。将硝酸纤维素膜依次与一抗和二抗孵育，加入ECL检测试剂，在Bio-RadchemiDoc上检测化学发光强度。3、结果升麻地上部分总苷在25，50，100/ml作用4.5小时后，均能抑制环氧酶-2的表达，与对照相比蛋白条带明显减弱，表达下降(图17)。图1-升麻地上部分总苷的细胞毒作用图2-HepG2正常对照图3-HepG2-三尖杉酯碱-20μM-6hr阳性对照图4-HepG2-升麻地上部分总苷-50μg-24hr图5-HL-60-正常对照图6-HL-60-三尖杉酯碱-20μM-6hr图7-HL-60-兴安升麻地上部分总苷-25μg/ml-12hr图8-HepG2-正常对照图9-HepG2-兴安升麻地上部分总苷-50μg/ml-24hr图10-HL-60-正常对照图11-HL-60-兴安升麻地上部分总苷-25μg/ml-12hr图12-兴安升麻地上部分总苷对DPPH自由基的清除及抗氧化作用图13-丹酚酸对羟自由基的清除作用图14-兴安升麻地上部分总苷对羟自由基的清除作用图15-丹酚酸对羟自由基造成的DNA损伤的保护作用图16-兴安升麻地上部分总苷对羟自由基造成的DNA损伤的保护作用图17-兴安升麻地上部分总苷对环氧酶-2表达的抑制作用权利要求1.一种升麻总苷，其特征在于所说总苷是由兴安升麻地上部分提取的，主要含有三萜皂甙类成分。2.如权利要求1所说升麻总苷的制备方法，其特征在于所说方法是将升麻地上部分药材粉碎过筛后，以10倍量的80％乙醇加热回流提取3次，提取完毕，过滤，滤液减压浓缩，加入吸附剂(硅胶或硅藻土)进行柱层析，先以工业己烷洗去油脂，再用乙酸乙酯洗脱，得到的乙酸乙酯部分经减压浓缩得总苷，收率为6-7％。3.如权利要求1所说升麻总苷在制备肿瘤治疗药物及清除自由基肿瘤化学预防药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种兴安升麻地上部分总苷及其在肿瘤治疗和肿瘤预防抗氧化损伤中的应用，所说总苷是将升麻地上部分药材粉碎过筛后，用80％乙醇加热回流提取，过滤，减压浓缩，加入吸附剂(硅胶或硅藻土)进行柱层析，先以工业己烷洗去油脂，然后用乙酸乙酯洗脱，得到的乙酸乙酯部分经减压浓缩得总苷，工艺简单，收率提高，成本降低，极有利于工业化生产，药效学实验证明，所说总苷可望用于制备肿瘤化学预防和治疗药物。文档编号C07G3/00GK1580062SQ20041000899公开日2005年2月16日申请日期2004年3月23日优先权日2004年3月23日发明者肖培根,田泽,斯建勇,陈迪华,潘瑞乐申请人:肖培根