专利名称：加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用加热使表达嗜热蛋白的基因工程菌破碎，从而提取细胞内嗜热蛋白的方法。
背景技术：
细胞是生物体结构和功能的基本单位。对于原核生物来说，一个细胞就是一个生物体。原核生物通过细胞壁和细胞膜将细胞内物质和细胞外环境分开。微生物产生的物质有些分泌于细胞外，如淀粉酶等，而另外则有一些存在于细胞内。为了提取细胞内的蛋白、酶、多肽和核酸等生化物质，需要进行细胞破碎。所谓细胞破碎，就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离，除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化。
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同的细胞和不同的用途。破碎细胞的方法可分为机械法和非机械法两大类。机械法包括压榨法、高速珠磨机法、超声波法等方法。非机械法方法很多，包括冻融法、化学处理法、生物酶降解等方法。
压榨法是使用高压匀浆器，高压匀浆器由可产生高压的正向排代泵和排除阀组成，排除阀有狭窄的小孔，其大小可以调节。破碎时，细胞浆在高压下从排除阀的小孔中高速冲出，射向撞击环上，由于减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。为了控制温度的升高，可以在进口处用干冰调节温度。影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆阀的次数，另外，菌体种类和生长环境也有影响。
高速珠磨机法的原理是将细胞悬液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞破碎。工业上使用高速珠磨机。破碎程度与搅拌转速、细胞悬液的浓度、循环速度、玻璃小珠的装量、珠体直径和温度有关。由于操作中易产生热量，磨室温度很容易升高，较小的设备可用冷却夹套来调节磨室温度，大型设备中的热量排除则很困难。
超声波具有频率高、波长短、定向传播等特点，当超声波在液体中传播时，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用，产生一个极为强烈的冲击力，由它引起的粘滞性旋涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，使细胞破碎。破碎效果和超声声强、振幅、介质的离子强度、pH值、菌体种类和浓度有关。超声法的最大问题是产生的热量不容易驱散，影响了它在大规模工业生产上的应用。
酶解法是利用酶分解破坏细胞壁的化学键，降解细胞壁，然后细胞膜随之因渗透压破裂。酶解作用需要选择适宜的酶系统，并要控制特定的反应条件，如温度和pH值，有时要配合其它的处理，如辐射、渗透压冲击、冻融等以获得一定的效果。酶解法的优点是条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少，便于后期分离。
冻融法是将细胞置于低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下迅速融化，反复多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时破碎。
采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂。酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质，使某些组分从细胞内渗透出来。在一定条件下，表面活性剂能与脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或使其溶解。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿等，这些溶剂能溶解细胞壁的磷脂，使细胞结构破坏，释放胞内物质。化学法对产物释出的选择性好，细胞外型较完整，核酸等杂质释放少。
在微生物大规模发酵后，需要破碎细胞，提取胞内物质时，上述方法都存在一定的缺陷。机械法的最大缺点来自于其自身，一般的大型破碎机器价格昂贵，购买机器使生产的固定成本大大增加。增加机器设备的同时，也相应地增加了工序和繁重的工作量。一般地，机械法要求先将细胞和培养基分离后再将细胞放到机器中破碎，如果培养基中含不溶成分，如玉米浆或玉米淀粉，则用机械法很难完成破碎工作。机器在长时间工作后，会产生大量热量，所以工作一段时间后必须停机散热，严重地影响了工作效率。有的机器一次加工能力有限，在需要大规模破碎细胞时，需要反复多次地加工，因为不断地重复操作，浪费了大量的人力和能量，降低了生产效率。传统的非机械法也存在一些缺点。用生物酶降解法时，每次均加入生物酶，生物酶价格昂贵，使产品成本随之提高，此法只适用于小规模破碎或基因工程药物的生产。冻融法的破碎率一般很低，即使反复多次也不会大幅度提高收率。另外，它会引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。化学法容易引起活性物质失活，并且会给随后的产物纯化带来困难，另外，化学法最大的缺点是影响终产物的浓度。如表面活性剂常会影响盐析过程中蛋白质的沉淀和疏水层析。总之，不论机械法还是非机械法，都增加了生产成本。采用机械法时，因为购买机器及附属设备，增加了固定成本，另外还要安排操作工人，平时机器需要维修保养，增加了变动成本。非机械法一般需要外加某种助剂，变动成本增加。
自上世纪末以来，基因工程技术蓬勃发展，人们将不同的外源基因克隆到原核细胞，尤其是大肠杆菌中，使原核细胞能够表达外源蛋白。将嗜热蛋白基因克隆到原核细胞中表达嗜热蛋白是近年来的研究热点。
极端环境下存在很多生物，这些生物在亿万年的进化过程中形成了适应外部环境的能力。很多生物可以在极高温度下生长，嗜热古菌就是一种生长在高温条件下的微生物。最早的古菌发现于深海，后来又在火山口和一些极端高温的大陆环境中被发现。来自嗜热古菌的蛋白分子都具有独特的生化特性，它们普遍具有很强的热稳定性。普通的蛋白质分子只在常温条件下具有活性，在超过50℃的高温条件下会失活，而嗜热古菌的蛋白分子恰恰在高温条件下非常稳定，并且具有很强的活性，嗜热古菌的酶能在高温下催化反应。
随着基因工程和蛋白质技术的发展，通过基因工程技术可以把嗜热古菌的嗜热蛋白基因转入到中温宿主如大肠杆菌中进行表达，这样就能在温和的培养条件下得到大量外源嗜热蛋白。
原核细胞表达外源蛋白时，有时将其分泌到细胞外，但大多数时候，外源蛋白在胞内表达，所以人们面临如何破碎细胞以提取外源蛋白的问题。上述的超声法、压榨法等就是人们经常采用的方法。表达外源嗜热蛋白的基因工程菌在培养基中发酵结束后，我们也要破碎细胞，提取嗜热蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过加热发酵液，使表达嗜热蛋白的基因工程菌破碎，进而从基因工程菌中提取嗜热蛋白的方法。
原核生物因衰老或某种外界原因死亡后，细胞会发生自溶，这时细胞壁和细胞膜发生裂解，释放出胞内物质。因为原核生物的适宜生存温度在室温左右，所以在高温条件下，它会遇热死亡，这时，细胞会发生破碎。根据这一特点，我们对基因工程菌的发酵液加热使其升温，此时细胞大量死亡、破碎，而外源基因表达的嗜热蛋白对高温具有抗性，不会受高温影响，所以随着菌体破碎，胞内所含的嗜热蛋白被释放到发酵液中，从而达到破碎目的。嗜热蛋白因为其耐热性，依然保持活力。固液分离后，嗜热蛋白留在上清中，菌体碎片和其它变性蛋白被除去。
本方法虽然不适用于表达普通蛋白的微生物细胞的破碎，因为在高温条件下，普通细胞死亡、破碎的同时，胞内的蛋白会同时失活，产物被破坏。但基因工程构建的嗜热蛋白工程菌则不同，菌体遇热破碎后，胞内表达的嗜热蛋白不会被高温破坏，从而达到破碎的目的。嗜热古菌Aeropyrum pernix KI来源于日本深海火山口，最适生长温度为95℃。该菌表达数种蛋白基因，其中包括表达谷氨酸脱氢酶的基因和表达嗜热酯酶的基因。由于嗜热古菌(包括来源于日本深海火山口的嗜热古菌)人工培养困难，生长周期较长，所含谷氨酸脱氢酶以及嗜热酯酶的量非常低，因此不能直接利用古菌培养物来生产谷氨酸脱氢酶。将谷氨酸脱氢酶基因和嗜热酯酶基因转入可快速繁殖、培养条件简单的常温宿主如大肠杆菌内，可大量地表达上述的酶。
在我们前面申请的专利中(ZL03111700.7，申请日2003-05-16，名称嗜热酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其应用)，通过对来源于日本深海火山口的嗜热古生菌Aeropyrum pernix KI的培养、嗜热酯酶/磷脂酶A2目的基因的钓取、构建表达载体及将载体转化到E.coli BL21(DE3)Codon Plus宿主细胞4个步骤，我们得到了一株嗜热工程菌，该工程菌菌株于2002年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0844，分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)JDA1。
上述专利中所涉及的嗜热古菌Aeropyrum pernix KI是一种已知菌种，其于1993年在日本鹿儿岛附近的海底火山口被发现，并于1996年被保存于日本理化学研究所微生物保存施设(Japan Collection of Microorganisms，RIKEN(The Institute ofPhysical and Chemical Research)，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198，Japan；Phone+81 48 467 9560，Fax+81 48 462 4617)，保存编码为JCM9820T，在文献(CompleteGenome Sequence of an Aerobic Hyper-thermophilic Crenarchaeon，Aeropyrum pemixK1，DNA Research 6，83-101(1999))的90-101页详细报道了该嗜热古菌的全基因组序列，该文献的第83-85页，描述了该菌生长温度等特性，记载了为获得全基因组序列所使用的实验材料及方法，以及实验结果及数据分析讨论等。任何人均可以以商品的形式从日本理化学研究所购得在上述专利中应用到的原核表达质粒pET15b载体，可以购自美国Novagen公司，该公司的网址是http://www.Novagen.com，在该公司的网站上列出了包括pET15b在内的载体，以及各种载体的性能、价格等信息，文献(PET15b-BCGHSP65-GP2重组质粒的构建与鉴定”，蚌埠医学院学报2002年9月第27卷第5期，383-384；王丽娟等)、文献(人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达”，科学通报，1999年3月第44卷第6期，637-642)所用载体均是购自该公司。另一方面，因该载体使用普遍，世界范围内的科研协作日益密切，该载体也可以是由本领域内的研究人员从商业公司购买后培养贮存并相互赠予，如文献(人内皮抑素基因的克隆及其表达产物抗肿瘤活性”，南京军医学院学报，2002年3月第24卷第1期，1-3)的记载。
在上述专利中应用到的大肠杆菌BL21(DE3)Condon Plus是大肠杆菌(Escherichia coli)中的一种菌株，是一种在本领域普遍使用的宿主细胞，如文献(Functional identification of AtTPS03 as (E)-β-ocimene synthasea monoterpenesynthase catalyzing jasmonate-and wound-induced volatile formation in Arabidopsisthaliana，Planta(2003)216745-751)第746页所述，该文献将质粒pSBET-AtTPS03转化到该宿主细胞中，表达了酶AtTPS03，并说明了相关的实验材料及方法。在该文献746页右栏中同时指出了该菌的来源，即Startagene公司，该公司的网址是http://www.stratagene.com/homepage/，在该公司的主页上，介绍了该公司的组成、历史、联系方式及主要产品分类目录，想购买生物技术产品的客户，通过该公司给定的联系方式，即可买到相应产品。该专利中提到的大肠杆菌BL21(DE3)Condon Plus属于Cloning类。在文献(Geobacter sulfurreducens Has TwoAutoregulated LexA Genes Whose Products Do Not Bind the recA PromoterDifferingResponses of lexA and recAto DNA Damage；Joumal of Bacteriology，Apr.2003，p2493-2502)中，同样使用到了该菌种，这些表明该菌种在本领域内已广为使用，且可从公众渠道获得。
采用与上述专利同样的构建方法、表达载体和宿主细胞，我们从嗜热古生菌Aeropyrum pernix KI中钓取表达嗜热酯酶的基因，将其装载在pET15b载体上，然后转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)codon plus宿主中，进而得到又一株嗜热工程菌，该工程菌菌株于2002年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0845。分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli JDA2)。
采用与上述专利同样的构建方法和表达载体，我们得到在E.coli BL21(DE3)codon plus宿主中表达的谷氨酸脱氢酶的基因工程菌，命名为JDA4。
另外我们还将上述的嗜热酯酶基因装载在pET15b载体上，转入到E.coliBL21-SI宿主中，得到一株工程菌，命名为JDA5。
本发明提供的加热破碎的方法是表达嗜热蛋白的工程菌经发酵培养后，将发酵液加热，使其迅速升温到50℃-100℃，保温5-500分钟后，将热处理后的发酵液离心或过滤，留取上清，得到含嗜热蛋白的溶液；或将表达嗜热蛋白的工程菌发酵液离心或过滤，得到菌体后，将其重悬于水溶液或缓冲液中，加热菌液使其迅速升温到50℃-100℃，保温5-500分钟后，将热处理后的溶液离心，留取上清，得到含嗜热蛋白的溶液。
上述方法中，菌种发酵培养需经过二级放大，一级放大一般采用LB培养基，二级放大一般采用可溶的培养基如LB培养基或不可溶的培养基如玉米浆培养基。
进一步的优选方式为，上述方法中，升温到60℃-90℃，保温10-300分钟。
上述方法中所述及的菌种发酵培养、离心、过滤、菌体重悬以及缓冲液的种类等均为常规技术，具体可参见《生化实验方法和技术》，(张龙翔、张庭芳、李令媛主编，高等教育出版社，2003年)。
本方法与传统的机械法、非机械法相比的最大优势是操作方便，效率高，工序简单，不增加成本，绿色环保。
本方法和机械法相比较。利用机械法破碎细胞需要购买机器设备，购买机器使生产的固定成本增加，机器的价格从几万到几十万元不等，同时又增加了工序，需要安排新的操作工人。机器易发生故障，而且一般有工作的上限要求，每次只能加工一定数量的发酵液，需要大量破碎细胞时就要分批操作，工作相当繁复，效率低下。工作时间稍长机器就会产生大量热量，所以需要经常地停工散热。使用超声机时，超声对人体能造成致命危害，是一种极度有害的污染源。本方法彻底克服了机械法的缺点，无须外购设备，不增加固定资产，成本大大降低。细胞生长结束后，直接将反应器升温，细胞遇热死亡、破碎，释放出胞内的嗜热蛋白，操作简单。不论对多大的反应体系，破碎过程一次完成，工序简化，无须分批操作。整个操作过程都在反应器中进行，无污染。因为不需要使用新的机器设备，所以也不用增加工人数量，节省人力。
本方法和冻融法相比较。冻融法也需要购买外部设备——冷冻设备，它的一次加工能力有限，大规模生产时需要分批加工，另外，冻融法破碎细胞需要反复地将发酵液冷冻和融化，工作量大，程序烦琐，本方法完全克服了上述缺点。
本方法与化学法和生物酶解法相比较。化学法和生物酶解法都采取外加其它物质的方法破碎细胞，变动成本增加，尤其是溶菌酶，价格昂贵，无法用在大规模的工业生产上。而化学法除了成本高外，所使用的有机溶剂又会造成污染，使活性物质变性，后处理麻烦。本方法无须外加其它物质，成本低，绿色环保，对产品和环境都无不良影响。
在大规模工业生产时，本方法优点尤其突出，几吨到几十吨的反应体系中，需破碎时细胞时，利用本方法，只需简单地加热培养液即可达到破碎目的。反应体系即使大幅度增大，对生产成本和工作强度均无影响。
另外，工业生产上，培养基中经常含有不溶物质(如玉米淀粉、玉米浆等)，当细胞生长结束后，细胞和不溶性培养基很难分离，这给后期细胞破碎带来困难，采用本方法能彻底解决这一问题，用本方法时，无须分离菌体和培养基，直接加热菌体后，细菌破碎，胞内嗜热蛋白释放到上清中，利用离心或过滤方法去掉菌体和培养基留上清即可。
以前曾有人利用自溶法破碎细胞。但他们所使用的自溶法从原理到操作方法都与本方法有根本不同。从原理上看，传统自溶法是利用细胞在本身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)作用下，发生溶解。而我们的方法则是利用热处理使细胞死亡、破碎。从具体的操作方法上，传统方法是给予细胞中各种自溶酶发挥活性的外界条件，调节温度、pH、离子浓度等到最佳条件使自溶酶水解细胞壁、细胞膜，细胞发生自溶，释放胞内物质。而我们的加热法仅需提高温度杀死细胞使其自溶来实现。利用传统自溶方法破碎细胞时操作条件要求苛刻，需要满足自溶酶的最适反应条件，而加热破碎法则对条件没有苛刻要求，生产条件容易控制，只要迅速升温到一定温度保温即可。传统方法中，在给定的反应条件下，细胞内有的酶可把某些有效成分分解，对产率造成负面影响，而加热破碎法则在快速升温的过程中将胞内的除外源嗜热蛋白外的所有酶全部灭活，细胞内的酶不会分解产物，所以不会影响产率。传统自溶法应用于普通细胞，主要是真核细胞，而加热破碎只应用于表达嗜热蛋白的基因工程菌。
针对传统方法的缺点以及嗜热酶具有的抗热变性的特点，我们发明的加热法破碎基因工程菌，提取胞内表达的嗜热蛋白，本方法彻底克服了传统方法的缺点，在高效率破碎细胞的同时，无须购买任何其它设备，也不须填加外来物质，降低了成本，简化了工序，生产中无须增加操作人员。生产方法绿色环保。
图1 热破碎与超声破碎所得蛋白质成分比较的蛋白电泳图；图2 JDA2菌株热破碎不同时间的酯酶活力变化曲线；图3 JDA4菌株热破碎不同时间的谷氨酸脱氢酶活力变化曲线；图4 JDA5菌株热破碎不同时间的酯酶活力变化曲线；如图1所示，1为标准蛋白质；2为JDA2菌株80℃热破碎1小时，离心后所得上清液；3为JDA2菌株超声破碎离心后所得的蛋白上清液。
具体实施例方式
实施例1超嗜热酯酶基因工程菌JDA2在发酵液中的原位加热破碎从-70℃保存的JDA2菌种中按2％接种量接到5毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养，过夜，作为一级种子液；从一级种子液中取菌种，按2％接种量接到装有100毫升含氨苄的LB培养基中，37℃300转振荡培养，当菌体OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导，25℃培养12小时；
取10毫升发酵液，将其迅速加热至80℃，保温1.5小时。离心，除去沉淀，测上清液中的酶活力。超嗜热酯酶活力为40000U/ml发酵液。
酯酶活力测定方法以对硝基苯酚辛酸酯作为脂肪酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mM Tris-HCl(pH8.0)，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mM，加入酶液后，启动反应，80℃，用日立557型紫外分光光度计测定样品420nm的光吸收值随时间的变化。1个酶活力单位是1分钟水解底物生成1nmol对硝基苯酚(ε＝0.016M-1cm-1)所需要的酶量。
实施例2超嗜热酯酶基因工程菌JDA2发酵液离心后加热破碎将-70℃保存的JDA2菌种按2％接种量接到5毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养6小时，作为一级种子液。
从一级种子液中取菌种按2％接种量接到装有100毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养，当菌体OD600值达到0.6-0.8时，IPTG诱导，25℃培养12小时。
取100毫升发酵液，10000转离心10分钟，加入10毫升pH8.0的50mMTris-HCl缓冲液重悬细胞，10000转离心10分钟，洗涤细胞，反复3次。将湿菌体悬浮于10毫升pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中，振荡，摇匀。将溶液迅速加热至80℃，保温不同时间。每20分钟取样一次，离心，除去沉淀，测上清液超嗜热酯酶活力。
另取一份细胞悬浮液，超声破碎4分钟，破碎过程中每超声5秒钟后停止5秒钟。将超声破碎和热破碎后的菌液10000转离心10分钟，取上清液做10％SDS-聚烯酰胺凝胶电泳，比较热破碎和超声破碎效果。
从图1可见，利用加热法破碎所得的蛋白只有一条电泳主带，该电泳带分子量范围与超嗜热酯酶一致，而超声破碎得到了包含超嗜热酯酶的大肠杆菌全菌体可溶性蛋白，表现为很多条带。从这里可以看出，利用加热法可以在破碎菌体的同时，直接除去杂蛋白，而超声法则没有这种作用。
加热破碎菌体时酶活力随不同加热时间的变化情况，见图2。随着加热时间的延长，溶液中超嗜热酯酶的活力逐渐上升，说明基因工程菌JDA2随加热时间的延长而逐渐破碎，超嗜热酯酶被逐渐释放到溶液中。破碎时间达到120分钟时，溶液中酶活力为32000U/ml，继续加热到200分钟，溶液中酶活基本保持稳定。这表明120-200分钟菌体破碎度达到稳定程度。为减少加热引起的能量消耗，对于JDA1基因工程菌发酵液，80℃加热破碎120分钟即可。
实施例3超级嗜热谷氨酸脱氢酶基因工程菌JDA4发酵液离心后加热破碎将-70℃保存的JDA4菌种按2％接种量接到5毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养6小时，作为一级种子液。
从一级种子液中取菌种按2％接种量接到装有100毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养，当菌体OD600值达到0.6-0.8时，IPTG诱导，25℃培养12小时。
取100毫升发酵液，10000转离心10分钟，加入10毫升pH8.0的50mMTris-HCl缓冲液重悬细胞，10000转离心10分钟，洗涤细胞，反复3次。将湿菌体悬浮于10毫升pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中，振荡，摇匀。将细胞悬浮液迅速加热至80℃，保温不同时间。每20分钟取样一次，离心去沉淀，测上清液酶活力。结果见图3。可以看到，溶液中超级嗜热谷氨酸脱氢酶随着加热时间的延长酶活力逐渐提高，120分钟后，酶活力达到稳定值，继续加热到200分钟，活力基本不变，破碎进入稳定期。
谷氨酸脱氢酶活力测定方法谷氨酸脱氢酶活力用在340nm的光吸收值随时间变化来测定。在1毫升的100mM pH7.6的磷酸缓冲体系中，含有100M NADP和10mM L-谷氨酸钠，90℃条件下，加入重组的谷氨酸脱氢酶启动反应，观测样品在340nm光吸收随时间的变化值。在标准的测定条件下，每分钟催化1nmol底物反应所需的酶量定义为1U。
实施例4超级嗜热酯酶基因工程菌JDA5的加热破碎将-70℃保存的JDA5菌种按2％接种量接到5毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养6小时，作为一级种子液。
从一级种子液中取菌种按2％接种量接到装有100毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养，当菌体OD600值达到0.6-0.8时，加入6M NaCl至终浓度为0.3M以诱导重组蛋白的表达，25℃培养12小时。
取100毫升发酵液，10000转离心10分钟，加入10毫升pH8.0的50mMTris-HCl缓冲液重悬细胞，10000转离心10分钟，洗涤细胞，反复3次。将湿菌体悬浮于10毫升pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中，振荡，摇匀。将细胞悬浮液迅速加热至80℃，保温不同时间。每20分钟取样一次，离心去沉淀，测上清液酶活力。由图4可见，随着加热时间的延长，菌体破碎释放的超级嗜热酯酶越来越多。120分钟后，溶液中的酶活达到稳定值；继续加热到200分钟时，酶活力变化不大。
结果显示，对于不同的蛋白，只要该蛋白具有高耐热性，均可以用加热法破碎细胞以提取该嗜热蛋白。该方法也适用于不同微生物细胞的破碎。
实施例5超嗜热酯酶基因工程菌JDA2在玉米浆培养基中的原位加热破碎从-70℃保存的JDA2菌种中按2％接种量接到5毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养，过夜，作为一级种子液。
从一级种子液中取菌种，按2％接种量接到装有100毫升含氨苄的不溶性的玉米浆培养基中，37℃300转振荡培养，当菌体OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导，25℃培养12小时。
取10毫升发酵液，将其迅速加热至80℃，保温1.5小时。离心，除去沉淀，测上清液中的酶活力。超嗜热酯酶活力为40000U/ml发酵液。
实施例6超嗜热酯酶基因工程菌JDA2发酵液离心后重悬在水溶液中的加热破碎将-70℃保存的JDA2菌种按2％接种量接到5毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养6小时，作为一级种子液。
从一级种子液中取菌种按2％接种量接到装有100毫升含氨苄的LB培养基中，37℃，300转振荡培养，当菌体OD600值达到0.6-0.8时，IPTG诱导，25℃培养12小时。
取100毫升发酵液，10000转离心10分钟，加入10毫升水溶液重悬细胞，10000转离心10分钟，洗涤细胞，反复3次。将湿菌体悬浮于10毫升水溶液中，振荡，摇匀。将溶液迅速加热至80℃，保温1.5小时。离心，测上清液中的酶活力。超嗜热酯酶活力为40000U/ml发酵液。
本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围，本专利的应用范围应包括所有已知的和未知的嗜热蛋白和表达该蛋白的菌株。本领域研究人员在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
权利要求
1.一种加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于表达嗜热蛋白的工程菌经发酵培养后，将发酵液加热，使其迅速升温到50℃-100℃，保温5-500分钟后，将热处理后的发酵液离心或过滤，留取上清，得到含嗜热蛋白的溶液；或将表达嗜热蛋白的工程菌发酵液离心或过滤，得到菌体后，将其重悬于水溶液或缓冲液中，加热菌液使其迅速升温到50℃-100℃，保温5-500分钟后，将热处理后的溶液离心，留取上清，得到含嗜热蛋白的溶液。
2.如权利要求1所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于工程菌发酵培养需经过二级放大，一级放大采用LB培养基，二级放大采用可溶的培养基或不可溶的培养基。
3.如权利要求2所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于可溶的培养基为LB培养基，不可溶的培养基为玉米浆培养基。
4.如权利要求1所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于升温到60℃-90℃，保温10-300分钟。
5.如权利要求1所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于缓冲液为pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液。
6.如权利要求1所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于表达嗜热蛋白的工程菌是从嗜热古生菌Aeropyrum pernix KI中钓取表达嗜热酯酶的基因，将其装载在pET15b载体上，然后转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)codon plus宿主中，得到的嗜热工程菌-大肠埃希氏菌(Escherichia coli JDA2)。
7.如权利要求1所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于表达嗜热蛋白的工程菌是在E.coli BL21(DE3)codon plus宿主中表达的谷氨酸脱氢酶基因的工程菌。
8.如权利要求1所述的加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其特征在于表达嗜热蛋白的工程菌是嗜热酯酶基因装载在pET15b载体上，转入到E.coli BL21-SI宿主中得到的嗜热工程菌。
全文摘要
本发明涉及一种加热破碎基因工程菌以获取嗜热蛋白的方法，其步骤如下，表达嗜热蛋白的工程菌经发酵培养后，将发酵液加热，使其迅速升温到50℃－100℃，保温5－500分钟后，将热处理后的发酵液离心或过滤，留取上清，得到含嗜热蛋白的溶液；或将表达嗜热蛋白的工程菌发酵液离心或过滤，得到菌体后，将其重悬于水溶液或缓冲液中，加热菌液使其迅速升温到50℃－100℃，保温5－500分钟后，将热处理后的溶液离心，留取上清，得到含嗜热蛋白的溶液。本方法与传统的机械法、非机械法相比的最大优势是操作方便，在高效率破碎细胞的同时，无须购买任何其它设备，也不须填加外来物质，降低了成本，简化了工序，生产方法绿色环保。
文档编号C07K14/195GK1631897SQ20041001138
公开日2005年6月29日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者冯雁, 任晓冬, 于大为 申请人:吉林大学