专利名称：一种乳凝集素功能肽以及制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，可应用于抗轮状病毒感染、调节婴幼儿胃肠道免疫功能及肠上皮细胞功能成熟，以及应用于婴幼儿保健领域。
背景技术：
大量的流行病学调查显示，全世界轮状病毒感染是引起儿童腹泻的最主要病因。在发展中国家每年约有870,000个5岁以下儿童死于该病，占5岁以下儿童腹泻病死亡人数的25％，占所有病因死亡人数的6％。其中轮状病毒GroupA是在人类流行最广的一型，估计每年由GroupA引起的死亡人数约800,000。经调查我国每年5岁以下小儿腹泻病患病达2.5亿次，初步统计表明至少有10万儿童死于轮状病毒感染腹泻。但目前尚无特效的抗轮状病毒药物。由此可见，轮状病毒腹泻造成了重大的社会和经济影响。
1997年WHO正式将发展轮状病毒疫苗列为首要的疫苗发展目标。目前已列为侯选疫苗包括有减毒人轮状病毒疫苗(human rotavirus vaccinHRV)Wa株、M37、MCN13等株，但它们的保护性作用不稳定，如Wa疫苗在费城的保护率为76％，在辛辛那提的保护率为100％，而在中国上海的保护率为49.6％。最近发展的四价重配株疫苗(rhesus rotavirus RRV-TV)虽然有可靠的安全性但保护性在不同国家仍有较大波动。尽管美国已将该疫苗试用计划接种，但昂贵的价格阻碍了其在发展中国家的应用。
近来母乳的研究在抗轮状病毒感染方面有了新的进展，研究发现在发展中国家和发达国家，母乳喂养儿中腹泻病发病率较人工喂养儿低，尽管也有一些研究表明腹泻病的发病率在两者中相似，但可以肯定母乳喂养儿轮状病毒感染后症状轻于人工喂养儿。通过亲和层析纯化得出乳凝集素(Lactadherin)是母乳中与轮状病毒交联最强和抗病毒特异性最高的成分，而配方乳中不含Lactadherin，因此对Lactadherin的进一步研究将有望为抗轮状病毒感染提供新的思路。
Lactadherin是一种N端糖基化的46KD大小具有免疫原性的糖蛋白，由364个氨基酸组成，含有表皮生长因子(EGF)样结构的Arg-Gly-Asp(RGD)N端，能与αVβ3整合素(αVβ3-integrin)交联。Hamosh检测了母乳中Lactadherin的含量约为93±10mg/ml，以初乳中含量较多，但对Lactadherin的生理功能目前了解尚少。在不同种系的研究中发现，Lactadherin的结构域在人、鼠和牛中序列相当保守，所以大量的动物乳汁和人工合成的Lactadherin为我们的研究提供了足够的资源。
轮状病毒中VP4(由gene4编码蛋白)是病毒的粘附蛋白，是病毒复制和产生免疫原性的基础，在唾液酸存在下Lactadherin能与病毒交联从而抑制病毒复制、缓解腹泻症状。有研究显示母乳喂养婴儿即使在未出现轮状病毒感染症状时仍可以检测到抗轮状病毒抗体，提示与轮状病毒交联，阻止病毒复制并不是Lactadherin抗轮状病毒的唯一机制。已知食物和微生物抗原刺激后，肠道相关淋巴组织中的肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)增殖并在肠上皮层形成活性T淋巴细胞集落，被激活的IEL具有(1)溶细胞活性；(2)通过分泌细胞因子而产生辅助活性；(3)刺激上皮间细胞更新；(4)对食物过敏原耐受的作用等，从而保护肠道并激发其他淋巴组织产生进一步反应。有研究表明乳腺和血管内皮细胞及淋巴细胞上有αVβ3-integrin，Lactadherin能与之交联并促进这些细胞的增殖，但Lactadherin对淋巴细胞及内皮细胞的所产生的作用和随后引发的肠道保护性免疫作用的确切机制目前尚不清楚。我们已知Lactadherin在胃的任何PH值下均有活性并且结构不被蛋白酶等破坏，保证了Lactadherin以完整的结构和功能到达肠道。我们大胆假设(1)Lactadherin或Lactaherin与轮状病毒交联后能刺激肠上皮T淋巴细胞增殖并产生细胞因子进而引发一系列液免疫反应；(2)轮状病毒感染时肠道绒毛膜上皮细胞随着病毒的大量复制脱落，加速了分泌层细胞的上移，这些尚处于分泌状态的不成熟上皮细胞加重了水、电解质的紊乱。有报道指出母乳特别是初乳通过调节肠道上皮的基因表达促进肠上皮细胞的发育，因此我们将从另一方面探讨Lactadherin加快肠道上皮细胞成熟，替代受损上皮细胞在抗轮状病毒中所发挥的作用。
通过对Lactadherin调节GALT功能和肠上皮细胞成熟作用的研究，来探讨其抗轮状病毒感染的可能机制，为临床开发和利用Lactadherin治疗轮状病毒感染性腹泻提供重要的理论依据。
现有技术是利用柱层析和亲和层析法直接从牛乳中提取目的蛋白质乳凝集素。本法具体是通过收集大量新鲜的(挤出4小时内)未经任何处理的牛乳，根据牛乳中脂肪球膜中的蛋白质分子量的不同，进行层析分离，再利用亲和层析纯化等方法提取得到目的蛋白质。
现有技术有以下不足或缺点原料来源得到大量采集后4小时之内的新鲜未经处理的牛乳困难。
样本质控不同来源的牛乳其质量控制困难。
样本得率利用亲和层析方法分离目的蛋白质过程繁琐、耗时长(约1周)、产量低(0.35ug/ml)、不可控因素多。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种乳凝集素功能肽及其制备方法，它(1)不需要必须保证新鲜未经任何处理的牛乳，仅需保存重组的DNA即可反复获得新鲜有活性的蛋白质，解决了原材料来源困难问题；(2)得到一种具有可重复提取、足量、纯度高、无毒性、保留抗原性的目的蛋白质。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明方法包括目的基因乳凝集素功能肽的制备，表达质粒的构建，其中质粒选自pET-28a、pET-28b，目的蛋白乳凝集素功能肽的纯化检测等。
目的基因乳凝集素功能肽的制备首先是从人类13种组织混合物中抽提总RNA，应用RT-PCR技术将其反转录成cDNA，以cDNA为模板制备出人乳凝集素功能肽的基因产物。
在得到乳凝集素功能肽基因PCR产物后，可以将该基因用于原核系统表达以获得所需要的目的蛋白，原核表达系统用的最为广泛和最为成热的是大肠杆菌表达系统，用于该系统的表达质粒的构建首先是将PCR制备的目的基因经琼脂糖凝胶电泳分离，QIAGEN公司的胶回收片段柱纯化后，取100ng与50ng pET-28a(+)进行连接，于16℃连接过夜。取5uL连接液转化50uL DH5αtm library efficiency chemically competent cells，转化细胞经42℃热休克50秒，37℃(震荡培养1h后涂于卡那霉素平板，37℃培养过夜.挑取单菌落提取质粒，进行酶切鉴定和基因的DNA序列测定，测定结果完全正确后再将阳性质粒转化入BL-21感受态细胞，检测表达。
BL21/pET-28a(+)乳凝集素功能肽克隆37℃培养过夜，隔日用LBbroth培养基稀释10倍，继续培养3小时，用ITPG诱导表达4～12小时，收集细菌提取蛋白质，利用Triton X-100及超声方法破细胞膜及包涵体膜，加入蛋白酶抑制剂，保护目的蛋白。经超速离心得到上清后后，利用特异性镍螯合的亲和层柝柱(Ni-chelating colum)，通过不同浓度的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液，洗脱得到纯化的目的蛋白。纯化得到的乳凝集素功能肽经SDS-PAGE凝胶电泳检测、特异性单克隆抗体检测，以确证所获蛋白的正确，由于整个蛋白制备过程未经化学变性及复性的过程，保留了蛋白的活性，节约了大量的时间。
本发明所公开(1)一种乳凝集素功能肽；(2)乳凝集素功能肽制备方法。
其优点体现在(1)首次利用蛋白质工程的手段得到目的蛋白质(乳凝集素功能肽)；(2)利用所采用方法得到的目的蛋白质具有可重复提取、足量、纯度高、无毒性、保留抗原性的特点；(3)解决了原有方法所带来的各种困难；(4)为目的蛋白质的进一步研究和应用提供了质与量的保证；
(5)提供了目的蛋白质产业化的方法。
图1显示乳凝集素功能肽基因的PCR产物。M、DNA marker(100bpladdermarker，2000，1500，1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100)PCR产物(MFGE8)，MFGE8即乳凝集素功能肽基因。
图2显示乳凝集素功能肽重组质粒结构。
图3显示酶切方法鉴定质粒构建成功。
图4显示酶切鉴定正确的重组质粒进行DNA测序结果。
图5显示乳凝集素功能肽表达情况的结果。M、标准分子量蛋白1、诱导表达全菌蛋白2、破菌上清3、包涵体溶解后沉淀4、包涵体溶解后上清5、纯化时流穿组分6、纯化的MFGE8蛋白。
图6显示乳凝集素功能肽表达后SDS PAGE电泳结果。
图7显示特异性单克隆抗体Western blot检测结果。
图8显示牛乳中提取目的蛋白质Sepharys-200过柱结果(纯化前)。
图9显示牛乳中提取目的蛋白质亲和层析结果(纯化后)。
图10显示两种方法所得目的蛋白定量分析结果，A N-5构建质粒所表达纯化蛋白，A 4牛乳中所提取蛋白图11显示MFGE8基因序列。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1一、材料
13种组织由上海睿星基因技术有限公司供应；PCR-Kit购于TAKARA公司；Taq酶、DNA分子量标准购于上海生物工程公司；限制性内切酶、T4连结酶购于NEB公司；菌种与质粒转化细胞(DHa-MAX、BL-21)购于Novagen公司；pET-28a购于Promega公司；PCR引物由上海睿星基因技术有限公司合成。
试剂ITPG购于Sigma公司；亲和层析柱购于Roche公司；His-tag抗体购于Pharmingen公司。
二、方法(1)13种组织混合物总RNA提取1)取13种组织混合物(见表1)，用TES洗涤，离心弃上清；2)加入2ml Trizol缓冲液剧烈震荡转移至2ml的离心管中；3)加入400uL氯仿剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃ 14000rpm离心10分钟，取上清，加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀静置5分钟离心15分钟速度同上；4)弃上清，沉淀用70％乙醇洗3次，室温干燥；5)沉淀用50uLDEPC溶解，取5uL提取RNA，加入495uL蒸馏水水稀释至500uL，测A260/A280比值，当比值大于1.8时证明提取RNA较纯；6)将RNA浓度调至1～1.2ug/uL，待用。
(2)设计可行性引物MFGE5 gcgccatgggcCTGGATATCTGTTCCAAAAACCCCTGC
MFGE3 gcgctcgagACAGCCCAGCAGCTCCAGGC。
(3)RT-PCR(V＝50uL)2times Bcalstbutter 25uL25mM MgSO410uL10mM dNTP 5uLRnase inhibitor 2.5uLOligo dTPrimer1uLRNA 2uLRnase free H2O3.5uLBcaBEST polymerase1uL反应条件65℃ 1分钟后30℃ 5分钟，15分钟内缓慢升温至65℃(每30秒升温1.2℃)，持续65℃15分钟，随后在98℃ 5分钟灭活反转录酶，4℃保存。
(4)cDNA PCR(V＝50uL)25mM MgSO43uL5times Bca 2nd butter 10uL10mM dNTP 5uLprimer forward1uLprimer reverse1uLBca-optimized Taq 1uLRT-PCR产物20uL反应条件94℃ 1分钟，再按如下程序扩增35个循环94℃ 30秒，56℃ 1分钟，72℃ 2分钟。后72℃延伸10分钟。反应结束后，取5uL反应产物经1.5％琼脂糖电泳，验证是否扩增成功(见图1)。
(5)目的片断回收向PCR反应产物中加入NaAC(pH 5.2)3uL，加入预冷的无水乙醇1ml放入-20℃冰箱20分钟，14000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗2次，真空干燥。沉淀溶于50uL水中。
(6)酶切PCR产物及载体(V＝50uL)10times buffer 2 5uL酶Nde I 2.5uLXhoI 2.5uLBAS 1uLPCR产物或载体40uL37℃隔夜。
(7)pET-28a-乳凝集素功能肽重组质粒的构建胶纯化酶切产物，酶切产物的连接；酶切载体 3uL酶切PCR产物 1uLT4连接酶 1uL10times buffer 2uLH2O 13uL连接16℃过夜。
将连接产物转DH5αtmlibrary efficiency chemicallycompetent细胞内(为最高效率转化细胞)，37℃培养隔夜，挑克隆扩增，抽提DNA。
(8)阳性克隆的鉴定1)培养后挑取菌落提取质粒进行限制性内切酶酶切鉴定(见图3)2)将酶切鉴定正确的重组质粒进行DNA测序分析。
测序引物正向14A；5’tgagcggataacaattcccctc 3′反向PR25’CTAGTTATTGCTCAGCGG 3′。
测序的结果见图4与基因文库一致见图11，参阅基因文库LOCUS NM_005928。
(9)pET-28a/乳凝集素功能肽蛋白表达1)将构建成功的质粒转化如BL-21感受态菌中，涂平板过夜；2)取克隆培养于50ml LB培养基中，加入50ug/ml卡那霉素，37℃震荡培养箱过夜；3)次日用LB培养基稀释10倍，37℃继续孵育3小时后，加入ITPG(isopropyl β-σ-thiogalactopyranoside)继续孵育4小时，离心收集细菌，转速7000rpm，20分钟，弃上清；4)加入10ml 1×PBST(0.5％Triton X-100)超声破细胞膜，超速离心，转速18000rpm，15分钟，提取上清，待纯化。
(10)蛋白纯化将上清液(含有目的蛋白)利用特异性镍螯合的亲和层析柱(Ni-chelating colum)，用结合缓冲液5mM imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris HCl PH7.9、洗涤缓冲液60mM imidazole，0.5M NaCL，20mM Tris HCL PH7.9、洗脱缓冲液1M imidazole，0.5M NaCL，20mM Tris HCL PH7.9，将含有6个组氨酸的目的蛋白洗脱下来，得到纯化蛋白质。
(11)蛋白鉴定将所得纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，部分胶进行染色观察条带(见图6)，部分胶用于做Western Blot，利用组氨酸tag的特异性抗体明确目的蛋白(见图7)。
比较例从牛乳中提取乳凝集素的实验方法(1)牛乳脂肪提取新鲜未经任何处理牛乳(挤出4小时内使用或立即冻于-80度冰箱内待用)中加入1Mm phenylmethylsulforyl fluoride(phMeSO2F)，离心1小时，提取表层脂肪。
(2)Buffer milk的制备缓冲液洗牛乳脂肪2次(buffer0.14MNaCl，3Mm KCL，8Mm Na2HPO4，2Mm KH2PO4PH7.4)，将牛乳脂肪稀释为35％，小孔筛网过滤，得到Buffer milk。
(3)牛乳脂肪球膜蛋白提取将过滤液中加入1M HCl调整PH至4.8，37℃室温搅拌1小时，离心90分钟，弃上清，将沉淀混选悬于50Mm NH4HCO3PH7.9，包含1Mm phMeSO2F(2ml/Lmilk)，按2∶1倍体积加入氯仿，离心后取上清加入0.2M NaCl缓冲液，40ml/100g蛋白，室温搅拌30分钟，离心80分钟，将沉淀混悬于100Mm Tris-HCl PH8.2，6M尿素，1M KCL，0.2M NaCl，phMeSO2F(10ml/100克蛋白)搅拌16小时(4℃)，离心70分钟。上清中即含有MFGM。
(4)粗提乳凝集素将提取的上清液用洗脱液透析过液，制备sepharys-200层析柱(3cm*115cm)，洗脱缓冲液洗柱过夜，轻轻将浓缩的MFCG覆于胶粒表面，重力使样本全部进入柱内，轻覆洗脱液于柱表面，连接收集系统，每管收集7ml，收集速度为0.3ml/min(约收集48小时)，每收集管各吸取20ul进行SDS-PAGE电泳，胶染色。隔日观察电泳条带(见图8)，收集乳凝集素含量较多，较纯的样本约50ml，待用于亲和层析。
(5)牛乳中乳凝集素的纯化制备agrose亲和层析系统，将透析过夜的样本全部通过层析柱，结合缓冲液洗柱1次，冲洗缓冲液洗柱1次，洗脱液洗脱，得到终产物乳凝集素。
(6)蛋白质电泳条带定性(见图9)。
整个制备过程1周。
两种方法所得目的蛋白定量分析(见图10)
表1
乳凝集素.SEQSEQUENCE LISTING<110>上海第二医科大学附属新华医院<120>一种乳凝集素功能肽以及制备方法<130>/<140>2005100241047<141>2005-07-19<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>引物<400>1gcgccatggg cctggatatc tgttccaaaa acccctgc38<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>引物<400>2
乳凝集素.SEQgcgctcgaga cagcccagca gctccaggc 29<210>3<211>1164<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc60ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag 120atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc 180tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac 240attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat 300tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc 360agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacttgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt 420gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg 480gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag 540gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg 600gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt 660gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc 720atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc 780agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg 840gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag gtggacctgg gctcctcgaa ggaggtgaca 900ggcatcatca cccagggggc ccgtaacttt ggctctgtcc agtttgtggc atcctacaag 960gttgcctaca gtaatgacag tgcgaactgg actgagtacc aggaccccag gactggcagc 1020agtaagatct tccctggcaa ctgggacaac cactcccaca agaagaactt gtttgagacg 1080cccatcctgg ctcgctatgt gcgcatcctg cctgtagcct ggcacaaccg catcgccctg 1140cgcctggagc tgctgggctg ttag 116权利要求
1.一种乳凝集素蛋白由下列方法制得(1)从组织中提取总RNA；(2)设计乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列制成乳凝集素功能肽基因；(3)构建乳凝集素功能肽重组质粒；(4)重组质粒转化；(5)乳凝集素功能肽表达；(6)乳凝集素功能肽纯化。
2.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于组织选自心、肺、肝、脾、胰腺、骨骼肌、胃、十二指肠、小肠、结肠、睾丸、膀胱、子宫混合物。
3.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列为MFGE5gcgccatgggcCTGGATATCTGTTCCAAAAACCCCTGCMFGE3gcgctcgagACAGCCCAGCAGCTCCAGGC。
4.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽重组质粒中质粒选自pET-28a、pET-28b。
5.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽重组质粒转入DH5αtm细胞内。
6.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽在BL-21感受态细胞表达。
7.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽利用镍螯合的亲和层析柱，结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液，洗脱得到纯化的目的蛋白。
8.根据权利要求1所述的乳凝集素功能肽的制备方法如下(1)从组织中提取总RNA；(2)设计乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列制成乳凝集素功能肽基因；(3)构建乳凝集素功能肽重组质粒；(4)重组质粒转化；(5)乳凝集素功能肽表达；(6)乳凝集素功能肽纯化。
9.根据权利要求8所述的乳凝集素蛋白的制备方法，其特征在于组织选自心、肺、肝、脾、胰腺、骨骼肌、胃、十二指肠、小肠、结肠、睾丸、膀胱、子宫混合组织，乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列为MFGE5gcgccatgggcCTGGATATCTGTTCCAAAAACCCCTGCMFGE3gcgctcgagACAGCCCAGCAGCTCCAGGC。
10.根据权利要求7所述的乳凝集素功能肽的制备方法，其特征在于乳凝集素功能肽重组质粒中质粒选自pET-28a、pET-28b，乳凝集素功能肽重组质粒转入DH5αtm细胞内，乳凝集素功能肽在BL-21感受态细胞表达。
全文摘要
本发明公开一种乳凝集素功能肽以及乳凝集素功能肽制备方法。本发明从人13种组织混合物中提取总RNA后作成cDNA第一链，做为模板钓取MGEF8基因中提取总RNA，应用RT－PCR技术及cDNA PCR制备出人乳凝集素功能肽的基因产物。本发明首次利用蛋白质工程的手段得到目的蛋白质；利用所采用方法得到的目的蛋白质具有可重复提取、足量、纯度高、无毒性、保留抗原性的特点；为目的蛋白质的进一步研究和应用提供了质与量的保证。
文档编号C07K14/435GK1699413SQ20051002410
公开日2005年11月23日 申请日期2005年2月28日 优先权日2005年2月28日
发明者何振娟, 裴新红, 吴圣楣, 朱建幸, 杨凌云 申请人:上海第二医科大学附属新华医院