一种液体Nisin防腐剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种液体Nisin防腐剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸链球菌素（肽），乳链菌肽（Nisin)，是由乳酸链球菌（Streptococcus lactis)或乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)部分菌株发酵产生的由34个氨基酸组成的 小分子多肽类化合物，分子量约为3510,它能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳细菌及 其孢子的生长，延长食品货架期，继1961年FA0/WH0批准Nisin作为食品添加剂使用后， 全世界已有50多个国家和地区批准其作为食品防腐剂。1990年，我国将其列入国家标准 GB2760-86,可以用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。由于Nisin容易被人体 消化道中的一些蛋白酶所降解，不会在人体内蓄积，是世界公认安全的天然防腐剂。
[0003] 长期以来，乳酸链球菌素生产过程中，面临的最大的问题是提取收率过低，由于 nisin是一种小分子多肽，在其提取过程中，条件控制不恰当会发生活性的丧失，常见的提 取方法有以下几种，①有机溶剂法，陈秀珠等利用正丙醇从氯化钠饱和的发酵液中提取2 次，利用丙酮沉淀得到nisin粗品，然后将粗制品溶于0. 05mol/L HAc-NaAc (pH3. 6)缓冲 液，并用缓冲液透析24h，离心分离再经CM-SephadexC-25柱层析，得到聚丙稀酰胺凝胶电 泳纯的乳链组分，活率回收仅为41. 7 %。②菌体吸附法，吴琼等和叶嗣颖等对nisin随pH 的改变吸附nisin的规律进行研宄，通过调整pH，使乳酸乳球菌选择性地吸附、释放nisin， 并达到了较好的效果，但是存在活性损失率偏高的问题。③膜分离法，Daoudi L等利用分 子截留量为1000道尔顿的中空纤维膜对经过离心处理除菌的发酵液进行超滤，最终浓缩 率达到5,收率达到74. 2%，膜分离法也存在一定的问题，如在操作中膜面会发生污染，使 膜性能降低。④盐析法，Daoudi L.等利用盐析法收集沉淀得到nisin粗制品，收率仅为 60%，而且盐析法由于大量使用硫酸铵、氯化钠等，废水中含盐量高，对环境造成严重的污 染。⑤泡沫分离技术是二十世纪开发的一种分离技术，1977年被引入生物分离领域，并用于 多种具有表面活性的蛋白质及酶的分离纯化，并在实验室阶段取得良好的分离效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有乳酸链球菌素生产过程中存在的提取收率较低，成本较 高，市场竞争力不足的问题，乳酸链球菌素发酵液（效价10000~14000IU/mL)经过预处理 后，进行陶瓷膜过滤除菌，除菌后清液经过泡沫分离方式进行浓缩，得到高效价的乳酸链球 菌素溶液，按照比例添加保护剂、稳定剂后，获得一种液体Nisin防腐剂。
[0005] 本发明解决技术问题所采取的技术方案是：
[0006] 一种液体Nisin防腐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：乳酸链球菌素发 酵液经过预处理后，进行陶瓷膜过滤除菌，除菌后清液经过泡沫分离方式进行浓缩，得到高 效价的乳酸链球菌素溶液，添加保护剂和稳定剂后，得到液体Nisin防腐剂（稳定性及瞬时 稳定性更好）；
[0007] 所述预处理前乳酸链球菌素发酵液效价10000~14000IU/mL ;
[0008] 所述高效价的乳酸链球菌素溶液效价lOOOOOIU/mL以上。
[0009] 进一步的，所述乳酸链球菌素发酵液的预处理为：调节发酵液pH到1. 5-3. 0,加热 〇.5-2h使乳酸链球菌素从菌体上分离下来后，进行陶瓷膜过滤除去菌体及大分子蛋白。
[0010] 进一步的，陶瓷膜截留分子量为5万-10万道尔顿。
[0011] 进一步的，除菌后的清液经过泡沫分离的方式进行浓缩，具体为在泡沫分离设备 内，通过不断通入气体进行吹泡，形成大量泡沫，使用泡沫收集装置收集泡沫后，进行消泡 处理，得到高效价的乳酸链球菌素液体溶液（利用通气鼓泡在发酵液中形成的气泡为载 体，对发酵液中的Nisin以泡沫形式与发酵液分离，再收集泡沫并消泡回收Nisin)。
[0012] 进一步的，通入泡沫分离装置的气体为空气、二氧化碳、氮气中的一种或者几种。
[0013] 进一步的，消泡的方式为物理消泡、化学消泡的一种或两种；
[0014] 所述化学消泡为添加聚醚类消泡、食用油类消泡的一种或两种。
[0015] 进一步的，所述保护剂为1-2 %的氯化钠、0.02-0. 8 %的蔗糖、0.01-0. 5 %的谷氨 酸钠、0. 05-0. 6 %的麦芽糊精；
[0016] 所述保护剂的添加量均以乳酸链球菌素溶液的重量为基准。
[0017] 进一步的，所述稳定剂为0. 01-1 %的山梨醇、0. 02-0. 6 %的微晶纤维素、 0. 0001-0. 0005%的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0. 0005-0. 001 %的吐温-20 ;
[0018] 所述稳定剂的添加量均以乳酸链球菌素溶液的重量为基准。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 本专利创新性的利用泡沫分离技术分离、纯化、浓缩除菌之后的乳酸链球菌素发 酵液，通过通入空气、二氧化碳、氮气中的一种或者几种组合的气体，收集泡沫后消泡处理， 得到高效价的Nisin溶液，原始发酵液效价一般为10000~14000IU/mL，经过鼓泡处理后得 到的高效价溶液一般为lOOOOOIU/mL以上，鼓泡浓缩过程收率达到95%以上，同时浓缩倍 数为8-10倍，而一般利用双效蒸发浓缩乳酸链球菌素，其收率只有70-85%。
[0021] 同时本专利又创新性的在高效价的Nisin溶液中加入保护剂和稳定剂，保护剂为 1-2 %的氯化钠、0. 02-0. 8 %的蔗糖、0. 01-0. 5 %的谷氨酸钠、0. 05-0. 6 %的麦芽糊精，稳定 剂为0. 01-1 %的山梨醇、0. 02-0. 6%的微晶纤维素、0. 0001-0. 0005%的聚氧乙烯聚丙烯甘 油醚、0. 0005-0. 001 %的吐温-20。加入保护剂、稳定剂之后，各成分协同增效，防腐效果远 高于单一的Nisin产品，由于是液态防腐剂，在食品中更容易混匀，渗透，对瞬时高温等的 处理不会发生效价的损失，同时，使得该液体防腐剂的储存时间能达到12月以上，不发生 效价的下降，不影响其在食品中的防腐效果。
[0022] 相比于粉状Nisin的产品，该液体防腐剂制备过程中减少盐析、喷雾干燥等过 程中乳酸链球菌素效价的损失，降低了成本，同时使用过程中直接将液体加入食品中即 可，不用经过溶解一步，GB2760规定食品中的最大使用量为0. 5g/kg，折合每kg食品需要 450000IU的Nisin，本发明的液态防腐剂效价为lOOOOOIU/mL以上，折合每kg食品添加量 为4. 5mL，不会影响食品固有的口感，而且使用更加方便，防腐效果更加突出。
[0023] 本发明创新性的开发出一种液态Nisin的防腐剂，防腐效果更加突出，使用更加 方便，同时克服了 Nisin在提取过程中的收率过低的困难，是一种极具有市场前景的防腐 剂产品。
【具体实施方式】
[0024] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。