专利名称：从万寿菊油树脂中分离提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法
技术领域：
本发明属于植物化学技术领域。具体涉及从万寿菊油树脂中分离、提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法。
背景技术：
类胡萝卜素是自然界中广泛存在的一类黄色到红色的物质。在不同的水果和蔬菜中，存在不同种类的类胡萝卜素，比如胡萝卜中的β-胡萝卜素，万寿菊花中的叶黄素，草莓中的玉米黄质，番茄中的番茄红素，辣椒类植物中的辣椒红色素和辣椒色素的含量都较高。而在一些深色水果和蔬菜、蛋黄、一些鱼类甲壳、鸟类、海藻和细菌中存在较多的类胡萝卜素，其中叶黄素类的含量也较高。
近年来的一些动物和人体试验表明了类胡萝卜素的有益功效。总体上类胡萝卜素可能分为两个亚类，即极性相对较强的叶黄素类或含氧类胡萝卜素类，如叶黄素、玉米黄质、虾青素等，以及非极性的碳氢类胡萝卜素类，比如β-胡萝卜素、番茄红素等。这两个亚类的类胡萝卜素中都包含着至少九个共轭双键，这些共轭双键不仅赋予了类胡萝卜素的颜色特征，也使其在疾病防治中具有较强的抗氧化功能，它们能阻止或预防像癌症、动脉硬化、白内障、色斑退化及其它类疾病。而且由于类胡萝卜素的清除高效活性氧自由基及防止自由基产生的能力，并能限制自由基的氧化破坏作用。
在所有的类胡萝卜素中，由于其具有潜在的预防一种与年龄相关的色斑退化疾病(ARMD)的能力，叶黄素和玉米黄质越来越引起科学家和公众的关注。叶黄素和玉米黄质是唯一存在于人类视网膜中斑点区域的类胡萝卜素，而此区域与人的视觉敏锐性密切相关(Bone et al.Invest.Ophthamal.Vis.Sci.342033-2040，1993)。经常食用富含叶黄素和玉米黄质的水果和蔬菜能使患老年色斑退化疾病的风险减少43％(Seddon etal.J.Am.Med.Assoc.2721413-1420，1994)，而且，目前这些化合物在预防老年色斑退化疾病上的代谢途径已经明了。美国FDA也认为叶黄素和玉米黄质“一般认为安全”(GARS)。因此，这些类胡萝卜素类能单独或与其它物质一起作为营养补充剂和食品着色剂使用，也可应用于临床预防老年色斑退化和癌症等。
许多蔬菜和水果，比如菠菜、椰菜、甘蓝和玉米等，含有较多的叶黄素，但万寿菊花和金盏花是叶黄素最丰富来源，当然，这些植物中还存在其它类类胡萝卜素。而且，植物中的叶黄素类往往是与一些C12-C18长链脂肪酸如肉豆蔻酸、油酸、亚油酸和棕榈酸等酯化形成单酯或双酯的形式存在。这些天然存在的叶黄素酯具有良好的稳定性和生物利用度，可广泛地应用于膳食补充剂、食品添加剂及着色剂等，而且，相对于游离叶黄素类晶体，叶黄素酯还有较好的脂溶性，这样其就有更为广泛的应用形式。
目前，也有多种以万寿菊油树脂为原料提取叶黄素酯的方法或专利。
US4,048,203描述的方法包括溶解万寿菊油树脂于含有不超过4个碳原子的热烷醇中，通过冷却溶液沉淀出叶黄素脂肪酸酯，过滤除去烷醇后再真空干燥。但此法得到的叶黄素脂肪酸浓缩物的含量中只有51％，没有达到高含量要求。
CN1,120,565A中用石油醚提取处理过的万寿菊得到部分皂化的油树脂，但得到的产品的纯度仅为12.0％左右，且收率低。
US6,191,293中通过用烃类溶剂浸提万寿菊花，再用醇沉得到的浸膏，但用这种方法得到的含油树脂中叶黄素脂肪酸酯的纯度因原料质量的不同而变化较大，在工业化生产中难以控制。
CN1,432,567A揭示了先用丙酮浸提叶黄素油树脂，再用丁醇或异丙醇等结晶丙酮的浓缩母液，从而得到含量较高的叶黄素脂肪酸酯浓缩物，但此方法一方面收率不高，另一方面由于用到沸点较高的丁醇等，这样产品中的溶济残留很难达到食品应用上的要求，这样的产品应用于食品配料中会带来安全上的问题，而且产品中叶黄素脂肪酸酯的顺反异构体的比例受原料的影响较大，如原料中顺式叶黄素含量高，则产品的生物活性会受到影响。
US6,737,535B2中运用酮类试剂去除叶黄素油树脂中杂质，得到的产品中全反式异构体含量较高，但其中类胡萝卜素含量只有60％左右，收率也只有30％，明显偏低，这样的工艺也不适于大规模工业化生产，而且仅60％纯度的产品应用于食品配料或保健食品中会带来太多的未知杂质，有一定的安全风险。
因而，上述方法存在以下缺点，例如产品的收率不高，纯度也不够；产品的品质，特别是叶黄素顺反式异构体的比例在生产过程中未经处理，从而受原料的影响较大，对工业生产不利；方法中使用的有机溶剂沸点较高，在后续处理时难以完全去除，有较高的溶剂残留，难于应用于工业化生产。
因此，有必要寻找新的工艺路线来提纯高含量叶黄素酯。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种叶黄素脂肪酸酯含量高，产品收率高，有机溶剂残留低，而且工艺稳定，易于工业化规模生产的方法。
本发明提供了一种从含有叶黄素脂肪酸二酯的万寿菊油树酯中提取叶黄素酯的方法。
本发明的方法为先将万寿菊油树脂与一定量的正己烷和醇类组成的混合溶剂混和形成均一溶液，溶解分散一定时间后，降温结晶；将过滤后得到的滤饼再用一定量的正己烷回流溶解，降温结晶后分离得到不溶性滤饼；将此滤饼真空干燥后即可得到叶黄素酯含量达80％以上的产品，其中全反式叶黄素脂肪酸酯含量在90％以上，叶黄素酯收率70％左右。
本发明的基本工艺流程如下a)将万寿菊油树脂与一定量的正己烷和醇类组成的混合溶剂混和回流溶解，再降温结晶；b)用常规方法分离得到的结晶，这样就去除了原料万寿菊油树脂中醇溶性杂质；c)将得到的结晶溶解于一定量正己烷溶剂中，再降温结晶，并用常规方法分离得到的结晶；d)将c)中得到的结晶通过真空干燥去除带入的溶剂，直到其溶剂残留达到食品级上可接受的范围。
本发明方法可通过下面作进一步具体描述。
在本发明中，在40℃到85℃范围内，万寿菊油树脂溶解于食用级醇类和正己烷组成的混合溶剂中形成均一溶液，一般一份重量的油树脂溶解于1.0-15份体积的混合溶剂中，混合溶剂中食用级醇类所占的比例为10-70％，正己烷所占比例为90-30％。通过搅拌足够长时间，一般为1.0-5.0小时后，叶黄素脂肪酸酯及其它类杂质如蜡、树脂、其它类胡萝卜素和色素就溶解或分散于此溶剂中形成一种均一的溶液。
将上述均一溶液缓慢降温到10-40℃下重结晶，通过离心、压滤或抽滤等常规分离方法，将结晶与母液分离，这样醇溶性杂质就被转移到母液中去，固形物中的叶黄素脂肪酸酯得到了进一步提纯。而且，由于油树脂在含醇类溶剂中溶解分散了足够长时间，有利于产品中全反式叶黄素脂肪酸酯异构体含量的提高，如原料万寿菊油树脂中全反式叶黄素酯含量不够高，足够长时间的醇溶处理可使部份顺式叶黄素酯异构体向反式异构体的转变，提高终产品中叶黄素脂肪酸酯的生物活性。此步反应中用到的醇可为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，优选食用级乙醇。
通过这两步的处理，得到的中间体中叶黄素脂肪酸酯含量可达70％左右(重量百分比)，其中全反式异构体比例占90％以上，玉米黄质脂肪酸酯含量为5％左右，其余为少量顺式异构体及其它类胡萝卜素类。
依据本发明的方法将上述得到的结晶再溶解于一定量正己烷中，在50℃到85℃下回流搅拌1-2hr，使其充分分散，往往一份重量的固形物溶解于0.5-10倍体积，优选2-6倍体积的的正己烷中。
然后缓慢冷却混和溶液至0-20℃左右，优选冷却至3-10℃，通常冷却时间为2-5hr，在冷却过程中，可从水、甲醇、乙醇及其混和物组成的溶剂组中选择一种或多种溶剂加入到上述混和溶液中，优选在搅拌时加入，加入上述溶剂可使不溶性固体物快速沉淀，从而提高操作效率，并可提高终产品的收率。此处甲醇的加入量约相当于用到正己烷量的0.1-3体积份，优选0.5-2体积份用量；乙醇的加入量相当于用到正己烷量的0.1-3体积份，优选0.8-2体积份用量；水的加入量相当于用到正己烷量的0.01-2体积份，优选0.01-1体积份用量。
在此操作步骤中加入的甲醇、乙醇、水或其组合物的温度可能为室温，但优选加入与冷却溶液相同的温度，且溶剂加入的速度没有严格意义上的要求。
将上述冷却到设定温度的混和物在此温度下保持0.5-2.0小时，优选1.0-1.5小时，并保持慢速搅拌，最后用常规分离方法如甩滤、压滤或抽滤等操作将混和溶剂与不溶于混和溶剂的固体物分离，将母液中混和溶剂回收后弃去溶于其中的杂质成份。
得到的固体物在真空烘箱中干燥，以移去残存于固体上的混和溶剂，干燥时温度为20-55℃，优选40-50℃，使用到的真空度为-0.06-0.095MPa，优选-0.090-0.095MPa，一直干燥至产品中不能检测到正己烷溶剂残留为止。
依据本发明揭示的方法，得到的叶黄素脂肪酸酯浓缩物为一种黄色至浅褐色固体，其中叶黄素脂肪酸酯的纯度不低于70％，但通常可获得高于80％的纯度。通过高效液相色谱分析可知，其中包括90-95％的全反式叶黄素酯，0.1-1.0％其几何异构体，2.0-7.0％全反式玉米黄质及少于1.0％的其它类胡萝卜素类，这些微量的其它类胡萝卜素也是膳食来源，不影响食用安全。而且，叶黄素脂肪酸酯的收率可达70％左右，远远高于现有方法得到的结果。更为重要的是，由于工艺过程中用的有机溶剂的沸点都在80℃以下，易于被除去，有机溶剂的残留很低，完全能满足食品工业上的安全要求，得到的叶黄素脂肪酸酯具有鲜亮的色泽，可应用于食品着色剂，也可通过微囊化制成干粉，添加于膳食补充剂中。
本发明优点体现在以下几个方面①生产过程中使用到的有机溶剂为食用级无水乙醇及正己烷，溶剂沸点低，易在真空干燥过程中去除，溶剂残留低，产品可安全地应用于食品添加剂、膳食补充剂和着色剂；②最终产品中叶黄素酯含量达80％，其它天然杂质少，叶黄素收率70％左右；③产品包含的类胡萝卜素中全反式叶黄素酯含量达90％以上，顺式异构体含量5％左右，其余为少量玉米黄质酯和其它类胡萝卜素类，产品的生物活性高；④工艺的操作简单，易于大规模工业化生产。这些优点使得本发明与以前的相关发明有许多对比优势，本发明提供的方法过程是很经济的，并适于大规模工业化生产，这些及其它一些优点在随后的发明叙述中会得到很好的体现。
本发明涉及到从自然资源如万寿菊花、椰菜、甘蓝、菠菜和玉米中分离和纯化叶黄素脂肪酸酯的方法。在这些原料中，万寿菊花提取的油树脂中叶黄素酯类含量相对较高，是一种优先考虑的原料。
在本发明中，通过正己烷萃取到的食用级万寿菊油树脂作为分离全反式叶黄素酯含量较高的产品的起始原料。基于品种、种植条件、收割时期及提取方法的不同，此油树脂中含有5-30％的叶黄素脂肪酸酯和少量的其它类胡萝卜素如全反式玉米黄质、α-和β-隐黄质以及β-胡萝卜素等。但本方法不受万寿菊油树脂质量尤其是叶黄素脂肪酸酯含量变化的影响。
具体实施例方式实施例11000g万寿菊油树脂(总叶黄素脂肪酸酯含量为31.8％)与5000ml食用级无水乙醇和3000ml正己烷组成的混合溶剂混合，升温至80℃下回流搅拌，直至形成均一溶液，在此温度下保温3hr，随后在2.5小时内将溶液温度缓慢降至25℃，保温结晶，用离心机甩滤分离得到的结晶，得到的中间体质量为401g，经UV检测，此结晶固体中叶黄素脂肪酸酯含量为71％(重量百分比含量)。取样品皂解后经HPLC检测，其中全反式叶黄素占92％，玉米黄质占7％，其余为少量的顺式异构体和少量其它类胡萝卜素类。
将得到的400.0g中间体结晶与1000ml正己烷混和，并在搅拌状态下升温至70℃下回流2.0小时后，缓慢降温至10℃结晶，在降温过程中缓慢加入80ml无水乙醇，抽滤分离得到的固体不溶物，在抽滤过程中用无水乙醇淋洗三次，每次食用级无水乙醇用量为100ml。
用真空烘箱干燥得到的固体不溶物，干燥温度为50℃，真空度为-0.095MPa。在干燥过程中用顶空气相色谱法监测产品中溶剂残留，直至正己烷不能检出为止，最后得干燥产品276.0g，用UV检测其中叶黄素脂肪酸酯含量为82.1％，取样品经皂解后用HPLC分析知其中全反式叶黄素占92.5％，玉米黄质占7.0％，其余为少量的顺式异构体和少量的其它类胡萝卜素类。总叶黄素脂肪酸酯的收率为71.2％.
产品中不含有毒的有机溶剂，适合于以营养补充剂和食品添加剂的形式使用。此结晶的应用形式可为油悬液(与植物油混合乳化)、珠粒(通过喷雾冷凝得到的微胶囊)、干粉(通过喷雾干燥得到的微胶囊)等。
实施例21000g万寿菊油树脂(总叶黄素脂肪酸酯含量为22.7％，其中全反式叶黄素比例为72.7％)与5600ml食用级无水乙醇和2000ml正己烷组成的混合溶剂混合，升温至80℃下回流搅拌，直至形成均一溶液，在此温度下保温5.0hr，随后在2.0小时内将溶液温度缓慢降至30℃，保温结晶，用压滤方法分离得到的结晶，得到的中间体质量为392.5g，经UV检测，此结晶固体中叶黄素脂肪酸酯含量为68.5％(重量百分比含量)。取样品皂解后经HPLC检测，其中全反式叶黄素占90.5％，玉米黄质占8.3％，其余为少量的顺式异构体和少量其它类胡萝卜素类。
将得到的390.0g中间体结晶与1500ml正己烷混和，并在搅拌状态下升温至70℃下回流2.0小时后，缓慢降温至15℃结晶，在降温过程中缓慢加入60ml温度为10℃的去离子水，抽滤分离得到的固体不溶物，在抽滤过程中用无水乙醇淋洗三次，每次食用级无水乙醇用量为100ml。
用真空烘箱干燥得到的固体不溶物，干燥温度为50℃，真空度为-0.095MPa。在干燥过程中用顶空气相色谱监测产品中溶剂残留，直至正己烷不能检出为止，最后得干燥产品195.0g，用UV检测其中叶黄素脂肪酸酯含量为79.6％，取样品经皂解后用HPLC分析知其中全反式叶黄素占91.5％，玉米黄质占8.1％，其余为少量的顺式异构体和少量的其它类胡萝卜素类。总叶黄素脂肪酸酯的收率为68.4％。
权利要求
1.一种从万寿菊油树脂中分离提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)在40℃～85℃条件下，万寿菊油树脂溶解于食用级醇和正己烷组成的混合溶剂中，搅拌1.0～5.0小时，形成均一的溶液；(2)步骤(1)得到的溶液于10℃～40℃下缓慢搅拌使其重结晶，得到固体结晶为初步纯化的叶黄素脂肪酸酯；(3)步骤(2)的重结晶固体溶于正己烷中，50℃～85℃回流搅拌1～2小时；(4)步骤(3)得到的正己烷溶液逐步冷却至0～20℃，并在逐步冷却过程中，边搅拌边加入水或醇或水和醇的混合溶液，析出沉淀后继续保持0.5～2.0小时，分离除去溶剂后，得固体沉淀物；(5)步骤(4)的固体于20～55℃，-0.090～0.095MPa真空干燥，除去溶剂，得到高含量叶黄素脂肪酸酯。
2.根据权利要求1所述的一种从万寿菊油树脂中分离提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法，其特征在于其中所述步骤(1)所述的万寿菊油树脂与食用级醇和正己烷混合溶剂的体积比为1∶1.0～15；混合溶剂中食用级醇所占比例为10～70％，正己烷为90～30％；食用级醇为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
3.根据权利要求1所述的一种从万寿菊油树脂中分离提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法，其特征在于其中所述步骤(3)固体与正己烷的体积比为1∶0.5～10。
4.根据权利要求1所述的一种从万寿菊油树脂中分离提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法，其特征在于其中所述步骤(4)向正己烷溶液中添加的溶液为水、乙醇或甲醇中的一种或多种组成的混合溶剂，正己烷与它们加入量的体积比为∶甲醇∶0.1～3；乙醇∶0.1～3；水0.01～2。
5.根据权利要求1所述的高含量叶黄素脂肪酸酯可作食品添加剂，膳食补充剂或着色剂。
全文摘要
本发明公开了一种从万寿菊油树脂中分离提纯高含量叶黄素脂肪酸酯的方法。用本发明方法得到的叶黄素脂肪酸酯含量为70～80％，其中全反式叶黄素酯达90～95％。本发明方法溶剂残留低，收率高，操作简便，宜于规模化的工业生产。
文档编号C07C403/00GK1872839SQ20061002661
公开日2006年12月6日 申请日期2006年5月17日 优先权日2006年5月17日
发明者许新德, 陈伯秋, 周迪, 叶双明, 黄生聪, 邵斌 申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂