专利名称：一种制备山荷叶素的方法
技术领域：
本发明属于中药有效活性成分提取制备领域，涉及一种制备山荷叶素的方法。
背景技术：
山荷叶素(diphyllin)是近期所发现的具有抗肿瘤活性的新结构的天然产物，分子式=C21H16O7,分子量380. 353，属于4-苯代-2，3-萘内酯类。主要从爵床科、小檗科、芸香科等多种植物中提取分离得到。药理研究表明，Diphyllin具有较好的抗肿瘤活性，对于人鼻咽癌细胞(KB)的Ε050<3μπιΟ1/ιΛ。研究发现Diphyllin类化合物能够作用于细胞分裂周期的S期，Gl期，使细胞分裂停留在Gl期，对于S期有很强的抑制作用。实验证明，用于 HCTl 16细胞时，在24小时内，能够使S期的细胞的比率从70%下降到41 %，而使Gl期细胞所占比重由21%增加到42%，对MCF-7细胞也有类似的结果。Diphyllin类化合物具有广泛的生理活性，已引起许多药学家、化学家的广泛关注。国内有关制备山荷叶素的方法报道较少，张永利采用醇提、溶剂萃取及各种柱色谱反复分离纯化得到各单体成分，操作繁琐、样品损失严重，不适合工业生产制备。中国专利(申请号201010535341.0)公开了一种乙醇热回流、乙酸乙酯-水混合溶剂多级逆流萃取、大孔树脂柱层析、丙酮结晶的方法制备山荷叶素，该方法萃取率低、工艺不稳定。现有技术中，尚无采用高速逆流色谱法分离纯化山荷叶素的工艺报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用凝胶柱色谱和高速逆流色谱技术结合的方法分离制备山荷叶素，该方法制备量大、生产周期短、工艺稳定、溶剂消耗少、产品纯度高。为达到上述目的，本发明采用下列技术方案
取南方山荷叶或爵床的醇提物用95%乙醇溶解后上凝胶柱层析，收集含山荷叶素的流分，回收溶剂得山荷叶素粗提物，将山荷叶素粗提物用高速逆流色谱进行进一步分离纯化， 最终得到高纯度的山荷叶素单体成分。所述南方山荷叶或爵床的醇提物是以乙醇或甲醇为溶媒，采用加热回流、超声、微波等常用的现有技术提取得到的醇提物。所述凝胶柱层析洗脱条件为二氯甲烷-甲醇10:1-2:1梯度洗脱。高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃_脂肪酸酯_脂肪醇_水组成的溶剂体系， 其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚，脂肪酸值是乙酸乙酯，脂肪醇是甲醇或乙醇，其配比为 1 :(0· 4-0.9) 1 (0. 4-0. 9)，以下相为流动相。采用本发明方法制备山荷叶素，制备量大、生产周期短、工艺稳定、溶剂消耗少、产品纯度高。下面将结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施例方式实施例1:
取南方山荷叶醇提物用95%乙醇溶解，上S印hadex LH-20凝胶柱层析，并用二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷-甲醇体积比分别为10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水按体积比1:0. 5:1:0. 7置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以SOOrpm转动，同时将流动相以2. 3ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后， 将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215nm波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为 97. 5%ο实施例2:
取南方山荷叶醇提物用95%乙醇溶解，上S印hadex LH-20凝胶柱层析，并用二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷-甲醇体积比分别为10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水按体积比1:0. 7:1:0. 7置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以SOOrpm转动，同时将流动相以1. 8ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后， 将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215nm波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为 97. 7%ο实施例3:
取南方山荷叶醇提物用95%乙醇溶解，上S印hadex LH-20凝胶柱层析，并用二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷-甲醇体积比分别为10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正庚烷_乙酸乙酯_乙醇_水按体积比1:0. 6:1:0. 9置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以850rpm转动，同时将流动相以2. 5ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后， 将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215nm波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为 97. 3%ο实施例4:
取南方山荷叶醇提物用95%乙醇溶解，上S印hadex LH-20凝胶柱层析，并用二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷-甲醇体积比分别为10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按体积比1:0. 4:1:0. 4置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以850rpm转动，同时将流动相以3. Oml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后， 将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215nm波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为 97. 4%ο 实施例5:
取南方山荷叶醇提物用95%乙醇溶解，上S印hadex LH-20凝胶柱层析，并用二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷-甲醇体积比分别为10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水按体积比1:0. 8:1:0. 8置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以SOOrpm转动，同时将流动相以2. 2ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后， 将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215nm波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为 97. 2%ο
权利要求
1.一种制备山荷叶素的方法，其特征在于包括以下步骤取南方山荷叶或爵床的醇提物用95%乙醇溶解后上凝胶柱层析，收集含山荷叶素的流分，回收溶剂得山荷叶素粗提物， 将山荷叶素粗提物用高速逆流色谱进行进一步分离纯化，最终得到高纯度的山荷叶素单体成分。
2.根据权利要求1所述的一种制备山荷叶素的方法，其特征在于所述南方山荷叶或爵床的醇提物是以乙醇或甲醇为溶媒，采用加热回流、超声、微波等常用的现有技术提取得到的醇提物。
3.根据权利要求1所述的一种制备山荷叶素的方法，其特征在于所述凝胶柱层析洗脱条件为二氯甲烷-甲醇10:1-2:1梯度洗脱。
4.根据权利要求1所述的一种制备山荷叶素的方法，其特征在于高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成的溶剂体系，其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚，脂肪酸值是乙酸乙酯，脂肪醇是甲醇或乙醇，其配比为1 :(0. 4-0.9) 1 (0. 4-0. 9)，以下相为流动相。
全文摘要
本发明公开了一种制备山荷叶素的方法。采用凝胶柱层析和高速逆流色谱法相结合，从南方山荷叶或爵床的醇提物中分离制备山荷叶素。该方法得到的山荷叶素含量可达97%以上，具有制备量大、溶剂消耗少、产品纯度高、生产周期短等特点。
文档编号C07D407/04GK102304123SQ20111018792
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者刘东锋, 郭琴 申请人:南京泽朗医药科技有限公司